脐带血清在骨髓造血祖细胞培养中的效应
作者：黄友章 罗晖 杨平地 沈建良
单位：海军总医院血液科，北京 100037
关键词：脐带血清；骨髓；造血祖细胞
中国应用生理学杂志000118 摘要 目的：探讨人脐带血清(CBS)在骨髓造血祖细胞培养中的效应。方法：用人骨髓细胞进行CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM培养。结果：CBS能直接刺激 骨髓细胞CFU-GM的形成。与血型相同否无关。四人份以上的混合CBS(MCBS)，刺激活性高且 稳定。10%MCBS相当于65.6 μg/L GM-CSF、0.23、0.3、0.46kU/L EpO对CFU-GM 、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM所起的作用。MCBS可提高CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CF U-GEMM常规体系的集落产率。在CFU-GM培养时，20%MCBS与100 μg/L GM-CSF和 20%马血清具有相同的效果。MCBS可直接刺激CFU-E形成。如培养体系内无B pA存在时，形 成BFU-E、CFU-GEMM较少或几乎为零，当含BpA时，可形成一定量的BFU-E、CFU-GEM M集落。结论：CBS(MCBS)内：①含有GM-CSF、Epo等物质或因素；②具有刺激CFU-GM、 CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM的生长活性；③同血型或不同血型4人份以上混合，刺激活性高 且稳定。具有良好的应用前景。
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中图分类号： R331.1-33文献标识码：A 文章编号：1000-6834(2000)01-0068-04
EFFECTS OF CORD BLOOD SERUM ON COLONY CULTURE OF BONE MARROW HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS
HUANG You-zhang, LUO Hui, YANG Ping-di, SHEN Jian-liang
(Department of Hematology, General Hospital of Navy, Beijing 10003)
ABSTRACT
Aim: To provide experimental proofs for Cord Blood clinical appliance, t he effects of human CBS (Cord Blood Serum) on colony culture of bone marrow hema topoietic progenitor cells were studied. Methods: Observed the colony forming capacity of CFU-GM，CFU-E，BFU-E，CFU-GEMM when they were c ultivated using hBMNC with CBS, Mixed Cord Blood Serum (MCBS) and/or cytokines. Resutts: 10% CBS could promote the forming of CFU-GM of BMC dir ectly, no matter what blood group the CBS or BMC were of. If four or more copies of CBS were mixed (MCBS), no matter whether the “ABO” blood groups between t hem were same or not, they could produce more CFU-GM than single copy or two-copi es-mixed CBS when used, and their activity was stable. MCBS could increase the production of CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM in routine culture system, and 10%MCBS corresponds with 65.6 μg/L GM-CSF，0.23，0. 3，0.46 kU/L Epo to CFU-G M ，CFU-E，BFU-E，CFU-GEMM respectively. When used in colony culture of CFU-GM ,20% MCBS has the same effect as 100 μg/L GM-CSF with 20% HS. 20% MCBS could a lso directly promote the forming of CFU-E. It formed few or none BFU-E and CFU -GEMM without BpA and some BFU-E and CFU-GEMM when with BpA. Conclusion : ①SC BS (MCBS) contains such substances as GM-CSF, EPO, and so on. ②There exists so me activities which can promote the forming of CFU-GM, CFU-E, BFU-E, CFU-GEM M in CBS (MCBS). ③These activities would be stronger and more stable if four or more copies of any blood-group CBS were mixed. It may be a fine prospects of c linical appliance.
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KEY WORDS: cord blood serum; bone marrow; hematop oietic progenitor cells
脐带血(CB)中除含有较丰富的造血细胞外，不少学者认为还含有多种造血细胞因子(CK) 及白细胞介素，因研究方法不同，各家有关研究报告结果间存在一定差异[1]。本 研究旨在体外观察人脐带血清(CBS)对人骨髓造血祖细胞集落形成效应，试图为脐血应用进 一步提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 CBS和混合CBS(MCBS)： 收集CB，鉴定“ABO”血型(每种血型 各收集10人份，共40份)，室温下1 h, 4℃下3 h，1000 g离心20 min，取血清，-20℃ 冷冻 ，24 h后4℃融化，2000 g离心20 min,去冷沉淀，经0.22 μm滤膜过滤除菌，用多人份等 体积混合者为MCBS，MCBS有两种类型：一为同血型血清的混合，一为不同血型血清的混 合，每种又有二、四、八人份血清混合的不同；单人份者与同型二人份混合者称A组；同型 之四、八人份混合，不同型混合(共四组，每组为4种不同血型血清各1、2、4、8人份的混合 )称B组。分装，-20℃保存备用。
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1.1.2 骨髓细胞(BMC) 胸外科手术取得的无血液病病人的肋骨骨髓(BM )，经淋巴细胞分层液分离，制备20%马血清(HS)IMDM骨髓单个核细胞悬液(BMNC) 。
1.1.3 CK GM-CSF(麒麟公司)；Epo(安进公司)；BpA(自制PHA淋巴细胞条件培养液) 。1.2 造血祖细胞培养[2]
取BMNC按1×105/ml浓度，进行粒单系造血祖细胞培养(CFU-GM)，基础培养体系(BMS)为 1640、0.3%琼脂；红系造血祖细胞(CFU-E、BFU-E)和混合造血祖细胞培养(CFU-GE MM)，三者BMS为IMDM、0.25%甲基纤维素、10-5Mα-巯基乙醇。计集落数(CFU)， 每例组作3份BMC培养，CFU取均值。实验分组：常规体系[2]为对照(C)，CBS效应(T 1)，MCBS效应(T2)，MCBS浓度效应(T3)，GM-CSF浓度效应(T4)，Epo浓度效应(T5)，MCBS和 CK联合效应(T6)，替代效应(T7)，B pA效应(T8)，各组成分见表1。
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1.3 统计学处理
结果用均值±标准差(
±s)表示，组间差异用t检验。
2 结果
2.1 单人份CBS对CFU-GM的效应
10%CBS替代常规体系的GM-CSF为T1，C和T1的CFU分别为197.0±33.0、107.4±45 .2，表明每份单人份CBS中含有较高CFU-GM生长活性，但10%CBS低于100 μg/L GM-CSF 者(P<0.01)。
Tab.1 Culture system of various group
C
, 百拇医药
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
BMS
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
20%HS
+
+
+
+
+
+
+
-
-
, 百拇医药
GM-CSF(ng/ml)
▲100
-
-
-
▲25-150
-
▲100
-
-
10CBS(V/V)
-
▲
, 百拇医药
-
-
-
-
-
-
-
MCBS(%，V/V)
-
-
+10
+5-30
-
-
, 百拇医药
+10
+20
+20
Epo(U/ml)
●2
-
-
-
-
●0.5-3
●2
-
-
, 百拇医药 10%BpA(V/V)
○
-
-
-
-
○
○
○
-
▲Added only in the culture of CFU-GM； ●Ad ded only in the culture of CFU-E，BFU-E，CEMM； ○Added only in the colture of BFU-E，CFU-CEMM
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2.2 CBS对骨髓CFU-GM血型效应
取四种血型CBS与四种血型BMC相互交叉配对，实验体系为T1(表2)。Tab.2 Effects of blood group of CBS an d BMC onCFU-GM(CFU/105BMNC，±s，n=10) CBS
blood
group
BMC blood group
A
B
AB
, 百拇医药
O
]A
93.8±15.1
96.3±19.5
68.4±14.0
82 .0±7.9
B
101.2±18.5
99.5±17.1
80.8±14.0
78.6±8.7
AB
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100.0±l5.5
94.5±27.6
77.1±16.0
77.2±9.5
O
87.4±15.8
96.5±17.4
62.6±9.6
83.0±7.7
结果提示：任一CBS可刺激任一骨髓细胞CFU-GM生长；彼此有一定差异，无严格规律可寻。
2.3 不同MCBS对CFU-GM的效应
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实验体系为T2，CFU结果是：A组的单人份者与同型二人份混合者相比无显著差异；B组的同 型之四、八人份混合，不同型混合，任何一组之间也无显著差异。分析它们的均值发现：A 组为108.5±41.1，B组为127.0±30.4，B组比A组的CFU均值增高(18.5%，P<0.00 1)。提示不论血型是否相同，只要四人份以上CBS混合比单人份或二人份混合对CFU-GM的 生长刺激要好，且稳定。
2.4 不同浓度MCBS与GM-CSF或Epo对骨髓造血祖细胞的效应比较
用不同浓度MCBS(四种血型CBS各八人份等量混合，下同此。T3)与GM-CSF(T4)或Epo(T5)加 入培养体系，比较CFU(图1-4)。
体系内不加GM-CSF(CFU-GM培养)或Epo(CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM培养)或MCB S时无CFU形成；加入它们时，则形成CFU，且随着浓度的升高CFU也增多，有良好的剂量 与产量关系。10%MCBS大致相当于65.6 μg/L GM-CSF所形成的CFU-GM(129 .6±24.1/197.6±43.6)、 0.23 kU/L Epo所形成的CFU-E、(13.4±2.6/59 .2±10.1)、0.3kU/L Epo所形成的BFU-E(9.8±3.2/32.6±8.2)、0.46 ku/LEp o 所形成的CFU-GEMM(3.8±1.3/8.2±1.3)。
, 百拇医药
Fig.1 Effect of concentration of MCBS(%) and GM-CSF(μg/L) on CFU-GM(±s,n=10)
Fig.2 Effect of concentration of MCBS(%) and Epo(kU/L) on CFU-E(±s,n=10)
Fig.3 Effect of concentration of MCBS(%) and Epo(kU/L) on BFU-E(±s,n=10)
, 百拇医药
2.5 MCBS与GM-CSF或Epo对骨髓造血祖细胞的联合效应(表 3)
提示MCBS可增强GM-CSF对CFU-GM、Epo对CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM的生长，分别提高1.3倍、1.25倍、1.22倍与1.46倍。
Fig.4 Effect of concentration of MCBS(%) and Epo(kU/L) on CFU-CEMM(±s,n=10)
Tab.3 The synergism of MCBS and GM-CSF or EPO in culture
of BM progenitor cells (CFU/105BMNC，±s=10) Group
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]CFU-GM
CFU-E
BFU-E
CFU-GEMM
C
197±33
109.2±19.5
45.6±11.3
9.6±1.9
T2
129±24
13.4±3.6
, 百拇医药
9.8±3.2
3.8±1.3
T6
258±51* *
136.0±37.8* * *
55.4±9.6 * * *
14.0±1.4* * *
* * P<0.01,* * * P <0.001, vs C
2.6 MCBS替代骨髓造血祖细胞培养中的CK与HS效应(表4)
, 百拇医药
Tab.4 The substitution of MCBS for cytokines and HS
in culture of BMC (CFU/105BMNC,±s，n＝10) Group
CFU-GM
CFU-E
BFU-E
CFU-GEMM
C
197±33
109.2±19.5
, 百拇医药
45.6±11.3
9.6±1.9
T7
189±24
22.0±7.2* * *
12.0±1.0* * *
3.8±1.2* * *
T8
-
-
1.2±1.6* * *
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0)F]
* * * P<0.001, vs C
结果显示：在CFU-GM培养时，20%MCBS可取代常规体系中的10 μg/L GM-CSF与20% HS进行CFU-GM培养，达到同样效果。在CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM培养时，20%MCBS不能 取代CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM常规体系；且MCBS的BFU-E、CFU-GEMM培养生长活性只有 BpA存在时，才能体现，也表示BpA活性低。
3 讨论
CFU-GM的增殖分化需要GM-CSF或G-CSF等的参与。本文证实单人份CBS含有能直接刺 激CFU-GM生长的活性，但单人CBS培养结果的标准差波动较大，变异系数为42%(对照组为1 6.8%)，说明个体间差异性较大。
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伍钢等[3]认为，当脐血血浆与骨髓细胞血型相同时，CFU产率不增加，两者 血型不同时CFU产率增加明显。有学者[1]认为脐血血浆仅刺激脐血造血祖细胞的增 殖，而对骨髓来源的造血祖细胞无影响。本研究中取4种血型的CBS与骨髓细胞相互交叉 配对培养，结果为任何血型的CBS均对任何血型的骨髓细胞CFU-GM的生长有刺激作用，彼 此间在刺激强度上有一定差异，是否确实如此，尚需更多的证明。
同血型四人份或不同血型的4种CBS各一人份以上等量混合的MCBS，其刺激活性比同型 单人份或双人份混合者明显增高，活性也稳定，可能是由于更多来源的混合能使其活性得以 平衡及相互制约了其中的抑制因素有关。
就CFU-GM培养而言10%MCBS相当于65.6 μg/L GM-CSF所起的刺激作用，20%M CBS加基础培养基，可取代100 μg/L GM-CSF、20%HS加基础培养基进行CFU-GM培养。
, 百拇医药
MCBS可提高GM-CSF作用下的CFU-GM产率，根据分析，这种作用是协同作用，这是否 说明GM-CSF与MCBS对CFU-GM的刺激作用在不同的细胞水平上，或MCBS的成分多样性所作用 的结果。
体外红系造血祖细胞培养包括CFU-E、BFU-E两种，CFU-E生长需要Epo，BFU-E生长则需要Epo和BpA，Epo的作用和性质己较明确，BpA为经PHA刺激淋巴细胞分泌的混合因子条 件液，为爆式集落活性，其作用和性质并未完全清楚。脐血中含有一定量的刺激红系造血祖 细胞生长的活性，在CFU-E、BFU-E培养时，10%MCBS分别相当于0.23 kU/L与0.3 kU/ L Epo的作用；并提高培养中的CFU产率，对CFU-E、BFU-E的生长起着协同作用，但BpA 活性很低，20%MCBS不能取代CFU-E常规体系的20% HS、2 kU/L Epo的作用，也不能取代 BFU-E常规体系的20%HS、ZKU/L、EPO、10%BpA的作用。
CFU-GEMM的形成需Epo和BpA参与，GM-CSF、G-CSF等也起一定作用。研究表明：常规培养体系内加入10%MCBS能提高CFU-GEMM产率1.46倍，相当于0.46 kU/L Epo的作用；说明MCBS含有一定量的CFU-GFMM活性，在培养中起着正调控作用，但不能用20%MCBS取代C FU-GEMM常规体系20%HS、2 kU/L EPO、10%BpA的作用。
, 百拇医药
总之，CBS至少具有刺激CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM生长与协同刺激活性， 含有GM-CSF、Epo等物质或因素，存在潜在的临床应用价值。
汪声恒 钱世德 岑坚 向丹 唐亚辉 林园 兰雨 李战强等在本课题中给予了帮助 ，在此致谢!
作者简介：黄友章(1956-)，男，湖南人，主管技师，学士，从事血液学研究
参考文献
[1] 黄友章，罗 晖.人脐带血造血活性物质及应用前景[J].国外医学临床生物 化学与检验学分册，1999，20：108-109.
[2] 刘秀珍.造血祖细胞培养技术实验手册[M].北京：北京出版社.1993.P25-134
[3] 伍 纲，应大明，林 梓，等.脐血血浆体外对造成血祖细胞增殖的影[J].中华 血液学杂志,1997，18：237-239.
收稿时间：1999年5月17日；修回时间：1999年 8月19日, 百拇医药
单位：海军总医院血液科，北京 100037
关键词：脐带血清；骨髓；造血祖细胞
中国应用生理学杂志000118 摘要 目的：探讨人脐带血清(CBS)在骨髓造血祖细胞培养中的效应。方法：用人骨髓细胞进行CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM培养。结果：CBS能直接刺激 骨髓细胞CFU-GM的形成。与血型相同否无关。四人份以上的混合CBS(MCBS)，刺激活性高且 稳定。10%MCBS相当于65.6 μg/L GM-CSF、0.23、0.3、0.46kU/L EpO对CFU-GM 、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM所起的作用。MCBS可提高CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CF U-GEMM常规体系的集落产率。在CFU-GM培养时，20%MCBS与100 μg/L GM-CSF和 20%马血清具有相同的效果。MCBS可直接刺激CFU-E形成。如培养体系内无B pA存在时，形 成BFU-E、CFU-GEMM较少或几乎为零，当含BpA时，可形成一定量的BFU-E、CFU-GEM M集落。结论：CBS(MCBS)内：①含有GM-CSF、Epo等物质或因素；②具有刺激CFU-GM、 CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM的生长活性；③同血型或不同血型4人份以上混合，刺激活性高 且稳定。具有良好的应用前景。
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中图分类号： R331.1-33文献标识码：A 文章编号：1000-6834(2000)01-0068-04
EFFECTS OF CORD BLOOD SERUM ON COLONY CULTURE OF BONE MARROW HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS
HUANG You-zhang, LUO Hui, YANG Ping-di, SHEN Jian-liang
(Department of Hematology, General Hospital of Navy, Beijing 10003)
ABSTRACT
Aim: To provide experimental proofs for Cord Blood clinical appliance, t he effects of human CBS (Cord Blood Serum) on colony culture of bone marrow hema topoietic progenitor cells were studied. Methods: Observed the colony forming capacity of CFU-GM，CFU-E，BFU-E，CFU-GEMM when they were c ultivated using hBMNC with CBS, Mixed Cord Blood Serum (MCBS) and/or cytokines. Resutts: 10% CBS could promote the forming of CFU-GM of BMC dir ectly, no matter what blood group the CBS or BMC were of. If four or more copies of CBS were mixed (MCBS), no matter whether the “ABO” blood groups between t hem were same or not, they could produce more CFU-GM than single copy or two-copi es-mixed CBS when used, and their activity was stable. MCBS could increase the production of CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM in routine culture system, and 10%MCBS corresponds with 65.6 μg/L GM-CSF，0.23，0. 3，0.46 kU/L Epo to CFU-G M ，CFU-E，BFU-E，CFU-GEMM respectively. When used in colony culture of CFU-GM ,20% MCBS has the same effect as 100 μg/L GM-CSF with 20% HS. 20% MCBS could a lso directly promote the forming of CFU-E. It formed few or none BFU-E and CFU -GEMM without BpA and some BFU-E and CFU-GEMM when with BpA. Conclusion : ①SC BS (MCBS) contains such substances as GM-CSF, EPO, and so on. ②There exists so me activities which can promote the forming of CFU-GM, CFU-E, BFU-E, CFU-GEM M in CBS (MCBS). ③These activities would be stronger and more stable if four or more copies of any blood-group CBS were mixed. It may be a fine prospects of c linical appliance.
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KEY WORDS: cord blood serum; bone marrow; hematop oietic progenitor cells
脐带血(CB)中除含有较丰富的造血细胞外，不少学者认为还含有多种造血细胞因子(CK) 及白细胞介素，因研究方法不同，各家有关研究报告结果间存在一定差异[1]。本 研究旨在体外观察人脐带血清(CBS)对人骨髓造血祖细胞集落形成效应，试图为脐血应用进 一步提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 CBS和混合CBS(MCBS)： 收集CB，鉴定“ABO”血型(每种血型 各收集10人份，共40份)，室温下1 h, 4℃下3 h，1000 g离心20 min，取血清，-20℃ 冷冻 ，24 h后4℃融化，2000 g离心20 min,去冷沉淀，经0.22 μm滤膜过滤除菌，用多人份等 体积混合者为MCBS，MCBS有两种类型：一为同血型血清的混合，一为不同血型血清的混 合，每种又有二、四、八人份血清混合的不同；单人份者与同型二人份混合者称A组；同型 之四、八人份混合，不同型混合(共四组，每组为4种不同血型血清各1、2、4、8人份的混合 )称B组。分装，-20℃保存备用。
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1.1.2 骨髓细胞(BMC) 胸外科手术取得的无血液病病人的肋骨骨髓(BM )，经淋巴细胞分层液分离，制备20%马血清(HS)IMDM骨髓单个核细胞悬液(BMNC) 。
1.1.3 CK GM-CSF(麒麟公司)；Epo(安进公司)；BpA(自制PHA淋巴细胞条件培养液) 。1.2 造血祖细胞培养[2]
取BMNC按1×105/ml浓度，进行粒单系造血祖细胞培养(CFU-GM)，基础培养体系(BMS)为 1640、0.3%琼脂；红系造血祖细胞(CFU-E、BFU-E)和混合造血祖细胞培养(CFU-GE MM)，三者BMS为IMDM、0.25%甲基纤维素、10-5Mα-巯基乙醇。计集落数(CFU)， 每例组作3份BMC培养，CFU取均值。实验分组：常规体系[2]为对照(C)，CBS效应(T 1)，MCBS效应(T2)，MCBS浓度效应(T3)，GM-CSF浓度效应(T4)，Epo浓度效应(T5)，MCBS和 CK联合效应(T6)，替代效应(T7)，B pA效应(T8)，各组成分见表1。
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1.3 统计学处理
结果用均值±标准差(
±s)表示，组间差异用t检验。2 结果
2.1 单人份CBS对CFU-GM的效应
10%CBS替代常规体系的GM-CSF为T1，C和T1的CFU分别为197.0±33.0、107.4±45 .2，表明每份单人份CBS中含有较高CFU-GM生长活性，但10%CBS低于100 μg/L GM-CSF 者(P<0.01)。
Tab.1 Culture system of various group
C
, 百拇医药
T1
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T3
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T5
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T8
BMS
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, 百拇医药
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20%HS
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GM-CSF(ng/ml)
▲100
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▲25-150
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▲100
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10CBS(V/V)
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▲
, 百拇医药
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MCBS(%，V/V)
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+10
+5-30
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, 百拇医药
+10
+20
+20
Epo(U/ml)
●2
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●0.5-3
●2
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, 百拇医药 10%BpA(V/V)
○
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▲Added only in the culture of CFU-GM； ●Ad ded only in the culture of CFU-E，BFU-E，CEMM； ○Added only in the colture of BFU-E，CFU-CEMM
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2.2 CBS对骨髓CFU-GM血型效应
取四种血型CBS与四种血型BMC相互交叉配对，实验体系为T1(表2)。Tab.2 Effects of blood group of CBS an d BMC onCFU-GM(CFU/105BMNC，
±s，n=10) CBSblood
group
BMC blood group
A
B
AB
, 百拇医药
O
]A
93.8±15.1
96.3±19.5
68.4±14.0
82 .0±7.9
B
101.2±18.5
99.5±17.1
80.8±14.0
78.6±8.7
AB
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100.0±l5.5
94.5±27.6
77.1±16.0
77.2±9.5
O
87.4±15.8
96.5±17.4
62.6±9.6
83.0±7.7
结果提示：任一CBS可刺激任一骨髓细胞CFU-GM生长；彼此有一定差异，无严格规律可寻。
2.3 不同MCBS对CFU-GM的效应
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实验体系为T2，CFU结果是：A组的单人份者与同型二人份混合者相比无显著差异；B组的同 型之四、八人份混合，不同型混合，任何一组之间也无显著差异。分析它们的均值发现：A 组为108.5±41.1，B组为127.0±30.4，B组比A组的CFU均值增高(18.5%，P<0.00 1)。提示不论血型是否相同，只要四人份以上CBS混合比单人份或二人份混合对CFU-GM的 生长刺激要好，且稳定。
2.4 不同浓度MCBS与GM-CSF或Epo对骨髓造血祖细胞的效应比较
用不同浓度MCBS(四种血型CBS各八人份等量混合，下同此。T3)与GM-CSF(T4)或Epo(T5)加 入培养体系，比较CFU(图1-4)。
体系内不加GM-CSF(CFU-GM培养)或Epo(CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM培养)或MCB S时无CFU形成；加入它们时，则形成CFU，且随着浓度的升高CFU也增多，有良好的剂量 与产量关系。10%MCBS大致相当于65.6 μg/L GM-CSF所形成的CFU-GM(129 .6±24.1/197.6±43.6)、 0.23 kU/L Epo所形成的CFU-E、(13.4±2.6/59 .2±10.1)、0.3kU/L Epo所形成的BFU-E(9.8±3.2/32.6±8.2)、0.46 ku/LEp o 所形成的CFU-GEMM(3.8±1.3/8.2±1.3)。
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Fig.1 Effect of concentration of MCBS(%) and GM-CSF(μg/L) on CFU-GM(
±s,n=10)Fig.2 Effect of concentration of MCBS(%) and Epo(kU/L) on CFU-E(
±s,n=10)Fig.3 Effect of concentration of MCBS(%) and Epo(kU/L) on BFU-E(
±s,n=10), 百拇医药
2.5 MCBS与GM-CSF或Epo对骨髓造血祖细胞的联合效应(表 3)
提示MCBS可增强GM-CSF对CFU-GM、Epo对CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM的生长，分别提高1.3倍、1.25倍、1.22倍与1.46倍。
Fig.4 Effect of concentration of MCBS(%) and Epo(kU/L) on CFU-CEMM(
±s,n=10)Tab.3 The synergism of MCBS and GM-CSF or EPO in culture
of BM progenitor cells (CFU/105BMNC，
±s=10) Group, http://www.100md.com
]CFU-GM
CFU-E
BFU-E
CFU-GEMM
C
197±33
109.2±19.5
45.6±11.3
9.6±1.9
T2
129±24
13.4±3.6
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9.8±3.2
3.8±1.3
T6
258±51* *
136.0±37.8* * *
55.4±9.6 * * *
14.0±1.4* * *
* * P<0.01,* * * P <0.001, vs C
2.6 MCBS替代骨髓造血祖细胞培养中的CK与HS效应(表4)
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Tab.4 The substitution of MCBS for cytokines and HS
in culture of BMC (CFU/105BMNC,
±s，n＝10) GroupCFU-GM
CFU-E
BFU-E
CFU-GEMM
C
197±33
109.2±19.5
, 百拇医药
45.6±11.3
9.6±1.9
T7
189±24
22.0±7.2* * *
12.0±1.0* * *
3.8±1.2* * *
T8
-
-
1.2±1.6* * *
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0)F]
* * * P<0.001, vs C
结果显示：在CFU-GM培养时，20%MCBS可取代常规体系中的10 μg/L GM-CSF与20% HS进行CFU-GM培养，达到同样效果。在CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM培养时，20%MCBS不能 取代CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM常规体系；且MCBS的BFU-E、CFU-GEMM培养生长活性只有 BpA存在时，才能体现，也表示BpA活性低。
3 讨论
CFU-GM的增殖分化需要GM-CSF或G-CSF等的参与。本文证实单人份CBS含有能直接刺 激CFU-GM生长的活性，但单人CBS培养结果的标准差波动较大，变异系数为42%(对照组为1 6.8%)，说明个体间差异性较大。
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伍钢等[3]认为，当脐血血浆与骨髓细胞血型相同时，CFU产率不增加，两者 血型不同时CFU产率增加明显。有学者[1]认为脐血血浆仅刺激脐血造血祖细胞的增 殖，而对骨髓来源的造血祖细胞无影响。本研究中取4种血型的CBS与骨髓细胞相互交叉 配对培养，结果为任何血型的CBS均对任何血型的骨髓细胞CFU-GM的生长有刺激作用，彼 此间在刺激强度上有一定差异，是否确实如此，尚需更多的证明。
同血型四人份或不同血型的4种CBS各一人份以上等量混合的MCBS，其刺激活性比同型 单人份或双人份混合者明显增高，活性也稳定，可能是由于更多来源的混合能使其活性得以 平衡及相互制约了其中的抑制因素有关。
就CFU-GM培养而言10%MCBS相当于65.6 μg/L GM-CSF所起的刺激作用，20%M CBS加基础培养基，可取代100 μg/L GM-CSF、20%HS加基础培养基进行CFU-GM培养。
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MCBS可提高GM-CSF作用下的CFU-GM产率，根据分析，这种作用是协同作用，这是否 说明GM-CSF与MCBS对CFU-GM的刺激作用在不同的细胞水平上，或MCBS的成分多样性所作用 的结果。
体外红系造血祖细胞培养包括CFU-E、BFU-E两种，CFU-E生长需要Epo，BFU-E生长则需要Epo和BpA，Epo的作用和性质己较明确，BpA为经PHA刺激淋巴细胞分泌的混合因子条 件液，为爆式集落活性，其作用和性质并未完全清楚。脐血中含有一定量的刺激红系造血祖 细胞生长的活性，在CFU-E、BFU-E培养时，10%MCBS分别相当于0.23 kU/L与0.3 kU/ L Epo的作用；并提高培养中的CFU产率，对CFU-E、BFU-E的生长起着协同作用，但BpA 活性很低，20%MCBS不能取代CFU-E常规体系的20% HS、2 kU/L Epo的作用，也不能取代 BFU-E常规体系的20%HS、ZKU/L、EPO、10%BpA的作用。
CFU-GEMM的形成需Epo和BpA参与，GM-CSF、G-CSF等也起一定作用。研究表明：常规培养体系内加入10%MCBS能提高CFU-GEMM产率1.46倍，相当于0.46 kU/L Epo的作用；说明MCBS含有一定量的CFU-GFMM活性，在培养中起着正调控作用，但不能用20%MCBS取代C FU-GEMM常规体系20%HS、2 kU/L EPO、10%BpA的作用。
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总之，CBS至少具有刺激CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM生长与协同刺激活性， 含有GM-CSF、Epo等物质或因素，存在潜在的临床应用价值。
汪声恒 钱世德 岑坚 向丹 唐亚辉 林园 兰雨 李战强等在本课题中给予了帮助 ，在此致谢!
作者简介：黄友章(1956-)，男，湖南人，主管技师，学士，从事血液学研究
参考文献
[1] 黄友章，罗 晖.人脐带血造血活性物质及应用前景[J].国外医学临床生物 化学与检验学分册，1999，20：108-109.
[2] 刘秀珍.造血祖细胞培养技术实验手册[M].北京：北京出版社.1993.P25-134
[3] 伍 纲，应大明，林 梓，等.脐血血浆体外对造成血祖细胞增殖的影[J].中华 血液学杂志,1997，18：237-239.
收稿时间：1999年5月17日；修回时间：1999年 8月19日, 百拇医药