登革2型病毒04株基因组全序列的测定
作者：杨敬 杨佩英 秦鄂德 胡志君 于曼 欧武
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所
关键词：登革2型病毒；基因组；序列分析
中华微生物学和免疫学杂志000311 【 摘要 】 目的 对我国登革2型病毒04株(D2-04)基因组进行全序测定及分析，为了解其基因组结构与生物功能的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。 方法 根据登革2型国际标准株NGC的序列，设计13对重叠引物，通过RT-PCR扩增出D2-04株不同的cDNA片段，分别克隆到pGEM-T载体，转化受体菌DH5α，挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。 结果 D2-04株的基因组全长10723个碱基，从97到10269位为一个长的开放读码框，编码3391个氨基酸。将它与其它登革2型病毒株NGC、JAM、PR159 (S1)、16681及它的候选疫苗株PDK-53进行比较，其核酸序列同源性分别为95.0%、 97.6%、 89.8%、 93.8%和 93.7%，氨基酸序列的类似性分别为97.8%、 98.6%、 96.7%、 97.6% 和 97.5%。 结论 我国D2-04株的基因组全序列基本类似于已发表的其它登革2型病毒株。在比较的5株登革2型病毒株中，D2-04株更类似于JAM株，其次是NGC株，与S1株的类似性略低。比较的结果表明，D2-04株与JAM株紧密相关，它们可能属于同一拓扑型。D2-04株全序的测定，对分析我国毒株来源及研制适于我国人群的登革疫苗具有一定意义。
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Complete sequence analysis of the entire genome of the
Dengue type 2 virus 04 strain isolated in China
YANG Jing, YANG Peiying, QIN Ede, et al. Institute of Microbiology
& Epidemiology, AMMS, Beijing, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To sequence the entire genome of Dengue 2 virus 04 (D2-04) strain, provide direct information about the genomic structure and its possible relationships to the biological functions, and aid in the development of new Dengue vaccines. Methods Thirteen pairs of primers were designed according to the sequence of Dengue 2 virus prototype strain NGC. Using RT-PCR, cDNA fragments of D2-04 strain were acquired from infected C6/36 cells. The cDNA fragments were cloned into the vector pGEM-T and then transformed to competent DH5α cells. Positive clones were screened and amplified by PCR, and then the products were determined by enzyme digestion. The sequences of inserted fragment were determined by PRISMTM ABI 377 automated sequencer. Results Sequence analysis showed that the entire genome of D2-04 strain consisted of 10723 nucleotides(nt) and contained a single open reading frame(ORF) of 10173 nt which encoded a polyprotein of 3391 amino acids(aa). The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of D2-04 strain were compared with those of other Dengue 2 virus strains such as NGC, JAM, PR159(S1),16681 and its attenuated vaccine derivative PDK-53. The results revealed that the homology of nucleotide sequences among the five strains was 95.0%,97.6%,89.8%,93.8% and 93.7%, respectively, and the similarity of their amino acid sequences was 97.8%, 98.6%,96.7%,97.6% and 97.5%,repectively. The genomic organization of D2-04 strain was similar to that of other reported Dengue 2 virus strains. The amino acid sequence of D2-04 strain polypeptide revealed 28 cysteine residues conserved within the Dengue 2 virus, as well as 7 potential glycosylation sites at Asn-69 of PrM protein; Asn-67 and Asn-153 of E protein; Asn-130, Asn-207, Asn-359 and Asn-399 of NSI protein. Conclusions Among the five Dengue 2 virus strains D2-04 strain is more similar to JAM (97.6% similarity) than NGC, and it is less similar to S1. Comparative data reveal that D2-04 strain appears to be closely related to JAM strain and they may belong to the same topotype. The sequence analysis of D2-04 strain would aid in understanding the origin of Dengue virus and developing Dengue vaccine in China.
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【 Subject words 】 Dengue type 2 virus; Genome; Sequence analysis
登革病毒感染可引起一系列的症状，从温和的登革热(DF)到严重的致死性的登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)。该病毒属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，全长约11kb，包括5′和3′非编码区及一个开放读码框架。该开放读码框架编码一个聚蛋白，聚蛋白经病毒编码的蛋白酶和细胞蛋白酶裂解加工成3个结构蛋白(C、PrM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)〔1〕。目前，国外学者已对登革4个血清型一些毒株的基因组全序列进行了测定，但我国登革病毒各分离株的全序列尚未见报道。登革2型病毒04株(D2-04)是1985年海南省登革热流行高峰期从病人血清中分离，该毒株对乳鼠不致病，而我国其它登革病毒分离株及国际标准株NGC株均对乳鼠致病。为进一步了解基因组结构特点及与其生物学功能的关系，对D2-04株的基因组全序列进行了测定，并与其它登革2型毒株比较，旨在找到该病毒的毒力分子标记，为登革疫苗的研究奠定基础。
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材料与方法
病毒的培养及RNA的提取： D2-04株，1985年海南省登革热流行高峰期从病人血清中分离，经C6/36细胞培养传代。长满单层的C6/36细胞接种D2-04株病毒组织培养悬液，37℃吸附1h，加入含2%小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃培养，CPE出现“+”时，弃去培养上清，将细胞刮下，用GlassMax RNA提取试剂盒(GibcoBRL)提取细胞总RNA。
PCR引物设计： 根据登革2型标准株NGC株的核苷酸序列〔2〕 ，利用Goldkey软件设计13对重叠引物，5′端设计两条反向引物Sp1和Sp2，3′末端设计一条正向引物Sp3，见图1。引物长度18～25bp，扩增片段长度为800～1300bp。
图1 D2-04株基因组cDNA的克隆和序列测定策略
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Fig 1. Cloning and sequence strategy of D2-04 genomic cDNA
反转录及PCR：结构蛋白和非结构蛋白基因的扩增采用常规方法，即取总RNA， 加入反向引物，80℃作用5min后，依次加入RNaseOUT RNA酶抑制剂(GibcoBRL)，5×第一链缓冲液6μl，dNTPs(Phamacia)及AMV反转录酶(Promega)，加水至总体积30μl，42℃保温60min进行反转录。反应完毕，95℃ 5min灭活cDNA作为PCR模板。取cDNA ，10×PCR缓冲液，正向引物、反向引物，Taq PlusⅡ聚合酶1U，补水至总体积50μl进行PCR扩增。反应参数为：94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，共25次循环，最后一次循环后72℃延伸7min。
5′和3′末端的扩增：5′和3′末端的扩增采用RACE法〔3〕。5′末端的扩增参照5′/3′RACE kit 说明书(Boehringer Mannheim)；3′末端的扩增方法如下：取总RNA，通过poly A聚合酶(GibcoBRL)，在RNA的3′端加上poly A尾。用GlassMax核酸纯化试剂盒(GibcoBRL)纯化RNA。取纯化的poly(A) RNA，参照5′/3′RACE kit说明书进行PCR扩增。反应参数为：94℃，1min后，94℃，60s；62℃，60s；72℃，90s进行25个循环，最后一次循环后，72℃延伸7min。用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR扩增结果。
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PCR产物的克隆测序：从1%低熔点琼脂糖凝胶回收特异的扩增片段，直接与pGEM-T 载体(Promega)连接，转化感受态DH5α，涂布含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板，37℃培养后，挑取白色菌落经PCR及酶切鉴定后使用ABI 377全自动测序仪测序，每个克隆均双向测序。
结果
1.D2-04株基因组一级结构特点：D2-04株基因组全序列见图2(GenBank注册号AF119661)。D2-04株基因组全长10723个核苷酸，含有一个单一的开放读码框架。碱基组成为A：33.06%(3545个)，C：20.56%(2205个)，T：20.99%(2251个)，G：25.38%(2722个)。5′端非编码区有96个核苷酸。开放读码框架从97位核苷酸开始，共10173个核苷酸，编码3391个氨基酸，包含3个结构蛋白C、PrM和E及7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，它们的氨基酸数分别为114、166、495、352、218、130、618、286、112和900个，它们的编码顺序为C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。
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2.D2-04株基因组核苷酸序列与其它2型病毒的比较：将D2-04株基因组核苷酸序列与已经发表的登革2型病毒NGC株、JAM株、S1株及166811株、PDK-53株进行比较，结果表明：D2-04株基因组的核苷酸序列基本类似于其它登革2型病毒株，其同源性分别为95.0%、97.6%、89.8%、93.8%和93.7%，与JAM株同源性最高，其次是NGC株，与S1株同源性最低。D2-04株5′非编码区与S1株5′非编码区的同源性较低，只有78.1%，与其它2型毒株的同源性接近其编码区的同源性。D2-04株和上述2型病毒的各蛋白基因之间的同源性进行比较发现，它们之间的同源性相差不大，核苷酸的差异散在分布在各结构蛋白和非结构蛋白基因中，见表1。其碱基组成也类似于其它登革2型病毒，见表2。
图2 D2-04株基因组核苷酸序列
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Fig 2. The genomic sequence of D2-04 strain
表1 D2-04株基因组核苷酸序列与其它2型病毒的同源性(%)
Table 1. Homology (%) of nucleotide sequences of D2-04 genome with other dengue type 2 virus strains Protein
Number
of nt
NGC
JAM
S1
16681
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PDK-53
5′
96
91.7
92.7
78.1
92.7
90.6
C
342
94.7
99.1
90.6
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93.9
93.9
PrM
498
96.0
97.4
90.8
93.6
93.4
E
1485
95.2
98.3
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90.1
94.1
94.0
NS1
1056
95.5
97.0
90.4
93.7
93.5
NS2A
654
93.3
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97.9
86.7
90.7
90.5
NS2B
390
94.9
97.9
89.7
94.9
94.9
NS3
1854
, 百拇医药
94.9
97.7
89.4
94.1
94.0
NS4A
858
94.5
96.9
90.6
93.9
93.8
NS4B
, 百拇医药
336
93.8
97.6
86.6
92.9
92.9
NS5
2700
95.2
97.7
90.6
94.1
94.1
, 百拇医药
3′
454
96.9
97.1
90.2
94.7
94.7
Total
10723
95.0
97.6
89.8
93.8
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93.7
表2 D2-04株与其它2型病毒基因组碱基组成的比较(%)
Table 2. Comparison of base composition of D2-04 genome with other dengue type 2 virus strains
04
NGC
JAM
S1
16681
PDK-53
A
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33.06
33.07
33.18
32.88
33.14
33.13
G
25.38
25.35
25.27
25.40
25.30
25.28
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T
20.99
20.86
21.07
20.90
21.04
21.09
C
20.56
20.65
20.48
20.69
20.52
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20.50
3.D2-04株推断的氨基酸序列与其它登革2型病毒株的比较：D2-04株的聚蛋白由3391个氨基酸组成，含7个糖基化位点，分别位于PrM蛋白的Asn-69位；E蛋白的Asn-67位和Asn-153位；NS1蛋白的Asn-130、Asn-207、Asn-359位和Asn-399位。其蛋白分子中有28个保守的半胱氨酸残基，其中PrM区有6个，E区有12个，NS1区有10个，与其它登革2型病毒均相同。将D2-04株氨基酸序列与其它登革2型病毒株进行比较，其类似性分别为97.8%、98.6%、96.7%、97.6%和97.5%，见表3。结果表明，D2-04株与其它5株登革2型病毒的氨基酸序列基本类似，同源性在(96.7～98.6)%之间，氨基酸的差异散在分布在各蛋白中。另外，D2-04株与S1株氨基酸序列同源性为96.7%，而核苷酸序列同源性只有89.8%，经分析发现，这两株病毒基因组核苷酸的变化大部分发生在密码子的第三位，并不影响氨基酸的变化。D2-04株的蛋白裂解位点和疏水剖面图也类似于其它已发表的2型病毒(图略)。 表3 D2-04株编码蛋白氨基酸序列与其它2型毒株的类似性(%)
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Table 3. Similarity (%) of amino acid sequences of protein of D2-04 strain with other dengue type 2 virus strains Protein
Number
of nt
NGC
JAM
S1
16681
PDK-53
C
114
, 百拇医药
96.5
99.1
95.6
94.7
94.0
PrM
166
97.0
98.2
94.6
95.8
95.2
E
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495
97.0
98.2
96.6
97.4
97.4
NS1
352
98.3
98.9
96.0
96.9
96.6
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NS2A
218
95.4
98.6
95.4
95.9
95.4
NS2B
130
99.2
98.5
98.5
99.2
, 百拇医药
99.2
NS3
618
98.1
98.9
97.2
98.4
98.2
NS4A
286
97.9
97.9
97.2
, 百拇医药
98.3
97.9
NS4B
112
98.2
99.1
96.4
98.2
98.2
NS5
900
98.4
98.8
, 百拇医药
97.0
98.2
98.2
Total
3391
97.8
98.6
96.7
97.6
97.5
讨论
D2-04株基因组全序列测定结果表明，D2-04株基因组全长10723个核苷酸，5′和3′非编码区及开放读码框架的长度均与其它已报道的登革2型病毒基因组全序列类似(S1株长为10703个核苷酸，与其它2型病毒不同)。其同源性比较显示，D2-04株更类似于JAM株(97.6%)，与S1株同源性略低(89.8%)。据文献报道，登革2型病毒至少存在6个拓扑型，它们之间核苷酸的离散率为10%〔3〕。Trent等〔3〕推测，JAM株是由西非传到加勒比地区，而PR159 (S1)株来源于波多黎各。JAM株和S1株属于不同的拓扑型。D2-04株与JAM株的核苷酸序列同源性略高，它们可能属于同一拓扑型。
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D2-04株E蛋白的第126位是谷氨酸，而NGC株为赖氨酸。研究表明，若NGC株的这个赖氨酸突变为谷氨酸，其神经毒性则丧失〔4〕。该氨基酸的变化是否与本病毒对乳鼠无致病性有关，值得进一步深入研究。
Pletnev等〔5〕研究发现，嵌合的TBE/DEN-4病毒克隆的第一个NS1糖基化位点突变，病毒在细胞培养中的滴度降低，对小鼠的神经毒性降低，而第二个糖基化位点突变，可增强对小鼠的神经毒性。Pryor等〔6〕发现，若PrM/E蛋白裂解位点的-3位的丝氨酸变为异亮氨酸，或将NS1的第二个糖基化位点去除，病毒在细胞中的生长减慢，而将一些半胱氨酸残基去除，则病毒的生长受到抑制。D2-04株的糖基化位点、蛋白裂解位点和半胱氨酸残基高度保守，与其生物学性质密切相关。
黄病毒的神经毒性与结构蛋白有关，非结构蛋白和非翻译区的氨基酸序列与黄病毒的神经毒性也有一定关系〔7〕。Xie等〔8〕发现，黄热病毒的NS5区的第137位氨基酸由P→S后，病毒对小鼠的神经毒性降低，估计原因可能为这个氨基酸的变化引起NS5蛋白的甲基化酶二级结构发生变化，导致蛋白三级结构的变化，影响酶活性，减弱了病毒的复制能力而不能有效增殖。Mangada等〔9〕认为，登革病毒毒力的分子标记可能分散存在于病毒的基因组中，尤其是非结构基因区和3′非翻译区。但至今还未发现登革病毒的非结构蛋白中存在与毒力有关的序列。
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构建全长cDNA克隆可转录成感染性的RNA，对研究在感染细胞中病毒的复制和蛋白功能可起到重要作用。Kapoor〔10〕、Kinney〔11〕、Lai等〔12〕构建了登革2型NGC株、16681株、PDK-53株和登革4型814669株的全长cDNA克隆。而对登革病毒的序列测定，有助于进一步研究病毒之间核苷酸序列差异与病毒致病性关系，了解病毒的复制、装配及发病机理，以及弄清我国流行株的变异的分子基础，为研制和开发相应的登革疫苗奠定基础。
参考文献
1 Chambers TJ, Hahn CS, Csller R, et al. Flavivirus genome organisation, expression and replication. Annu Rev Microbiol, 1990, 44:649-688.
, 百拇医药 2 Irie K, Mohan PM, Sasaguri Y, et al. Sequence analysis of cloned dengue virus type 2 genome (New guinea C strain). Gene, 1988, 75:197-211.
3 Trent DW, Grant JA, Rosen L, et al. Genetic variation among dengue-2 virus of different geographic origin. Virology, 1983, 128:271-284.
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, 百拇医药
5 Pletnev AG, Bray M, Lai CJ, et al. Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J Virol, 1993, 67:4956-4963.
6 Pryor MJ, Gualano RC, Lin B,et al. Growth restriction of dengue virus type 2 by site-specific mutagenesis of virus-encoded glycoproteins. J Gen Virol, 1998, 79:2631-2639.
7 Mcminn PC, Marshall ID, Dalgarno L. Neurovirulence and neuroinvasiveness of Murray Valley encephalitis virus mutants selected by passage in a monkey cell line. J Gen Virol, 1995, 76:865-872.
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8 Xie H, Ryman KD, Campbell GA, et al. Mutation in NS5 protein attenuates mouse neurovirulence of yellow fever 17D vaccine virus. J Gen Virol, 1998, 79:1895-1899.
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10 Kapoor M, Zhang L, Mohan PM, et al. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 genome (New Guinea-C strain). Gene, 1995,162:175-180.
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11 Kinney RM, Butrapet S, Chang GJ, et al. Construction of infectious cDNA clones for dengue 2 virus: strain 16681 and its attenuated vaccine derivative, strain PDK-53. Virology, 1997, 230:300-308.
12 Lai CJ, Zhao B, Hori H, et al. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proc Natl Aca Sci USA, 1991, 88, 5139-5143.
(收稿日期：1999-02-10), 百拇医药
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所
关键词：登革2型病毒；基因组；序列分析
中华微生物学和免疫学杂志000311 【 摘要 】 目的 对我国登革2型病毒04株(D2-04)基因组进行全序测定及分析，为了解其基因组结构与生物功能的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。 方法 根据登革2型国际标准株NGC的序列，设计13对重叠引物，通过RT-PCR扩增出D2-04株不同的cDNA片段，分别克隆到pGEM-T载体，转化受体菌DH5α，挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。 结果 D2-04株的基因组全长10723个碱基，从97到10269位为一个长的开放读码框，编码3391个氨基酸。将它与其它登革2型病毒株NGC、JAM、PR159 (S1)、16681及它的候选疫苗株PDK-53进行比较，其核酸序列同源性分别为95.0%、 97.6%、 89.8%、 93.8%和 93.7%，氨基酸序列的类似性分别为97.8%、 98.6%、 96.7%、 97.6% 和 97.5%。 结论 我国D2-04株的基因组全序列基本类似于已发表的其它登革2型病毒株。在比较的5株登革2型病毒株中，D2-04株更类似于JAM株，其次是NGC株，与S1株的类似性略低。比较的结果表明，D2-04株与JAM株紧密相关，它们可能属于同一拓扑型。D2-04株全序的测定，对分析我国毒株来源及研制适于我国人群的登革疫苗具有一定意义。
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Complete sequence analysis of the entire genome of the
Dengue type 2 virus 04 strain isolated in China
YANG Jing, YANG Peiying, QIN Ede, et al. Institute of Microbiology
& Epidemiology, AMMS, Beijing, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To sequence the entire genome of Dengue 2 virus 04 (D2-04) strain, provide direct information about the genomic structure and its possible relationships to the biological functions, and aid in the development of new Dengue vaccines. Methods Thirteen pairs of primers were designed according to the sequence of Dengue 2 virus prototype strain NGC. Using RT-PCR, cDNA fragments of D2-04 strain were acquired from infected C6/36 cells. The cDNA fragments were cloned into the vector pGEM-T and then transformed to competent DH5α cells. Positive clones were screened and amplified by PCR, and then the products were determined by enzyme digestion. The sequences of inserted fragment were determined by PRISMTM ABI 377 automated sequencer. Results Sequence analysis showed that the entire genome of D2-04 strain consisted of 10723 nucleotides(nt) and contained a single open reading frame(ORF) of 10173 nt which encoded a polyprotein of 3391 amino acids(aa). The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of D2-04 strain were compared with those of other Dengue 2 virus strains such as NGC, JAM, PR159(S1),16681 and its attenuated vaccine derivative PDK-53. The results revealed that the homology of nucleotide sequences among the five strains was 95.0%,97.6%,89.8%,93.8% and 93.7%, respectively, and the similarity of their amino acid sequences was 97.8%, 98.6%,96.7%,97.6% and 97.5%,repectively. The genomic organization of D2-04 strain was similar to that of other reported Dengue 2 virus strains. The amino acid sequence of D2-04 strain polypeptide revealed 28 cysteine residues conserved within the Dengue 2 virus, as well as 7 potential glycosylation sites at Asn-69 of PrM protein; Asn-67 and Asn-153 of E protein; Asn-130, Asn-207, Asn-359 and Asn-399 of NSI protein. Conclusions Among the five Dengue 2 virus strains D2-04 strain is more similar to JAM (97.6% similarity) than NGC, and it is less similar to S1. Comparative data reveal that D2-04 strain appears to be closely related to JAM strain and they may belong to the same topotype. The sequence analysis of D2-04 strain would aid in understanding the origin of Dengue virus and developing Dengue vaccine in China.
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【 Subject words 】 Dengue type 2 virus; Genome; Sequence analysis
登革病毒感染可引起一系列的症状，从温和的登革热(DF)到严重的致死性的登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)。该病毒属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，全长约11kb，包括5′和3′非编码区及一个开放读码框架。该开放读码框架编码一个聚蛋白，聚蛋白经病毒编码的蛋白酶和细胞蛋白酶裂解加工成3个结构蛋白(C、PrM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)〔1〕。目前，国外学者已对登革4个血清型一些毒株的基因组全序列进行了测定，但我国登革病毒各分离株的全序列尚未见报道。登革2型病毒04株(D2-04)是1985年海南省登革热流行高峰期从病人血清中分离，该毒株对乳鼠不致病，而我国其它登革病毒分离株及国际标准株NGC株均对乳鼠致病。为进一步了解基因组结构特点及与其生物学功能的关系，对D2-04株的基因组全序列进行了测定，并与其它登革2型毒株比较，旨在找到该病毒的毒力分子标记，为登革疫苗的研究奠定基础。
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材料与方法
病毒的培养及RNA的提取： D2-04株，1985年海南省登革热流行高峰期从病人血清中分离，经C6/36细胞培养传代。长满单层的C6/36细胞接种D2-04株病毒组织培养悬液，37℃吸附1h，加入含2%小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃培养，CPE出现“+”时，弃去培养上清，将细胞刮下，用GlassMax RNA提取试剂盒(GibcoBRL)提取细胞总RNA。
PCR引物设计： 根据登革2型标准株NGC株的核苷酸序列〔2〕 ，利用Goldkey软件设计13对重叠引物，5′端设计两条反向引物Sp1和Sp2，3′末端设计一条正向引物Sp3，见图1。引物长度18～25bp，扩增片段长度为800～1300bp。
图1 D2-04株基因组cDNA的克隆和序列测定策略
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Fig 1. Cloning and sequence strategy of D2-04 genomic cDNA
反转录及PCR：结构蛋白和非结构蛋白基因的扩增采用常规方法，即取总RNA， 加入反向引物，80℃作用5min后，依次加入RNaseOUT RNA酶抑制剂(GibcoBRL)，5×第一链缓冲液6μl，dNTPs(Phamacia)及AMV反转录酶(Promega)，加水至总体积30μl，42℃保温60min进行反转录。反应完毕，95℃ 5min灭活cDNA作为PCR模板。取cDNA ，10×PCR缓冲液，正向引物、反向引物，Taq PlusⅡ聚合酶1U，补水至总体积50μl进行PCR扩增。反应参数为：94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，共25次循环，最后一次循环后72℃延伸7min。
5′和3′末端的扩增：5′和3′末端的扩增采用RACE法〔3〕。5′末端的扩增参照5′/3′RACE kit 说明书(Boehringer Mannheim)；3′末端的扩增方法如下：取总RNA，通过poly A聚合酶(GibcoBRL)，在RNA的3′端加上poly A尾。用GlassMax核酸纯化试剂盒(GibcoBRL)纯化RNA。取纯化的poly(A) RNA，参照5′/3′RACE kit说明书进行PCR扩增。反应参数为：94℃，1min后，94℃，60s；62℃，60s；72℃，90s进行25个循环，最后一次循环后，72℃延伸7min。用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR扩增结果。
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PCR产物的克隆测序：从1%低熔点琼脂糖凝胶回收特异的扩增片段，直接与pGEM-T 载体(Promega)连接，转化感受态DH5α，涂布含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板，37℃培养后，挑取白色菌落经PCR及酶切鉴定后使用ABI 377全自动测序仪测序，每个克隆均双向测序。
结果
1.D2-04株基因组一级结构特点：D2-04株基因组全序列见图2(GenBank注册号AF119661)。D2-04株基因组全长10723个核苷酸，含有一个单一的开放读码框架。碱基组成为A：33.06%(3545个)，C：20.56%(2205个)，T：20.99%(2251个)，G：25.38%(2722个)。5′端非编码区有96个核苷酸。开放读码框架从97位核苷酸开始，共10173个核苷酸，编码3391个氨基酸，包含3个结构蛋白C、PrM和E及7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，它们的氨基酸数分别为114、166、495、352、218、130、618、286、112和900个，它们的编码顺序为C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。
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2.D2-04株基因组核苷酸序列与其它2型病毒的比较：将D2-04株基因组核苷酸序列与已经发表的登革2型病毒NGC株、JAM株、S1株及166811株、PDK-53株进行比较，结果表明：D2-04株基因组的核苷酸序列基本类似于其它登革2型病毒株，其同源性分别为95.0%、97.6%、89.8%、93.8%和93.7%，与JAM株同源性最高，其次是NGC株，与S1株同源性最低。D2-04株5′非编码区与S1株5′非编码区的同源性较低，只有78.1%，与其它2型毒株的同源性接近其编码区的同源性。D2-04株和上述2型病毒的各蛋白基因之间的同源性进行比较发现，它们之间的同源性相差不大，核苷酸的差异散在分布在各结构蛋白和非结构蛋白基因中，见表1。其碱基组成也类似于其它登革2型病毒，见表2。
图2 D2-04株基因组核苷酸序列
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Fig 2. The genomic sequence of D2-04 strain
表1 D2-04株基因组核苷酸序列与其它2型病毒的同源性(%)
Table 1. Homology (%) of nucleotide sequences of D2-04 genome with other dengue type 2 virus strains Protein
Number
of nt
NGC
JAM
S1
16681
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PDK-53
5′
96
91.7
92.7
78.1
92.7
90.6
C
342
94.7
99.1
90.6
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93.9
93.9
PrM
498
96.0
97.4
90.8
93.6
93.4
E
1485
95.2
98.3
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90.1
94.1
94.0
NS1
1056
95.5
97.0
90.4
93.7
93.5
NS2A
654
93.3
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97.9
86.7
90.7
90.5
NS2B
390
94.9
97.9
89.7
94.9
94.9
NS3
1854
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94.9
97.7
89.4
94.1
94.0
NS4A
858
94.5
96.9
90.6
93.9
93.8
NS4B
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336
93.8
97.6
86.6
92.9
92.9
NS5
2700
95.2
97.7
90.6
94.1
94.1
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3′
454
96.9
97.1
90.2
94.7
94.7
Total
10723
95.0
97.6
89.8
93.8
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93.7
表2 D2-04株与其它2型病毒基因组碱基组成的比较(%)
Table 2. Comparison of base composition of D2-04 genome with other dengue type 2 virus strains
04
NGC
JAM
S1
16681
PDK-53
A
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33.06
33.07
33.18
32.88
33.14
33.13
G
25.38
25.35
25.27
25.40
25.30
25.28
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T
20.99
20.86
21.07
20.90
21.04
21.09
C
20.56
20.65
20.48
20.69
20.52
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20.50
3.D2-04株推断的氨基酸序列与其它登革2型病毒株的比较：D2-04株的聚蛋白由3391个氨基酸组成，含7个糖基化位点，分别位于PrM蛋白的Asn-69位；E蛋白的Asn-67位和Asn-153位；NS1蛋白的Asn-130、Asn-207、Asn-359位和Asn-399位。其蛋白分子中有28个保守的半胱氨酸残基，其中PrM区有6个，E区有12个，NS1区有10个，与其它登革2型病毒均相同。将D2-04株氨基酸序列与其它登革2型病毒株进行比较，其类似性分别为97.8%、98.6%、96.7%、97.6%和97.5%，见表3。结果表明，D2-04株与其它5株登革2型病毒的氨基酸序列基本类似，同源性在(96.7～98.6)%之间，氨基酸的差异散在分布在各蛋白中。另外，D2-04株与S1株氨基酸序列同源性为96.7%，而核苷酸序列同源性只有89.8%，经分析发现，这两株病毒基因组核苷酸的变化大部分发生在密码子的第三位，并不影响氨基酸的变化。D2-04株的蛋白裂解位点和疏水剖面图也类似于其它已发表的2型病毒(图略)。 表3 D2-04株编码蛋白氨基酸序列与其它2型毒株的类似性(%)
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Table 3. Similarity (%) of amino acid sequences of protein of D2-04 strain with other dengue type 2 virus strains Protein
Number
of nt
NGC
JAM
S1
16681
PDK-53
C
114
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96.5
99.1
95.6
94.7
94.0
PrM
166
97.0
98.2
94.6
95.8
95.2
E
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495
97.0
98.2
96.6
97.4
97.4
NS1
352
98.3
98.9
96.0
96.9
96.6
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NS2A
218
95.4
98.6
95.4
95.9
95.4
NS2B
130
99.2
98.5
98.5
99.2
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99.2
NS3
618
98.1
98.9
97.2
98.4
98.2
NS4A
286
97.9
97.9
97.2
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98.3
97.9
NS4B
112
98.2
99.1
96.4
98.2
98.2
NS5
900
98.4
98.8
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97.0
98.2
98.2
Total
3391
97.8
98.6
96.7
97.6
97.5
讨论
D2-04株基因组全序列测定结果表明，D2-04株基因组全长10723个核苷酸，5′和3′非编码区及开放读码框架的长度均与其它已报道的登革2型病毒基因组全序列类似(S1株长为10703个核苷酸，与其它2型病毒不同)。其同源性比较显示，D2-04株更类似于JAM株(97.6%)，与S1株同源性略低(89.8%)。据文献报道，登革2型病毒至少存在6个拓扑型，它们之间核苷酸的离散率为10%〔3〕。Trent等〔3〕推测，JAM株是由西非传到加勒比地区，而PR159 (S1)株来源于波多黎各。JAM株和S1株属于不同的拓扑型。D2-04株与JAM株的核苷酸序列同源性略高，它们可能属于同一拓扑型。
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D2-04株E蛋白的第126位是谷氨酸，而NGC株为赖氨酸。研究表明，若NGC株的这个赖氨酸突变为谷氨酸，其神经毒性则丧失〔4〕。该氨基酸的变化是否与本病毒对乳鼠无致病性有关，值得进一步深入研究。
Pletnev等〔5〕研究发现，嵌合的TBE/DEN-4病毒克隆的第一个NS1糖基化位点突变，病毒在细胞培养中的滴度降低，对小鼠的神经毒性降低，而第二个糖基化位点突变，可增强对小鼠的神经毒性。Pryor等〔6〕发现，若PrM/E蛋白裂解位点的-3位的丝氨酸变为异亮氨酸，或将NS1的第二个糖基化位点去除，病毒在细胞中的生长减慢，而将一些半胱氨酸残基去除，则病毒的生长受到抑制。D2-04株的糖基化位点、蛋白裂解位点和半胱氨酸残基高度保守，与其生物学性质密切相关。
黄病毒的神经毒性与结构蛋白有关，非结构蛋白和非翻译区的氨基酸序列与黄病毒的神经毒性也有一定关系〔7〕。Xie等〔8〕发现，黄热病毒的NS5区的第137位氨基酸由P→S后，病毒对小鼠的神经毒性降低，估计原因可能为这个氨基酸的变化引起NS5蛋白的甲基化酶二级结构发生变化，导致蛋白三级结构的变化，影响酶活性，减弱了病毒的复制能力而不能有效增殖。Mangada等〔9〕认为，登革病毒毒力的分子标记可能分散存在于病毒的基因组中，尤其是非结构基因区和3′非翻译区。但至今还未发现登革病毒的非结构蛋白中存在与毒力有关的序列。
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构建全长cDNA克隆可转录成感染性的RNA，对研究在感染细胞中病毒的复制和蛋白功能可起到重要作用。Kapoor〔10〕、Kinney〔11〕、Lai等〔12〕构建了登革2型NGC株、16681株、PDK-53株和登革4型814669株的全长cDNA克隆。而对登革病毒的序列测定，有助于进一步研究病毒之间核苷酸序列差异与病毒致病性关系，了解病毒的复制、装配及发病机理，以及弄清我国流行株的变异的分子基础，为研制和开发相应的登革疫苗奠定基础。
参考文献
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12 Lai CJ, Zhao B, Hori H, et al. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proc Natl Aca Sci USA, 1991, 88, 5139-5143.
(收稿日期：1999-02-10), 百拇医药