乙型肝炎前S1蛋白的融合表达
作者：郭葆玉 李文捷 杜风鸣 张淑英 汤琰 程振球
单位：郭葆玉(第二军医大学药学生化药学业教研室,上海 200433)；汤琰(海军医学研究所免疫室)；李文捷(海军医学研究所免疫室)；程振球(海军医学研究所免疫室)；杜风鸣(第二军医大学长海医院检验科)；张淑英(基础医学部卫生毒理学教研室)
关键词：肝炎病毒，乙型；前S1蛋白；表达
第二军医大学学报000330 【中图分类号】 R 512.62 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0294-02▲
研究发现，肝炎病毒前S1和前S2蛋白与HBV的复制密切相关，而前S1蛋白较前S2蛋白在HBV的致病机制上可能起着更为重要的作用。现在越来越多的医院将检测前S1蛋白做为HBV复制的指标和判断HBV活动性的一个重要依据。我国是肝炎高发区，HBVsAg 携带者为1.2亿以上(全世界3亿)，为提高对HBV的诊断、治疗和预防水平，我们克隆并对前S1蛋白129个氨基酸进行了融合表达、纯化和实验应用。现将实验结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 HBV由上海长海医院杜风鸣教授提供。PCR kit、限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自上海华美公司。GST，还原型4B 购自Sigma公司，上海基康公司合成上游引物5′-CGGATCCATGGGAGGTTGGTCTTCCA，下游引物5′-GCGATTTCCTAGTGGAATGTTGTGGAGT。
1.2 方法 反应在Progene公司PCR合成仪上进行，反应条件为94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环。PCR产物由基康公司测序。
1.3 表达和纯化 将PCR 产物用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，在1%琼脂糖凝胶上电泳回收387 bp的片段， 与相同酶切的载体pGEX-4T-1连接，转化大肠杆菌HB101株， 诱导用IPTG，终浓度1 mmol/L,SDS-PAGE分析结果。按Sepharose 4B 说明书纯化表达融合蛋白产物。采用间接ELISA法检测前S1抗体。
, 百拇医药
2 结 果
PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上可见一387 bp清晰条带，与预测大小一致。SDS-PAGE凝胶电泳后见诱导样品在4.0×104处有一明显表达产物。由Sepharose 4B纯化后，相对分子质量4.0×104的分子再经凝血酶酶解为2.8×104和1.2×104两个分子，然后用1.2×104分子供实验用。我们制备的前S1基因表达抗原由上海新生物技术研究所用于检测前S1抗体，以常规应用的北京大学合成肽前S1抗原作对照，用这两种来源不同的前S1抗原作包被，采用间接ELISA法检测人血清前S1抗体的阳性检测率，相对灵敏度及特异性结果见表1。
表1 两种包被抗原检测前S1抗体的阳性率
Tab 1 The positive ratio of proS1 Ab
, http://www.100md.com
of 2 coated antigen(n=80) Group
Positive
Negative
Gene expressed Ag
25
55
Synthesized Ag
18
62
表1显示基因表达前S1抗原对80例血清的前S1抗体阳性检测率为31%(25/80)，而合成肽抗原的阳性率为22.5%(18/80)，基因抗原(+)而合成肽抗原(-)的有7例，无合成肽抗原(+)而基因抗原(-)的情况，可见本研究制备的基因表达前S1抗原对前S1抗体的检测率优于合成肽前S1抗原。以血清稀释度D值>2.1倍阴性D值为判断血清阳性滴度的标准，则基因抗原包被微孔检测1份已知前S1抗体阳性血清的滴度是1∶8，而合成肽抗原的检测滴度是1∶2，前者是后者的4倍，见表2。表2 两种抗原检测前S1抗体的相对灵敏度
, 百拇医药
Tab 2 The relative sensitivity of
proS1 Ab of 2 Ag[D(450)] Group
Dilution ratio of positive serum
Negative
Origin
1∶2
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
Gene expressed
, 百拇医药
Ag
0.60
0.42
0.28
0.17
0.11
0.08
0.06
Synthe-
sized
Ag
0.52
0.35
, 百拇医药
0.22
0.18
0.15
0.13
0.14
以20 μg/ml基因表达前S1抗原加入0.5 ml前S1抗体阳性血清,以中和抑制血清中抗体。然后用相同的方法测定抑制前后的血清D(450)值并计算各抑制率，结果显示表1中所列基因抗原(+)而合成肽抗原(-)的7份血清的特异性抑制率都大于50%，说明此抗原的阳性检测效果可靠(表3)。表3 基因抗原检测前S1抗体的特异性
Tab 3 The specificity of proS1 Ab detected with gene Ag[D(450)] Serum
, 百拇医药 Before inhibition
After inhibition
Inhibition ratio(%)
1
0.36
0.12
66.7
2
0.37
0.17
54.1
3
, 百拇医药
0.30
0.12
60.0
4
0.28
0.08
71.4
5
0.31
0.13
58.41
6
0.18
, 百拇医药
0.09
50.0
7
0.21
0.10
52.3
3 讨 论
本研究利用分子生物学技术，融合表达HBV前S1抗原。由于利用大肠杆菌生产，故得率高,又利用融合表达使纯化容易,产物纯度好。将此基因表达的前S1抗原用于检测前S1抗体，其阳性检测率和相对灵敏度均高于现在应用的合成肽抗原，且特异性测定符合要求。其灵敏度较高的原因，可能主要因为基因表达的是全段前S1蛋白，含129个氨基酸，而合成肽抗原仅合成了前S1蛋白 21～47位的27个氨基酸，无疑前者的抗原决定簇多于后者，使检出率大为增高。另外前S1全段多肽的疏水氨基酸含量远高于合成肽抗原，这就使得待检血清IgG的非特异性粘附大为减少，使基因抗原包被孔的阴性背景D值低于合成肽包被孔，这也是基因抗原的相对灵敏度高于合成肽抗原的原因之一。该产物的问世大大改善了前S1抗体的检测效果，对乙肝的诊断和预后判断均有一定的意义。■
作者简介:郭葆玉(1951-),男(汉族),博士,教授
【收稿日期】 1999-11-09
【修回日期】 2000-02-24, 百拇医药
单位：郭葆玉(第二军医大学药学生化药学业教研室,上海 200433)；汤琰(海军医学研究所免疫室)；李文捷(海军医学研究所免疫室)；程振球(海军医学研究所免疫室)；杜风鸣(第二军医大学长海医院检验科)；张淑英(基础医学部卫生毒理学教研室)
关键词：肝炎病毒，乙型；前S1蛋白；表达
第二军医大学学报000330 【中图分类号】 R 512.62 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0294-02▲
研究发现，肝炎病毒前S1和前S2蛋白与HBV的复制密切相关，而前S1蛋白较前S2蛋白在HBV的致病机制上可能起着更为重要的作用。现在越来越多的医院将检测前S1蛋白做为HBV复制的指标和判断HBV活动性的一个重要依据。我国是肝炎高发区，HBVsAg 携带者为1.2亿以上(全世界3亿)，为提高对HBV的诊断、治疗和预防水平，我们克隆并对前S1蛋白129个氨基酸进行了融合表达、纯化和实验应用。现将实验结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 HBV由上海长海医院杜风鸣教授提供。PCR kit、限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自上海华美公司。GST，还原型4B 购自Sigma公司，上海基康公司合成上游引物5′-CGGATCCATGGGAGGTTGGTCTTCCA，下游引物5′-GCGATTTCCTAGTGGAATGTTGTGGAGT。
1.2 方法 反应在Progene公司PCR合成仪上进行，反应条件为94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环。PCR产物由基康公司测序。
1.3 表达和纯化 将PCR 产物用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，在1%琼脂糖凝胶上电泳回收387 bp的片段， 与相同酶切的载体pGEX-4T-1连接，转化大肠杆菌HB101株， 诱导用IPTG，终浓度1 mmol/L,SDS-PAGE分析结果。按Sepharose 4B 说明书纯化表达融合蛋白产物。采用间接ELISA法检测前S1抗体。
, 百拇医药
2 结 果
PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上可见一387 bp清晰条带，与预测大小一致。SDS-PAGE凝胶电泳后见诱导样品在4.0×104处有一明显表达产物。由Sepharose 4B纯化后，相对分子质量4.0×104的分子再经凝血酶酶解为2.8×104和1.2×104两个分子，然后用1.2×104分子供实验用。我们制备的前S1基因表达抗原由上海新生物技术研究所用于检测前S1抗体，以常规应用的北京大学合成肽前S1抗原作对照，用这两种来源不同的前S1抗原作包被，采用间接ELISA法检测人血清前S1抗体的阳性检测率，相对灵敏度及特异性结果见表1。
表1 两种包被抗原检测前S1抗体的阳性率
Tab 1 The positive ratio of proS1 Ab
, http://www.100md.com
of 2 coated antigen(n=80) Group
Positive
Negative
Gene expressed Ag
25
55
Synthesized Ag
18
62
表1显示基因表达前S1抗原对80例血清的前S1抗体阳性检测率为31%(25/80)，而合成肽抗原的阳性率为22.5%(18/80)，基因抗原(+)而合成肽抗原(-)的有7例，无合成肽抗原(+)而基因抗原(-)的情况，可见本研究制备的基因表达前S1抗原对前S1抗体的检测率优于合成肽前S1抗原。以血清稀释度D值>2.1倍阴性D值为判断血清阳性滴度的标准，则基因抗原包被微孔检测1份已知前S1抗体阳性血清的滴度是1∶8，而合成肽抗原的检测滴度是1∶2，前者是后者的4倍，见表2。表2 两种抗原检测前S1抗体的相对灵敏度
, 百拇医药
Tab 2 The relative sensitivity of
proS1 Ab of 2 Ag[D(450)] Group
Dilution ratio of positive serum
Negative
Origin
1∶2
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
Gene expressed
, 百拇医药
Ag
0.60
0.42
0.28
0.17
0.11
0.08
0.06
Synthe-
sized
Ag
0.52
0.35
, 百拇医药
0.22
0.18
0.15
0.13
0.14
以20 μg/ml基因表达前S1抗原加入0.5 ml前S1抗体阳性血清,以中和抑制血清中抗体。然后用相同的方法测定抑制前后的血清D(450)值并计算各抑制率，结果显示表1中所列基因抗原(+)而合成肽抗原(-)的7份血清的特异性抑制率都大于50%，说明此抗原的阳性检测效果可靠(表3)。表3 基因抗原检测前S1抗体的特异性
Tab 3 The specificity of proS1 Ab detected with gene Ag[D(450)] Serum
, 百拇医药 Before inhibition
After inhibition
Inhibition ratio(%)
1
0.36
0.12
66.7
2
0.37
0.17
54.1
3
, 百拇医药
0.30
0.12
60.0
4
0.28
0.08
71.4
5
0.31
0.13
58.41
6
0.18
, 百拇医药
0.09
50.0
7
0.21
0.10
52.3
3 讨 论
本研究利用分子生物学技术，融合表达HBV前S1抗原。由于利用大肠杆菌生产，故得率高,又利用融合表达使纯化容易,产物纯度好。将此基因表达的前S1抗原用于检测前S1抗体，其阳性检测率和相对灵敏度均高于现在应用的合成肽抗原，且特异性测定符合要求。其灵敏度较高的原因，可能主要因为基因表达的是全段前S1蛋白，含129个氨基酸，而合成肽抗原仅合成了前S1蛋白 21～47位的27个氨基酸，无疑前者的抗原决定簇多于后者，使检出率大为增高。另外前S1全段多肽的疏水氨基酸含量远高于合成肽抗原，这就使得待检血清IgG的非特异性粘附大为减少，使基因抗原包被孔的阴性背景D值低于合成肽包被孔，这也是基因抗原的相对灵敏度高于合成肽抗原的原因之一。该产物的问世大大改善了前S1抗体的检测效果，对乙肝的诊断和预后判断均有一定的意义。■
作者简介:郭葆玉(1951-),男(汉族),博士,教授
【收稿日期】 1999-11-09
【修回日期】 2000-02-24, 百拇医药