重链可变区基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选
作者：阎岩 白文涛 徐志凯 罗雯 张芳琳 吴兴安 刘勇 王海涛
单位：阎岩 白文涛 徐志凯 罗雯 张芳琳 吴兴安 刘勇 王海涛( 第四军医大学微生物学教研室， 陕西西安 710032)
关键词：单链抗体；噬菌体抗体库；肾综合征出血热病；毒；亲和力；成熟
细胞与分子免疫学杂志000230摘 要:目的 构建VH基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库，并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法 采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因，并与1A8VL基因共同克隆入噬菌粒表达载体pHEN1后，构建VH基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库，然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染，用夹心ELISA检测超感染上清。结果 获得库容量约为107噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明，筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论 成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库，并获得 可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。
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中图号：Q782 文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0171-03
Construction and screening of ScFv phage repertoire with random CDR3 of VH gene
YAN Yan BAI Wen- tao XU Zhi- kai LUO Wen HANG Fang- lin WU Xing- an LIU Yong WANG Hai- tao
(Department of Microbiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China )
Abstract: Aim To construct ScFv phage repertoire with random CDR3 of VH gene and to screen phage antibodies against NP antigen of HFRS virus. Methods The VH gene of mAb 1A8 against HFRS virus was amplified with random oligonucleotide primers. The ScFv gene repertoire was constructed by cloning the amplified VH gene into phagemid expression vector pHEN1 containing VL gene of mAb 1A8. The phage repertoire was obtained by superinfection with helper phage VCSM13 and then screened using NP antigen of HFRS virus. Subsequent clones were selected randomly and the phagemid were rescued with VCSM13 helper phage. The supernatants harvested were detected by indirect sandwich ELISA. Results The ScFv phage repertoire with capacity of 107 was obtained. The results of indirect sandwich ELISA indicated that screened phage antibodies could react specifically with the NP antigens. Conclusion ScFv phage repertoire with higher capacity is constructed successfully and phage antibodies with binding activities to NP antigen are obtained.
, 百拇医药
Keywords: single chain Fv; phage repertoire; HFRSV; affinity; maturation
通过体外亲和力成熟技术提高抗体亲和力，主要有两种方法:一种是突变抗体的互补决定区(CDR)基因，另一种是链更替(chain shuffling)。突变抗体可变区基因的方法主要有:①随机引
物PCR突变；②Error-PronePCR突变；③应用对外源基因产生高突变的大肠杆菌菌株进行突变[1-6]。我们采用随机引物PCR突变的方法，突变抗HFRS病毒小鼠单克隆抗体(mAb)1A8重链可变区(VH)基因的互补决定区3(CDR3)，构建VH基因随机CDR3单链抗体(ScFv)噬菌体抗体库并进行筛选，以为获得具有提高结合活性的抗 体基因奠定基础。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 ScFv的表达载体pHEN1，由张劲一博士惠赠。1A8pHEN1为本室将抗HFRS病毒mAb1A8ScFv基因克隆入表达载体pHEN1;1A8VHSfi为mAb1A8的VH基因克隆入pUC18；1A8VHXho为1A8VHSfi改建。用EcoRI和BstEII酶切、补平、连接后，所得克隆无VH基因J区的BstEII酶切位点。HuVH/pUC为一人抗体VH基因克隆入1A8VHSfi。以上载体除pHEN1外，均为本室克隆和构建[8,9]。菌种采使用E.coliXL1-Blue。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建 以质粒1A8pHEN1为模板，用引物Mo5和ScF进行PCR扩增。引物均为本室设计并由宝生物公司合成，序列 如下：
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PCR的反应条件为：100μL体积中，含引物各50pmol，94.5℃60s，50℃60s，72℃60s，共35个循环。将扩增产物用NcoI和XhoI酶切后，克隆入相应酶切的表达载体pHEN1。酶切鉴定筛选出的阳性克隆，命名为LVL/pHEN1。用NcoI和BstEII酶切HuVH/pUC，回收约360bp的人VH基因，克隆入相应酶切的LVL/pHEN1中，酶切鉴定筛选出的阳性克隆，命名为HuVH-LVL/pHEN1。
1.2.2 VH基因的扩增和噬菌体抗体库的构建 根据抗体的基因结构设计扩增VH基因的随机引物，VHFRam6含有可编码6个随机 的碱基，其序列如下:
以微量1A8VHXho质粒为模板，进行PCR扩增(扩增条件同上)。将PCR产物用NcoI和BstEII酶切。回收纯化后，取约5μg的片段与约1μg的相应酶切的HuVH-LVL/pHEN1连接，用电穿孔法转化E.coliXL1-Blue，提取质粒，酶切鉴定确定克隆的效率。用辅噬菌体VCSM13(效价约1015pfu/L)超感染，所得上清即为噬菌体抗体库。
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1.2.3 噬菌体抗体库的筛选及初步鉴定用mAb1A8的腹水(1∶1000)包被ELISA板，经30g/L脱脂奶粉封闭后，依次加入HFRS病毒核蛋白(NP)抗原(购于兰州生物制品研究所)和噬菌体抗体库上清孵育后，用100μL0.1mol/LHCl-甘氨酸(pH2.2)洗脱，并以6μL2mol/LTris中和。于每100μL洗脱液中，加入200μL新鲜的XL1-Blue，并按一定稀释度涂布于90mm氨苄平板计算菌落数。其余加入2×YT培养液至10mL，置37℃摇床培养过夜。重复上述筛选过程3次，随机挑取筛选出的菌落，用辅噬菌体VCSM13超感染。然后用ELISA间接夹心法检测超感染的上清。ELISA中所用的H RP-antiM13为Pharmacia公司产品。
2 结果
2.1 表达载体的构建 用引物Mo5和ScF扩增表达载体1A8pHEN1，所得基因为VHJ-linker-VL。VHJ为VH基因中J区的部分序列，linker编码的氨基酸为(Gly4Ser)3。将扩增产物用NcoI和XhoI 酶切后，克隆入表达载体pHEN1。用HindIII和XhoI酶切鉴定，可切出约500bp的片段(HindIII和NcoI间有108bp的前导肽基因)，结果见图1中的F。将VH基因用NcoI和BstEII直接克隆入该载体的相应位点，即可构建ScFv基因的表达载体。将人VH基因克隆入上述表达载体后，获得的HuVH-LVL/pHEN1，可增加NcoI和BstEII间的距离，有利于提高克隆的效率。克隆的人VH基因与HFRS病毒抗原 无结合活性。
, 百拇医药
2.2 噬菌体抗体库的构建 将随机CDR3引物扩增的mAb1A8VH基因克隆入上述表达载体，转化后总菌落数约为1.4×107，不必挑取单菌落，即可直接提取质粒进行酶切鉴定(结果见图1，载体的部分序列见图2)。因mAb1A8VH基因含有BamHI， HindIII和XhoI的酶切位点(序列见参考文献[8])，因此，将无插入片段的克隆用HindIII和BamH<
I>I酶切可切出约1.5kb的片段；含有插入片段的克隆可切出 约1.2kb的片段(图1中的B)。应用HindIII和XhoI鉴定不含插入片段和含插入片段的克隆，可分别切出约830bp和520bp的片段(图1中的D)；用NcoI和NotI只可切出约740bp的ScFv基因(图1中的C)。从上述结果可见，含有插入片段的克隆切出的片段，较不含插入片段的克隆切出的片段量大得多，估 计克隆效率至少达80%，因此库容量>107。
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图1 ScFv基因抗体库的酶切鉴定
Fig1 Identification of ScFv gene repertoire
with restriction en-zyme digestion
A:DNA marker λ NDA EcoR I+Hind III;
B:Digestion with Hind Ⅲ+BamH I;C:Digestion with
Nco I+Not I;D:Digestion with Hind Ⅲ+Xho I;E:
DNA marker pGEM7zf Hae III;F:Digestion of recombinant
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phagemid LVL/PHEN1 with Hind III+BamH I.
图2 噬菌粒表达载体pHEN1，LVL/pHEN1和
ScFv基因抗体库的部分 序列及克隆位点
Fig2 Partial sequence and cloning sites of pHEN1,LVL/pHEN1 and ScFv gene repertoire
A:Sequence of phagemid expression vector pHEN1 and cloning sites;
B:Squence of recombinant phagemid LVL/pHEN1 and cloning sites;
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C:Sequence of ScFv gene repertire and cloning sites.
2.3 噬菌体抗体库的筛选及初步鉴定 经3轮筛选后，每孔可洗脱出的菌落数>3×105；而未加抗原的孔只可洗脱出约5×103的菌落。随机挑取筛选的菌落，用辅噬菌体VCSM13超感染后，用间接ELISA夹心法检测超感染上清，检测出的多个克隆与HFRS病毒NP抗原均有结合活性，A490nm值最高达0.94；阴性孔(不加抗原)的A490nm值则为0.16，表明筛选出的克隆可在噬菌体表面表达与HFRS病毒有结合活性的ScFv。
3 讨论
在科研和临床实践中，高亲和力的抗体具有广泛的用途，应用基因工程技术获得的抗体通常亲和力不高，而近年来出现的体外亲和力成熟技术则为解决这一问题提供了新的手段。体外亲和力成熟技术之一，是在体外使抗体的可变区基因发生突变，特别是VH基因中的CDR3区突变，然后用噬菌体抗体库技术对突变的抗体基因进行筛选，以获得高亲和力的抗体基因。
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应用体外亲和力成熟技术的关键，是突变噬菌体抗体库的构建和筛选。我们根据抗体中CDR3的基因结构，设计了随机引物。其特点是利用抗体重链V区基因末端保守的氨基酸序列“YYCAR”作为引物和V区相匹配的区域，含有6个随机氨基酸，并带有J区3个相对保守的氨基酸“FDY”，使CDR3的长度为9个氨基酸。为便于克隆，引物随机区域的碱基设计不包含NcoI和BstEII等酶切位点。为防止PCR扩增及克隆时带入原有的VH基因，我们将含有mAb1A8VH基因的质粒进行了改建，使其不含BstEII酶切位点，以保证克隆的基因均为PCR产物。构建抗体库的难点之一，是获得足够的库容量。抗体库容量越大，越容易筛选出高亲和力的抗体，6个随机氨基酸需构建8.6×107的噬菌体抗体库，才能包含所有氨基酸编码序列。限于条件本文只构建成功约107的抗体库，约为所需库容量的1/8。提高库容量的方法，可通过改进技术条件和进行多次克隆，但库容量的提高也有限。Waterhouse等[7]报道，用组合感染和体内重组技术，扩大噬菌体抗体库的库容量，可使噬菌体抗体库的库容量达到至少1010。我们应用随机引物PCR法，扩增了抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因，并构建了VH基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库。通过对噬菌体抗体库的筛选，我们得到了多个可与HFRS病毒NP抗原有结合活性的克隆，对其活性的测定及亲和力是否提高尚在鉴定中。
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基金项目：国家自然科学基金资助，No.39700134
作者简介：阎岩,男,34岁,讲师,博士西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526
参考文献：
[1] Barbas CF, Bain JD, Hoekstra DM, et al. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89: 4457- 4461.
[2] Gram H, Marconi L, Barbas CF, et al. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89: 3576- 3580.
, 百拇医药
[3] Low NM, Holliger PH,Winter G. Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain[J]. J Mol Biol, 1996; 260(3): 359- 368.
[4] Kang AS, Jones TM,Burton DR. Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991; 88: 11120- 11123.
[5] Pini A, Viti F, Santucci A, et al. Design and use of a phage display library[J]. J Bio Chem, 1998; 273(34): 21769- 21776.
, 百拇医药
[6] Hoogenboom HR, Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applications[J]. Immunotechnology, 1998; 4(1):1- 20.
[7] Waterhouse P, Griffiths A, Johnson KS， et al. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires[J]. Nucleic Acids Res, 1993; 21(9): 2265- 2266.
[8]阎岩，徐志凯，姜绍谆,等.在噬菌体表面表达抗HFRS病毒单克隆抗体1A8单链抗体[J].中华实验和临床病毒学杂志,1997 ;11(增刊):138-140.
[9]阎岩，徐志凯，姜绍谆,等.人抗体可变区基因的克隆及序列分析[J].中华实验和临床病毒学杂志[J],1997;11(增刊): 141-143.
收稿日期：1999-10-09
修回日期：1999-10-25, http://www.100md.com
单位：阎岩 白文涛 徐志凯 罗雯 张芳琳 吴兴安 刘勇 王海涛( 第四军医大学微生物学教研室， 陕西西安 710032)
关键词：单链抗体；噬菌体抗体库；肾综合征出血热病；毒；亲和力；成熟
细胞与分子免疫学杂志000230摘 要:目的 构建VH基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库，并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法 采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因，并与1A8VL基因共同克隆入噬菌粒表达载体pHEN1后，构建VH基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库，然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染，用夹心ELISA检测超感染上清。结果 获得库容量约为107噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明，筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论 成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库，并获得 可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。
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中图号：Q782 文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0171-03
Construction and screening of ScFv phage repertoire with random CDR3 of VH gene
YAN Yan BAI Wen- tao XU Zhi- kai LUO Wen HANG Fang- lin WU Xing- an LIU Yong WANG Hai- tao
(Department of Microbiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China )
Abstract: Aim To construct ScFv phage repertoire with random CDR3 of VH gene and to screen phage antibodies against NP antigen of HFRS virus. Methods The VH gene of mAb 1A8 against HFRS virus was amplified with random oligonucleotide primers. The ScFv gene repertoire was constructed by cloning the amplified VH gene into phagemid expression vector pHEN1 containing VL gene of mAb 1A8. The phage repertoire was obtained by superinfection with helper phage VCSM13 and then screened using NP antigen of HFRS virus. Subsequent clones were selected randomly and the phagemid were rescued with VCSM13 helper phage. The supernatants harvested were detected by indirect sandwich ELISA. Results The ScFv phage repertoire with capacity of 107 was obtained. The results of indirect sandwich ELISA indicated that screened phage antibodies could react specifically with the NP antigens. Conclusion ScFv phage repertoire with higher capacity is constructed successfully and phage antibodies with binding activities to NP antigen are obtained.
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Keywords: single chain Fv; phage repertoire; HFRSV; affinity; maturation
通过体外亲和力成熟技术提高抗体亲和力，主要有两种方法:一种是突变抗体的互补决定区(CDR)基因，另一种是链更替(chain shuffling)。突变抗体可变区基因的方法主要有:①随机引
物PCR突变；②Error-PronePCR突变；③应用对外源基因产生高突变的大肠杆菌菌株进行突变[1-6]。我们采用随机引物PCR突变的方法，突变抗HFRS病毒小鼠单克隆抗体(mAb)1A8重链可变区(VH)基因的互补决定区3(CDR3)，构建VH基因随机CDR3单链抗体(ScFv)噬菌体抗体库并进行筛选，以为获得具有提高结合活性的抗 体基因奠定基础。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 ScFv的表达载体pHEN1，由张劲一博士惠赠。1A8pHEN1为本室将抗HFRS病毒mAb1A8ScFv基因克隆入表达载体pHEN1;1A8VHSfi为mAb1A8的VH基因克隆入pUC18；1A8VHXho为1A8VHSfi改建。用EcoRI和BstEII酶切、补平、连接后，所得克隆无VH基因J区的BstEII酶切位点。HuVH/pUC为一人抗体VH基因克隆入1A8VHSfi。以上载体除pHEN1外，均为本室克隆和构建[8,9]。菌种采使用E.coliXL1-Blue。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建 以质粒1A8pHEN1为模板，用引物Mo5和ScF进行PCR扩增。引物均为本室设计并由宝生物公司合成，序列 如下：
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PCR的反应条件为：100μL体积中，含引物各50pmol，94.5℃60s，50℃60s，72℃60s，共35个循环。将扩增产物用NcoI和XhoI酶切后，克隆入相应酶切的表达载体pHEN1。酶切鉴定筛选出的阳性克隆，命名为LVL/pHEN1。用NcoI和BstEII酶切HuVH/pUC，回收约360bp的人VH基因，克隆入相应酶切的LVL/pHEN1中，酶切鉴定筛选出的阳性克隆，命名为HuVH-LVL/pHEN1。
1.2.2 VH基因的扩增和噬菌体抗体库的构建 根据抗体的基因结构设计扩增VH基因的随机引物，VHFRam6含有可编码6个随机 的碱基，其序列如下:
以微量1A8VHXho质粒为模板，进行PCR扩增(扩增条件同上)。将PCR产物用NcoI和BstEII酶切。回收纯化后，取约5μg的片段与约1μg的相应酶切的HuVH-LVL/pHEN1连接，用电穿孔法转化E.coliXL1-Blue，提取质粒，酶切鉴定确定克隆的效率。用辅噬菌体VCSM13(效价约1015pfu/L)超感染，所得上清即为噬菌体抗体库。
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1.2.3 噬菌体抗体库的筛选及初步鉴定用mAb1A8的腹水(1∶1000)包被ELISA板，经30g/L脱脂奶粉封闭后，依次加入HFRS病毒核蛋白(NP)抗原(购于兰州生物制品研究所)和噬菌体抗体库上清孵育后，用100μL0.1mol/LHCl-甘氨酸(pH2.2)洗脱，并以6μL2mol/LTris中和。于每100μL洗脱液中，加入200μL新鲜的XL1-Blue，并按一定稀释度涂布于90mm氨苄平板计算菌落数。其余加入2×YT培养液至10mL，置37℃摇床培养过夜。重复上述筛选过程3次，随机挑取筛选出的菌落，用辅噬菌体VCSM13超感染。然后用ELISA间接夹心法检测超感染的上清。ELISA中所用的H RP-antiM13为Pharmacia公司产品。
2 结果
2.1 表达载体的构建 用引物Mo5和ScF扩增表达载体1A8pHEN1，所得基因为VHJ-linker-VL。VHJ为VH基因中J区的部分序列，linker编码的氨基酸为(Gly4Ser)3。将扩增产物用NcoI和XhoI 酶切后，克隆入表达载体pHEN1。用HindIII和XhoI酶切鉴定，可切出约500bp的片段(HindIII和NcoI间有108bp的前导肽基因)，结果见图1中的F。将VH基因用NcoI和BstEII直接克隆入该载体的相应位点，即可构建ScFv基因的表达载体。将人VH基因克隆入上述表达载体后，获得的HuVH-LVL/pHEN1，可增加NcoI和BstEII间的距离，有利于提高克隆的效率。克隆的人VH基因与HFRS病毒抗原 无结合活性。
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2.2 噬菌体抗体库的构建 将随机CDR3引物扩增的mAb1A8VH基因克隆入上述表达载体，转化后总菌落数约为1.4×107，不必挑取单菌落，即可直接提取质粒进行酶切鉴定(结果见图1，载体的部分序列见图2)。因mAb1A8VH基因含有BamHI， HindIII和XhoI的酶切位点(序列见参考文献[8])，因此，将无插入片段的克隆用HindIII和BamH<
I>I酶切可切出约1.5kb的片段；含有插入片段的克隆可切出 约1.2kb的片段(图1中的B)。应用HindIII和XhoI鉴定不含插入片段和含插入片段的克隆，可分别切出约830bp和520bp的片段(图1中的D)；用NcoI和NotI只可切出约740bp的ScFv基因(图1中的C)。从上述结果可见，含有插入片段的克隆切出的片段，较不含插入片段的克隆切出的片段量大得多，估 计克隆效率至少达80%，因此库容量>107。
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图1 ScFv基因抗体库的酶切鉴定
Fig1 Identification of ScFv gene repertoire
with restriction en-zyme digestion
A:DNA marker λ NDA EcoR I+Hind III;
B:Digestion with Hind Ⅲ+BamH I;C:Digestion with
Nco I+Not I;D:Digestion with Hind Ⅲ+Xho I;E:
DNA marker pGEM7zf Hae III;F:Digestion of recombinant
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phagemid LVL/PHEN1 with Hind III+BamH I.
图2 噬菌粒表达载体pHEN1，LVL/pHEN1和
ScFv基因抗体库的部分 序列及克隆位点
Fig2 Partial sequence and cloning sites of pHEN1,LVL/pHEN1 and ScFv gene repertoire
A:Sequence of phagemid expression vector pHEN1 and cloning sites;
B:Squence of recombinant phagemid LVL/pHEN1 and cloning sites;
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C:Sequence of ScFv gene repertire and cloning sites.
2.3 噬菌体抗体库的筛选及初步鉴定 经3轮筛选后，每孔可洗脱出的菌落数>3×105；而未加抗原的孔只可洗脱出约5×103的菌落。随机挑取筛选的菌落，用辅噬菌体VCSM13超感染后，用间接ELISA夹心法检测超感染上清，检测出的多个克隆与HFRS病毒NP抗原均有结合活性，A490nm值最高达0.94；阴性孔(不加抗原)的A490nm值则为0.16，表明筛选出的克隆可在噬菌体表面表达与HFRS病毒有结合活性的ScFv。
3 讨论
在科研和临床实践中，高亲和力的抗体具有广泛的用途，应用基因工程技术获得的抗体通常亲和力不高，而近年来出现的体外亲和力成熟技术则为解决这一问题提供了新的手段。体外亲和力成熟技术之一，是在体外使抗体的可变区基因发生突变，特别是VH基因中的CDR3区突变，然后用噬菌体抗体库技术对突变的抗体基因进行筛选，以获得高亲和力的抗体基因。
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应用体外亲和力成熟技术的关键，是突变噬菌体抗体库的构建和筛选。我们根据抗体中CDR3的基因结构，设计了随机引物。其特点是利用抗体重链V区基因末端保守的氨基酸序列“YYCAR”作为引物和V区相匹配的区域，含有6个随机氨基酸，并带有J区3个相对保守的氨基酸“FDY”，使CDR3的长度为9个氨基酸。为便于克隆，引物随机区域的碱基设计不包含NcoI和BstEII等酶切位点。为防止PCR扩增及克隆时带入原有的VH基因，我们将含有mAb1A8VH基因的质粒进行了改建，使其不含BstEII酶切位点，以保证克隆的基因均为PCR产物。构建抗体库的难点之一，是获得足够的库容量。抗体库容量越大，越容易筛选出高亲和力的抗体，6个随机氨基酸需构建8.6×107的噬菌体抗体库，才能包含所有氨基酸编码序列。限于条件本文只构建成功约107的抗体库，约为所需库容量的1/8。提高库容量的方法，可通过改进技术条件和进行多次克隆，但库容量的提高也有限。Waterhouse等[7]报道，用组合感染和体内重组技术，扩大噬菌体抗体库的库容量，可使噬菌体抗体库的库容量达到至少1010。我们应用随机引物PCR法，扩增了抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因，并构建了VH基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库。通过对噬菌体抗体库的筛选，我们得到了多个可与HFRS病毒NP抗原有结合活性的克隆，对其活性的测定及亲和力是否提高尚在鉴定中。
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作者简介：阎岩,男,34岁,讲师,博士西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526
参考文献：
[1] Barbas CF, Bain JD, Hoekstra DM, et al. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89: 4457- 4461.
[2] Gram H, Marconi L, Barbas CF, et al. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89: 3576- 3580.
, 百拇医药
[3] Low NM, Holliger PH,Winter G. Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain[J]. J Mol Biol, 1996; 260(3): 359- 368.
[4] Kang AS, Jones TM,Burton DR. Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991; 88: 11120- 11123.
[5] Pini A, Viti F, Santucci A, et al. Design and use of a phage display library[J]. J Bio Chem, 1998; 273(34): 21769- 21776.
, 百拇医药
[6] Hoogenboom HR, Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applications[J]. Immunotechnology, 1998; 4(1):1- 20.
[7] Waterhouse P, Griffiths A, Johnson KS， et al. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires[J]. Nucleic Acids Res, 1993; 21(9): 2265- 2266.
[8]阎岩，徐志凯，姜绍谆,等.在噬菌体表面表达抗HFRS病毒单克隆抗体1A8单链抗体[J].中华实验和临床病毒学杂志,1997 ;11(增刊):138-140.
[9]阎岩，徐志凯，姜绍谆,等.人抗体可变区基因的克隆及序列分析[J].中华实验和临床病毒学杂志[J],1997;11(增刊): 141-143.
收稿日期：1999-10-09
修回日期：1999-10-25, http://www.100md.com