鼠源抗胃癌抗体轻链可变区基因克隆及其结构分析
作者：李陕区 张康泰 闫小君
单位：李陕区(第四军医大学基因诊断技术研究所,陕西 西安 710033)；张康泰(解放军451医院医教部)；闫小君(第四军医大学基因诊断技术研究所,陕西 西安 710033)
关键词：胃肿瘤；抗体；杂交瘤细胞；克隆
第四军医大学学报000549 摘 要: 目的 扩增与人胃癌细胞特异结合的鼠源性抗体轻链可变区基因,并对其基因序列进行分析. 方法 用RT-PCR方法从分泌鼠源抗人胃癌抗体的杂交瘤细胞扩增出抗体轻链可变区基因, 克隆到pGEM-T载体, 测序仪测定其基因序列并对其结构进行分析. 结果 所获得的基因由354 bp组成,编码118个氨基酸,序列分析证实该基因可变区序列符合小鼠Ig轻链可变区的氨基酸序列特征. 结论 获得的鼠源抗胃癌抗体轻链可变区基因为κⅢ家族,该结果为进一步探讨人胃癌的免疫治疗研究奠定了基础.
, 百拇医药
中图号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0095-03
Cloning and constructive analysis of mouse anti-gastric-cancer antibody light chain variable region gene fragments
LI Shan-Qu, YAN Xiao-Jun
(Institute of Gene Diagnostic Technique of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
ZHANG Kang-Tai
, 百拇医药
(Administration of Medicine and Education, Chinese PLA 451st Hospital)
Abstract： AIM To amplify and to analyze the light chain variable gene fragments (VH) of mouse anti-gastric-cancer antibody. METHODS VH gene fragments of mouse anti-gastric-cancer antibody were amplified by RT-PCR method by using RNA purified from antibody producing hybridoma cells, and further cloned into pGEM-T vector which were then sequenced. RESULTS VH gene fragment consisted of 354 bp and encoded 118 amino acid residues and the amino acid sequences of variable region was in agreement with the characteristics of the amino acid present in the mouse Ig variable region. CONCLUSION The light chain variable gene fragments of mouse anti-gastric-cancer antibody belong to κⅢ subgroup and the successful cloning of this gene fragment might be used in the experiments of immunotherapeutic study of gastric-cancer.
, 百拇医药
Keywords: gastric-neoplasm; antibody; hybridoma cell; clone
0 引言
胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，部分患者的预后差. 长期存活率较低. 化疗有其局限性，尚不能完全解决转移和复发的问题. 单链抗体的应用，无论在细胞内封闭癌蛋白,还是在体内杀伤肿瘤细胞方面均显示了广泛的应用前景[1,2],为探讨单链抗体技术在该肿瘤治疗中的应用意义，我们采用RT-PCR方法进行了抗胃癌抗体轻链可变区基因的克隆及分析.
1 材料和方法
1.1 杂交瘤细胞系 小鼠杂交瘤细胞系3D5E为本室制备,该细胞可分泌抗人胃癌细胞mAb, 常规培养于100 mL.L-1小牛血清的RPMI 1640培养液中. 扩增鼠源性轻链VL基因的PCR引物合成于上海生物工程有限公司[5端引物为， P1： 5-CCAG(TA)T(CG)(CT)GAGCTC(GC)(TA)(GC)(AC)T(GC)AC(CA)CAG(AT) CTCCA-3， P2: 5-CCAGTTCCGAGCTCGT(TG)(GT)TGAC(GT)CAG(GC)(AC)(AG)(TC)C(TC)-3; 3端引物为： 5-CCCAAGCTTCCAGGG(AG)CCA(AG)(GT)GGATA(AG)ACIG(AG)TGG-3]. 逆转录酶及PCR所用试剂均为Gibco公司产品. pGEM-T载体为Promega公司产品.
, 百拇医药
1.2 细胞总RNA提取及RT-PCR 取2×107杂交瘤细胞，TRIzol法提取细胞总RNA (Promega Inc Kit,及实验指南). 以细胞总RNA为模板进行cDNA第1链的合成： 3.5 μL RNA, 2 μL 5×逆转录缓冲液，1 μL Oligo(dT12),70℃保温10 min,冰上2 min，加入1 μL 100 mmol.L-1 DTT, 1 μL dNTP, 1 μL RNase inhibitor, 0.5 μL Moloney鼠白血病病毒逆转录酶，37℃反应1 h. 以cDNA第1链为模板，PCR扩增7F6B抗体Fad段基因. PCR反应体系为：模板RNA 5 μL，10×PCR缓冲液5 μL, 2.5 mmol.L-1 dNTP 5 μL, 5 μmol.L-1引物5 μL, Taq DNA聚合酶1 μL,加水至50 μL; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 40 s,反应30个循环. 15 g.L-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物.
, 百拇医药
1.3 PCR产物的克隆及鉴定 上述PCR产物于15 g.L-1低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后, 切取350 bp大小左右的条带, Wazard Miniprep柱子(Promega Inc Kit)回收纯化, 取0.3～0.5 μg回收的PCR产物与100 ng pGEM-T载体进行连接反应, 16℃连接16 h. 转化JM109感受态细菌并经蓝白筛选挑取阳性克隆进行扩大培养. 提取重组质粒进行SacI及HindⅢ双酶切鉴定,同时进行序列测定及分析.
2 结果
2.1 3D5E抗体VL基因扩增 应用针对鼠抗体VL基因5端及3端设计的引物,从3D5E细胞扩增出约350 bp的DNA片段(Fig 1),其DNA片段的大小与预期鼠源性抗体VL基因大小一致.
2.2 3D5E抗体VL基因扩增产物的克隆及鉴定 将3D5E抗体VL基因与pGEM-T载体的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 得到数十个白色转化菌落.挑选十个白色菌落, 提取质粒DNA, 经SacI及HindⅢ双酶切鉴定,可得到350 bp大小的插入片段(Fig 2).
, 百拇医药
2.3 3D5E抗体VL基因测序结果 3D5E基因测序结果表明, 该基因为开放读框,编码118个氨基酸, 与Gene Bank中已发表的序列比较未发现有与其序列相同的基因，说明其为新发现的基因序列. 该基因属于鼠Ig轻链κⅢ家族成员，有明确的4个FR区和3个CDR区， 并有维持抗体可变区空间结构所必需的两个特征性的半胱氨酸残基(Fig 3)，表明所得VL基因的序列符合鼠抗体可变区特征.
图1 3D5E VL基因RT-PCR扩增结果
Fig 1 RT-PCR amplification of 3D5E antibody VL gene
Lane 1: VL gene; Lane 2: PCR marker.
, 百拇医药
图2 重组pGEM-T质粒的XbaI及HindⅢ酶切鉴定
Fig 2 XbaI and HindⅢ enzyme digestion of recombinant pGEM-T plasmid
Lane 1～3: Recombinant plasmid from different colonies digested with XbaI and HindⅢ enzyme; Lane 4: PCR marker.
图3 3D5E抗体轻链可变区基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig 3 3D5E light chain variable region nucleotide and deduced amino acid sequences
, 百拇医药
3 讨论
随着现代分子生物学和免疫的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点[3,4]，它以分子质量小、穿透力强、较好保持抗原亲和性及特异性、免疫原性低、体内半衰期短，易与效应分子相连构成多种新功能的抗体分子如产生双特性Ab及构建免疫毒素等为特点，单链抗体是肿瘤免疫治疗的重要手段. 应用单链抗体进行实体肿瘤治疗的研究已有较多报道，部分抗肿瘤单链抗体已进入临床I, II期试验阶段，如抗癌基因c-erbB-2, bcl-2的单链抗体； 抗结肠癌(CC49)单链抗体及抗人CD40单链抗体(BD1-G28-5)等[5-8]. 上述针对不同起源肿瘤的单链抗体应用研究显示出巨大潜能，但对于不同肿瘤之间或相同肿瘤不同个体之间其应用于临床治疗的效果不尽相同. 因此，获取针对不要同抗原决定族的多种单链抗体的可变区基因具有重要理论及临床实际意义. 我们所克隆的抗胃癌单抗可变区基因与上述基因相比较同源性较低(20%～38%)，表明我们所扩增并克隆的抗胃癌基因为具有抗特异抗原决定族的新基因.
, 百拇医药
本结果表明，以RT-PCR方法从杂交瘤细胞克隆单抗可变区基因是一种可靠、简便的获取基因工程抗体基因的方法. 但该方法中杂交瘤产生抗体的特异性决定着单链抗体的应用效果. 我们以鼠源性抗胃癌mAb杂交瘤细胞中RNA为模板，应用RT-PCR方法成功地扩增并克隆了抗体轻链可变区基因；经序列分析，具有鼠源性VL基因的编码特征，该结果为胃癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
作者简介：李陕区(1961-)， 男(汉族)， 陕西省兴平县人. 生物化学硕士. Tel. (029)3374724
参考文献：
[1] Werge TM, Baldaari CT, Telford JL. Intracellular single chain Fv antibody inhibits Ras activity in T-cell antigen receptor stimulated Jurkat cells [J]. FEBS, 1994;351(1):393-396.
, 百拇医药
[2] Montano X, Jimenez A. Intracellular expression of the monoclonal anti-ras antibody Y13-259 blocks the transforming activity of ras oncogenes [J]. Cell Growth Differentiat, 1995;6(2):597-605.
[3] Goldberg MR, Heumbrook DC, Russo P et al. Phase I clinical study of the recombinant oncotoxin TP40 in superficial bladder cancer [J]. Clin Cancer Res, 1995;1(1):57-62.
[4] Rodrigues ML, Presta LG, Kotts CE et al. Development of a humanized disulfide-stabilized anti-p185 Fv-beta-lactamase fusion protein for activation of a celphalosporin doxorubicin prodrug [J]. Cancer Res, 1995;55(1):63-67.
, http://www.100md.com
[5] Grim J, Deshane J, Siegal GP et al. The level of erbB2 expression predicts sensitivity to the cytotoxic effects of an intracellular anti-erbB2 sFv [J]. J Mol Med, 1998;76(6):451-458.
[6] Piche A, Grim J, Rancourt C et al. Modulation of Bcl-2 protein levels by an intracellular anti-Bcl-2 single chain [J]. Cancer Res, 1998; 58(10):2134-2140.
[7] Larson SM, E1 Shirbiny AM, Divgi CR et al. Single chain antigen bindign protein (sFv CC49): First human studies in colorectal carcinoma metastatic to liver [J]. Cancer, 1997; 80(12 Suppl):2458-2468.
[8] Francisco JA, Gawlak SL, Siegall CB. Construction, expression, and characterization of BD1-G28-5 sFv, a single sFv [J]. J Biol Chem, 1997; 272(39): 24165-24169.
收稿日期：2000-03-13； 修回日期：2000-04-12, 百拇医药
单位：李陕区(第四军医大学基因诊断技术研究所,陕西 西安 710033)；张康泰(解放军451医院医教部)；闫小君(第四军医大学基因诊断技术研究所,陕西 西安 710033)
关键词：胃肿瘤；抗体；杂交瘤细胞；克隆
第四军医大学学报000549 摘 要: 目的 扩增与人胃癌细胞特异结合的鼠源性抗体轻链可变区基因,并对其基因序列进行分析. 方法 用RT-PCR方法从分泌鼠源抗人胃癌抗体的杂交瘤细胞扩增出抗体轻链可变区基因, 克隆到pGEM-T载体, 测序仪测定其基因序列并对其结构进行分析. 结果 所获得的基因由354 bp组成,编码118个氨基酸,序列分析证实该基因可变区序列符合小鼠Ig轻链可变区的氨基酸序列特征. 结论 获得的鼠源抗胃癌抗体轻链可变区基因为κⅢ家族,该结果为进一步探讨人胃癌的免疫治疗研究奠定了基础.
, 百拇医药
中图号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0095-03
Cloning and constructive analysis of mouse anti-gastric-cancer antibody light chain variable region gene fragments
LI Shan-Qu, YAN Xiao-Jun
(Institute of Gene Diagnostic Technique of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
ZHANG Kang-Tai
, 百拇医药
(Administration of Medicine and Education, Chinese PLA 451st Hospital)
Abstract： AIM To amplify and to analyze the light chain variable gene fragments (VH) of mouse anti-gastric-cancer antibody. METHODS VH gene fragments of mouse anti-gastric-cancer antibody were amplified by RT-PCR method by using RNA purified from antibody producing hybridoma cells, and further cloned into pGEM-T vector which were then sequenced. RESULTS VH gene fragment consisted of 354 bp and encoded 118 amino acid residues and the amino acid sequences of variable region was in agreement with the characteristics of the amino acid present in the mouse Ig variable region. CONCLUSION The light chain variable gene fragments of mouse anti-gastric-cancer antibody belong to κⅢ subgroup and the successful cloning of this gene fragment might be used in the experiments of immunotherapeutic study of gastric-cancer.
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Keywords: gastric-neoplasm; antibody; hybridoma cell; clone
0 引言
胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，部分患者的预后差. 长期存活率较低. 化疗有其局限性，尚不能完全解决转移和复发的问题. 单链抗体的应用，无论在细胞内封闭癌蛋白,还是在体内杀伤肿瘤细胞方面均显示了广泛的应用前景[1,2],为探讨单链抗体技术在该肿瘤治疗中的应用意义，我们采用RT-PCR方法进行了抗胃癌抗体轻链可变区基因的克隆及分析.
1 材料和方法
1.1 杂交瘤细胞系 小鼠杂交瘤细胞系3D5E为本室制备,该细胞可分泌抗人胃癌细胞mAb, 常规培养于100 mL.L-1小牛血清的RPMI 1640培养液中. 扩增鼠源性轻链VL基因的PCR引物合成于上海生物工程有限公司[5端引物为， P1： 5-CCAG(TA)T(CG)(CT)GAGCTC(GC)(TA)(GC)(AC)T(GC)AC(CA)CAG(AT) CTCCA-3， P2: 5-CCAGTTCCGAGCTCGT(TG)(GT)TGAC(GT)CAG(GC)(AC)(AG)(TC)C(TC)-3; 3端引物为： 5-CCCAAGCTTCCAGGG(AG)CCA(AG)(GT)GGATA(AG)ACIG(AG)TGG-3]. 逆转录酶及PCR所用试剂均为Gibco公司产品. pGEM-T载体为Promega公司产品.
, 百拇医药
1.2 细胞总RNA提取及RT-PCR 取2×107杂交瘤细胞，TRIzol法提取细胞总RNA (Promega Inc Kit,及实验指南). 以细胞总RNA为模板进行cDNA第1链的合成： 3.5 μL RNA, 2 μL 5×逆转录缓冲液，1 μL Oligo(dT12),70℃保温10 min,冰上2 min，加入1 μL 100 mmol.L-1 DTT, 1 μL dNTP, 1 μL RNase inhibitor, 0.5 μL Moloney鼠白血病病毒逆转录酶，37℃反应1 h. 以cDNA第1链为模板，PCR扩增7F6B抗体Fad段基因. PCR反应体系为：模板RNA 5 μL，10×PCR缓冲液5 μL, 2.5 mmol.L-1 dNTP 5 μL, 5 μmol.L-1引物5 μL, Taq DNA聚合酶1 μL,加水至50 μL; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 40 s,反应30个循环. 15 g.L-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物.
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1.3 PCR产物的克隆及鉴定 上述PCR产物于15 g.L-1低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后, 切取350 bp大小左右的条带, Wazard Miniprep柱子(Promega Inc Kit)回收纯化, 取0.3～0.5 μg回收的PCR产物与100 ng pGEM-T载体进行连接反应, 16℃连接16 h. 转化JM109感受态细菌并经蓝白筛选挑取阳性克隆进行扩大培养. 提取重组质粒进行SacI及HindⅢ双酶切鉴定,同时进行序列测定及分析.
2 结果
2.1 3D5E抗体VL基因扩增 应用针对鼠抗体VL基因5端及3端设计的引物,从3D5E细胞扩增出约350 bp的DNA片段(Fig 1),其DNA片段的大小与预期鼠源性抗体VL基因大小一致.
2.2 3D5E抗体VL基因扩增产物的克隆及鉴定 将3D5E抗体VL基因与pGEM-T载体的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 得到数十个白色转化菌落.挑选十个白色菌落, 提取质粒DNA, 经SacI及HindⅢ双酶切鉴定,可得到350 bp大小的插入片段(Fig 2).
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2.3 3D5E抗体VL基因测序结果 3D5E基因测序结果表明, 该基因为开放读框,编码118个氨基酸, 与Gene Bank中已发表的序列比较未发现有与其序列相同的基因，说明其为新发现的基因序列. 该基因属于鼠Ig轻链κⅢ家族成员，有明确的4个FR区和3个CDR区， 并有维持抗体可变区空间结构所必需的两个特征性的半胱氨酸残基(Fig 3)，表明所得VL基因的序列符合鼠抗体可变区特征.
图1 3D5E VL基因RT-PCR扩增结果
Fig 1 RT-PCR amplification of 3D5E antibody VL gene
Lane 1: VL gene; Lane 2: PCR marker.
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图2 重组pGEM-T质粒的XbaI及HindⅢ酶切鉴定
Fig 2 XbaI and HindⅢ enzyme digestion of recombinant pGEM-T plasmid
Lane 1～3: Recombinant plasmid from different colonies digested with XbaI and HindⅢ enzyme; Lane 4: PCR marker.
图3 3D5E抗体轻链可变区基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig 3 3D5E light chain variable region nucleotide and deduced amino acid sequences
, 百拇医药
3 讨论
随着现代分子生物学和免疫的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点[3,4]，它以分子质量小、穿透力强、较好保持抗原亲和性及特异性、免疫原性低、体内半衰期短，易与效应分子相连构成多种新功能的抗体分子如产生双特性Ab及构建免疫毒素等为特点，单链抗体是肿瘤免疫治疗的重要手段. 应用单链抗体进行实体肿瘤治疗的研究已有较多报道，部分抗肿瘤单链抗体已进入临床I, II期试验阶段，如抗癌基因c-erbB-2, bcl-2的单链抗体； 抗结肠癌(CC49)单链抗体及抗人CD40单链抗体(BD1-G28-5)等[5-8]. 上述针对不同起源肿瘤的单链抗体应用研究显示出巨大潜能，但对于不同肿瘤之间或相同肿瘤不同个体之间其应用于临床治疗的效果不尽相同. 因此，获取针对不要同抗原决定族的多种单链抗体的可变区基因具有重要理论及临床实际意义. 我们所克隆的抗胃癌单抗可变区基因与上述基因相比较同源性较低(20%～38%)，表明我们所扩增并克隆的抗胃癌基因为具有抗特异抗原决定族的新基因.
, 百拇医药
本结果表明，以RT-PCR方法从杂交瘤细胞克隆单抗可变区基因是一种可靠、简便的获取基因工程抗体基因的方法. 但该方法中杂交瘤产生抗体的特异性决定着单链抗体的应用效果. 我们以鼠源性抗胃癌mAb杂交瘤细胞中RNA为模板，应用RT-PCR方法成功地扩增并克隆了抗体轻链可变区基因；经序列分析，具有鼠源性VL基因的编码特征，该结果为胃癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
作者简介：李陕区(1961-)， 男(汉族)， 陕西省兴平县人. 生物化学硕士. Tel. (029)3374724
参考文献：
[1] Werge TM, Baldaari CT, Telford JL. Intracellular single chain Fv antibody inhibits Ras activity in T-cell antigen receptor stimulated Jurkat cells [J]. FEBS, 1994;351(1):393-396.
, 百拇医药
[2] Montano X, Jimenez A. Intracellular expression of the monoclonal anti-ras antibody Y13-259 blocks the transforming activity of ras oncogenes [J]. Cell Growth Differentiat, 1995;6(2):597-605.
[3] Goldberg MR, Heumbrook DC, Russo P et al. Phase I clinical study of the recombinant oncotoxin TP40 in superficial bladder cancer [J]. Clin Cancer Res, 1995;1(1):57-62.
[4] Rodrigues ML, Presta LG, Kotts CE et al. Development of a humanized disulfide-stabilized anti-p185 Fv-beta-lactamase fusion protein for activation of a celphalosporin doxorubicin prodrug [J]. Cancer Res, 1995;55(1):63-67.
, http://www.100md.com
[5] Grim J, Deshane J, Siegal GP et al. The level of erbB2 expression predicts sensitivity to the cytotoxic effects of an intracellular anti-erbB2 sFv [J]. J Mol Med, 1998;76(6):451-458.
[6] Piche A, Grim J, Rancourt C et al. Modulation of Bcl-2 protein levels by an intracellular anti-Bcl-2 single chain [J]. Cancer Res, 1998; 58(10):2134-2140.
[7] Larson SM, E1 Shirbiny AM, Divgi CR et al. Single chain antigen bindign protein (sFv CC49): First human studies in colorectal carcinoma metastatic to liver [J]. Cancer, 1997; 80(12 Suppl):2458-2468.
[8] Francisco JA, Gawlak SL, Siegall CB. Construction, expression, and characterization of BD1-G28-5 sFv, a single sFv [J]. J Biol Chem, 1997; 272(39): 24165-24169.
收稿日期：2000-03-13； 修回日期：2000-04-12, 百拇医药