抗辐射菌DNA结合蛋白的氨基酸序列分析*
作者：王明锁 杜泽吉 杨占山 汪涛
单位：苏州医学院放射毒理学教研室,苏州215007
关键词：抗辐射菌；D.radiodurans；DNA结合蛋白；氨基酸序列；辐射耐受性
苏州医学院学报991204 摘要 目的 对抗辐射菌D.radioudurans的DNA结合蛋白(DBP)进行N-末端氨基酸(AA)序列分析，探讨其抗辐射分子学组成的特性。方法 采用地高辛(DIG)标记染色体DNA作为探针，South-Western印迹法检测DBP，在N-端AA自动序列仪上分析AA序列。结果 野生型抗辐射菌存有8种DBP的特性蛋白(分子量分别为122、93、33、29、16、15、14和12kd)；AA序列分析发现其中93kd和33kd可能为新的蛋白质；两种新DBP的表达水平随不同培养基和培养时间而变化。结论 抗辐射菌的DBP，尤其是93kd和33kd的DBP与其辐射耐受性可能有密切关系。
, 百拇医药
中图法分类 R811.5；Q691.9
Analysis of Amino Acid Sequence of the DNA-binding
Proteins from Radioresistant Bacterium
Wang Mingsuo,Du Zeji,Yang Zhanshan,et al
(Department of Radiation Medicine,Suzhou Medical College,Suzhou,21 5007)
Abstract Objective Analysis was carried out on the N-terminal amino acid (AA) sequence in DNA-binding proteins (DBPs) from a radioresistant bacterium, i.e.Deinococcus radiodurans (D.radiodurans),for purposes of explo ring their radioresistant characteristics of molecular components.Methods The DBPs from three radioresistant bacteria were determined by South- Western bloting using the chromosomal DNA labeled with Digoxin (DIG) as a probe. The N-terminal AA sequence in some DBPs was analysed by a AA autosequencer.Results There were eight DPBs in three wild type of D.radfodurans ,and their molecular weights were 122、93、33、29、16、15、14 and 12kd respect ivel y.The DBPs of 93 and 33 kd from wild type of KR1 might be two novel proteins acc ording to results of the AA sequence analysis.The expression level of the two DB Ps changed with different culture media and culturing time.Conclusion The DPBs from radioresistant bacterium,especially the DBPs of 93 and 33 kd, were closely related to the radioresistance of D.radiodurans.
, 百拇医药
Key words radioresistant bacterium; D.radiodurans; D NA-binding proteins; kmino acid sequence; radioresistance
抗辐射菌Deinococcus radiodurans是一种微小的球菌，由于其对电离辐射和许多化学诱变剂都具有极强的耐受性[1]，近来倍受放射生物学家的关注，且普遍认为该菌的辐射耐受性缘自于其有超常的DNA修复系统[2]。在DNA修复酶类等蛋白质中，有一些能与DNA结合者称之为DNA结合蛋白(DNA-bindingProtein,DBP)。以往的研究已表明，DBP含量与DNA的损伤和修复功能密切相关，但关于抗辐射菌的DBP及其在抗辐射分子学组成特性等的研究目前报道甚少。本文拟从DBP检测及其AA序列分析上作一初探。
1 材料和方法
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1.1 细菌株及培养条件：抗辐射菌Deinococcus radiodurans为野生型的MR1、KR1和Sark3种；大肠杆菌(E.Coli)为JM109；嗜热菌(T.thermophilius)为YT1；枯草杆菌(B.Subtilis)为RM125。TGY培养基：0.5%胰蛋白胨(Difco)，0.1%葡萄糖，0.3%酵母提取物(Difco)；LB-L培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.085mol/LNaCl；TM培养基∶0.4%胰蛋白胨，0.2%酵母提取物，0.017mol/LNaCl。抗辐射菌、嗜热菌分别生长在TGY、TM培养基中，培养温度分别为30℃和65℃；大肠杆菌和枯草杆菌均生长在LB-L培养基中，培养温度为37℃。
1.2 菌体蛋白粗提物的制备：经培养一定时间后的各种细菌，离心收获，PBS洗2次，4℃下用超声波仪(Beckman)破碎，低温离心(1500r/min)30min，收集上清液备用。
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1.3 染色体DNA的分离及地高辛(DIG)标记DNA探针的制备：按Saito等[3]方法分离纯化抗辐射菌DNA。分离后的DNA经内切酶Sau3AⅠ(Takara，Jp)部分消化后，用DIG标记试剂盒(Takara)，按说明书制备DIG标记的DNA探针，备South-Western印迹之用。
1.4 South-Western印迹法检测DBP：细菌的蛋白提取物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转印到PVdF(聚偏二氟乙烯)膜上(4℃，150mA,90min)，按照South-Western印迹检测试剂盒(Takara)的使用说明，检测DBP。
1.5 氨基酸(AA)序列分析：采用Edman降解法，取其PTH-AA衍生物在N-端AA自动序列仪(470A，ABI公司)上进行分析。
2 结果
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2.1 野生型抗辐射菌、嗜热菌、大肠杆菌及枯草杆菌等菌株DBP的检测：取培养48h后的细菌培养物，离心收获细胞，制备蛋白提取物，SDS-PAGE(凝胶浓度为15%)电泳。South-Western印迹法检测的DBP见图1。
图1 野生型抗辐射菌的DBP
从图1看出3种野生型的抗辐射菌(MR1、KR1Sark)均可检测到8种DBP，它们的分子量分别为122、93、33、29、16、15、14和12kd。而嗜热菌、大肠杆菌均没有检测到相应的DBP，枯草杆菌在33kd处可检测到1个弱信号。
2.2 93kd和33kd两种DBP的N-末端氨基酸序列分析：取在TGY中培养48～72h的KR1制备蛋白提取物，转印到PVdF膜上，分别切下93kd和33kd蛋白条带(各4～6个平行样)，作N-末端氨基酸序列分析，其结果如下：
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93kd：MLKEDAARKTYVSPAVWEGCGREKFPVLNS-
33kd：MWPFGKSTADRVKDAFKANPVLAPLGGEVQ-
将上述AA编码序列输入NCBI数据库，应用BLAST[4]和FASTA[5]软件，在已知蛋白质的AA序列数据库中，作同源性分析，均未找到各自的同源序列，表明这两种DBP都可能是新的蛋白质。
2.3 不同培养基和培养时间对抗辐射菌DBP表达水平的影响：野生型抗辐射菌KR1分别培养在TGY和LB-L培养基中，于8、13、18、24和48h后收获细胞，按同样的方法检测DBP(由预实验结果提示12～16kd的4种DBP在不同培养基和不同培养时间，若采用15%SDS-PAGE电泳则不见明显变化，故将SDS-PAGE凝胶浓度改为7.5%，便可更好地观察到大分子DBP的变化)。结果(图2)显示，不同培养基及不同培养时间对93kd和33kd两种DBP的表达水平有明显影响。KR1的93kd的DBP在<24hLB-L中表达水平明显高于其在TGY中的表达水平，并都随培养时间的延长而增高；而33kd的DBP于48h后只在TGY中表达，其水平也随培养时间的延长而增高。
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图2 培养基和培养时间对抗辐射
菌KR1的DBP表达的影响
3 讨论
抗辐射菌D.radiodurans能够耐受大剂量的辐射及其他的损伤剂，一般认为该菌的这种抗性是由其高效和准确的DNA修复系统所决定的。迄今为止，只有4种与辐射有关的基因被克隆，recA、polA、uvrA和pprA。前三种基因的产物分别与大肠杆的recA蛋白、DNA聚合酶Ⅰ和uvrA蛋白有同源性，而pprA基因[6]是一个新分离出来的能促进DNA修复的基因，尚未发现与其产物具有同源性的蛋白质。
研究表明，D.radiodurans的抗辐射特性与其DNA的特殊结构与组成有关。在抗辐射菌的DNA中，G+C的含量约占70%，且有一些蛋白组分参与了DNA构象的稳定，并使DNA较易于被修复[7]，而这些蛋白质大多呈DBP形成存在。大肠杆菌的DBPⅡ是研究得最多的一种，类似的DBP也曾在其他许多细胞中被发现，所以研究抗辐射菌的DBP，对阐明辐射抗性的机制具有重要意义。本研究从野生型D.radiodurans中检测到8种DBP，和其他几种细菌比较可见，这些DBP似乎都是抗辐射菌所特有的，尤其是93kd和33kd这两种新蛋白，推测其在抗辐射菌的辐射耐受性中占有重要地位。由于其N-末端氨基酸序列已被阐明，则还可通过制备寡核苷酸探针，从D.radiodurans的基因库中鉴定、筛选出编码该DBP的基因，并加以克隆，这样可进一步通过辐射诱导该基因的突变来研究所编码的DBP的放射物损伤及防护的作用及其机制，这是一个非常有意义的工作，也是我们今后的工作方向。
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在正常条件下，抗辐射菌D.radiodurans生长在30℃的TGY中，倍增时间为80min，72h后进入稳定生长期。在指数生长期，90%呈二联体；在稳定生长期绝大多数呈四迭体形态[8]。LB-L培养基对抗辐射菌是“过营养”(即全优条件)，细菌倍增时间缩短且形态有所改变，如表现为细胞体积的增大和多联体细胞的比例增高。据报道，生长在LB-L培养基中的抗辐射菌对辐射的耐受性低于生长在TGY(即次优条件)的培养基中。除形态上较大易引起损伤的原因外，本研究已揭示DBP表达水平的不同，如经48h培养后，尽管93kd的DBP在两种培养基中均有表达，但次优培养基较易诱发某些DBP表达是造成辐射抗性较高的另一个主要原因。
*中国核工业总公司科研基金资助课题(J94Q62068)
参考文献
1 Moseley BEB.Photobiology and radiobiology of Micrococcus (De inococcus) radiodurans.Photochem Photobiol Rev,Vol 7.Edinburgh,UK∶Univer.Edin burgh Press.1983∶223～274
, 百拇医药
2 Minton KW.DNA repair in the extremely radioresistant bacterium Deino coccus radiodurans.Mol Microbiol,1994,13(1)∶9
3 Saito H,Miura K.Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by p henol treatment.Biochem Biophys Acta,1963,72(4)∶619
4 Pearson WR,Lipman DJ.Improved tools for biological sequence comparison .Proc Natl Acad USA,1988,85(8)∶2444
5 Altsuchul SF,et al.Basic local alignment search tools.J Mol Biol,1990, 215(3)∶403
, http://www.100md.com
6 Du Zej,et al.Cloning,sequencing and characterization of a novel DNA re pair gene pprA from Deinococcus radiodurans.J Radiat Res Radiat Proces. 1998,16(4)∶218
7 Kitayama S,et al.Isolation of a DNA-binding protein for Deinococcus radiodurans have an affinity for a Z-form polynucleotide.J Biochem,1988,104( 1)∶127
8 Du Zeji,et al.The morphology and the growth characteristics of Deino coccus radiodurans.Acta Academiae Medicinae Suzhou,1998,18(11)∶1131(in Chines e).
(1999年9月19日收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院放射毒理学教研室,苏州215007
关键词：抗辐射菌；D.radiodurans；DNA结合蛋白；氨基酸序列；辐射耐受性
苏州医学院学报991204 摘要 目的 对抗辐射菌D.radioudurans的DNA结合蛋白(DBP)进行N-末端氨基酸(AA)序列分析，探讨其抗辐射分子学组成的特性。方法 采用地高辛(DIG)标记染色体DNA作为探针，South-Western印迹法检测DBP，在N-端AA自动序列仪上分析AA序列。结果 野生型抗辐射菌存有8种DBP的特性蛋白(分子量分别为122、93、33、29、16、15、14和12kd)；AA序列分析发现其中93kd和33kd可能为新的蛋白质；两种新DBP的表达水平随不同培养基和培养时间而变化。结论 抗辐射菌的DBP，尤其是93kd和33kd的DBP与其辐射耐受性可能有密切关系。
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中图法分类 R811.5；Q691.9
Analysis of Amino Acid Sequence of the DNA-binding
Proteins from Radioresistant Bacterium
Wang Mingsuo,Du Zeji,Yang Zhanshan,et al
(Department of Radiation Medicine,Suzhou Medical College,Suzhou,21 5007)
Abstract Objective Analysis was carried out on the N-terminal amino acid (AA) sequence in DNA-binding proteins (DBPs) from a radioresistant bacterium, i.e.Deinococcus radiodurans (D.radiodurans),for purposes of explo ring their radioresistant characteristics of molecular components.Methods The DBPs from three radioresistant bacteria were determined by South- Western bloting using the chromosomal DNA labeled with Digoxin (DIG) as a probe. The N-terminal AA sequence in some DBPs was analysed by a AA autosequencer.Results There were eight DPBs in three wild type of D.radfodurans ,and their molecular weights were 122、93、33、29、16、15、14 and 12kd respect ivel y.The DBPs of 93 and 33 kd from wild type of KR1 might be two novel proteins acc ording to results of the AA sequence analysis.The expression level of the two DB Ps changed with different culture media and culturing time.Conclusion The DPBs from radioresistant bacterium,especially the DBPs of 93 and 33 kd, were closely related to the radioresistance of D.radiodurans.
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Key words radioresistant bacterium; D.radiodurans; D NA-binding proteins; kmino acid sequence; radioresistance
抗辐射菌Deinococcus radiodurans是一种微小的球菌，由于其对电离辐射和许多化学诱变剂都具有极强的耐受性[1]，近来倍受放射生物学家的关注，且普遍认为该菌的辐射耐受性缘自于其有超常的DNA修复系统[2]。在DNA修复酶类等蛋白质中，有一些能与DNA结合者称之为DNA结合蛋白(DNA-bindingProtein,DBP)。以往的研究已表明，DBP含量与DNA的损伤和修复功能密切相关，但关于抗辐射菌的DBP及其在抗辐射分子学组成特性等的研究目前报道甚少。本文拟从DBP检测及其AA序列分析上作一初探。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细菌株及培养条件：抗辐射菌Deinococcus radiodurans为野生型的MR1、KR1和Sark3种；大肠杆菌(E.Coli)为JM109；嗜热菌(T.thermophilius)为YT1；枯草杆菌(B.Subtilis)为RM125。TGY培养基：0.5%胰蛋白胨(Difco)，0.1%葡萄糖，0.3%酵母提取物(Difco)；LB-L培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.085mol/LNaCl；TM培养基∶0.4%胰蛋白胨，0.2%酵母提取物，0.017mol/LNaCl。抗辐射菌、嗜热菌分别生长在TGY、TM培养基中，培养温度分别为30℃和65℃；大肠杆菌和枯草杆菌均生长在LB-L培养基中，培养温度为37℃。
1.2 菌体蛋白粗提物的制备：经培养一定时间后的各种细菌，离心收获，PBS洗2次，4℃下用超声波仪(Beckman)破碎，低温离心(1500r/min)30min，收集上清液备用。
, http://www.100md.com
1.3 染色体DNA的分离及地高辛(DIG)标记DNA探针的制备：按Saito等[3]方法分离纯化抗辐射菌DNA。分离后的DNA经内切酶Sau3AⅠ(Takara，Jp)部分消化后，用DIG标记试剂盒(Takara)，按说明书制备DIG标记的DNA探针，备South-Western印迹之用。
1.4 South-Western印迹法检测DBP：细菌的蛋白提取物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转印到PVdF(聚偏二氟乙烯)膜上(4℃，150mA,90min)，按照South-Western印迹检测试剂盒(Takara)的使用说明，检测DBP。
1.5 氨基酸(AA)序列分析：采用Edman降解法，取其PTH-AA衍生物在N-端AA自动序列仪(470A，ABI公司)上进行分析。
2 结果
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2.1 野生型抗辐射菌、嗜热菌、大肠杆菌及枯草杆菌等菌株DBP的检测：取培养48h后的细菌培养物，离心收获细胞，制备蛋白提取物，SDS-PAGE(凝胶浓度为15%)电泳。South-Western印迹法检测的DBP见图1。
图1 野生型抗辐射菌的DBP
从图1看出3种野生型的抗辐射菌(MR1、KR1Sark)均可检测到8种DBP，它们的分子量分别为122、93、33、29、16、15、14和12kd。而嗜热菌、大肠杆菌均没有检测到相应的DBP，枯草杆菌在33kd处可检测到1个弱信号。
2.2 93kd和33kd两种DBP的N-末端氨基酸序列分析：取在TGY中培养48～72h的KR1制备蛋白提取物，转印到PVdF膜上，分别切下93kd和33kd蛋白条带(各4～6个平行样)，作N-末端氨基酸序列分析，其结果如下：
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93kd：MLKEDAARKTYVSPAVWEGCGREKFPVLNS-
33kd：MWPFGKSTADRVKDAFKANPVLAPLGGEVQ-
将上述AA编码序列输入NCBI数据库，应用BLAST[4]和FASTA[5]软件，在已知蛋白质的AA序列数据库中，作同源性分析，均未找到各自的同源序列，表明这两种DBP都可能是新的蛋白质。
2.3 不同培养基和培养时间对抗辐射菌DBP表达水平的影响：野生型抗辐射菌KR1分别培养在TGY和LB-L培养基中，于8、13、18、24和48h后收获细胞，按同样的方法检测DBP(由预实验结果提示12～16kd的4种DBP在不同培养基和不同培养时间，若采用15%SDS-PAGE电泳则不见明显变化，故将SDS-PAGE凝胶浓度改为7.5%，便可更好地观察到大分子DBP的变化)。结果(图2)显示，不同培养基及不同培养时间对93kd和33kd两种DBP的表达水平有明显影响。KR1的93kd的DBP在<24hLB-L中表达水平明显高于其在TGY中的表达水平，并都随培养时间的延长而增高；而33kd的DBP于48h后只在TGY中表达，其水平也随培养时间的延长而增高。
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图2 培养基和培养时间对抗辐射
菌KR1的DBP表达的影响
3 讨论
抗辐射菌D.radiodurans能够耐受大剂量的辐射及其他的损伤剂，一般认为该菌的这种抗性是由其高效和准确的DNA修复系统所决定的。迄今为止，只有4种与辐射有关的基因被克隆，recA、polA、uvrA和pprA。前三种基因的产物分别与大肠杆的recA蛋白、DNA聚合酶Ⅰ和uvrA蛋白有同源性，而pprA基因[6]是一个新分离出来的能促进DNA修复的基因，尚未发现与其产物具有同源性的蛋白质。
研究表明，D.radiodurans的抗辐射特性与其DNA的特殊结构与组成有关。在抗辐射菌的DNA中，G+C的含量约占70%，且有一些蛋白组分参与了DNA构象的稳定，并使DNA较易于被修复[7]，而这些蛋白质大多呈DBP形成存在。大肠杆菌的DBPⅡ是研究得最多的一种，类似的DBP也曾在其他许多细胞中被发现，所以研究抗辐射菌的DBP，对阐明辐射抗性的机制具有重要意义。本研究从野生型D.radiodurans中检测到8种DBP，和其他几种细菌比较可见，这些DBP似乎都是抗辐射菌所特有的，尤其是93kd和33kd这两种新蛋白，推测其在抗辐射菌的辐射耐受性中占有重要地位。由于其N-末端氨基酸序列已被阐明，则还可通过制备寡核苷酸探针，从D.radiodurans的基因库中鉴定、筛选出编码该DBP的基因，并加以克隆，这样可进一步通过辐射诱导该基因的突变来研究所编码的DBP的放射物损伤及防护的作用及其机制，这是一个非常有意义的工作，也是我们今后的工作方向。
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在正常条件下，抗辐射菌D.radiodurans生长在30℃的TGY中，倍增时间为80min，72h后进入稳定生长期。在指数生长期，90%呈二联体；在稳定生长期绝大多数呈四迭体形态[8]。LB-L培养基对抗辐射菌是“过营养”(即全优条件)，细菌倍增时间缩短且形态有所改变，如表现为细胞体积的增大和多联体细胞的比例增高。据报道，生长在LB-L培养基中的抗辐射菌对辐射的耐受性低于生长在TGY(即次优条件)的培养基中。除形态上较大易引起损伤的原因外，本研究已揭示DBP表达水平的不同，如经48h培养后，尽管93kd的DBP在两种培养基中均有表达，但次优培养基较易诱发某些DBP表达是造成辐射抗性较高的另一个主要原因。
*中国核工业总公司科研基金资助课题(J94Q62068)
参考文献
1 Moseley BEB.Photobiology and radiobiology of Micrococcus (De inococcus) radiodurans.Photochem Photobiol Rev,Vol 7.Edinburgh,UK∶Univer.Edin burgh Press.1983∶223～274
, 百拇医药
2 Minton KW.DNA repair in the extremely radioresistant bacterium Deino coccus radiodurans.Mol Microbiol,1994,13(1)∶9
3 Saito H,Miura K.Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by p henol treatment.Biochem Biophys Acta,1963,72(4)∶619
4 Pearson WR,Lipman DJ.Improved tools for biological sequence comparison .Proc Natl Acad USA,1988,85(8)∶2444
5 Altsuchul SF,et al.Basic local alignment search tools.J Mol Biol,1990, 215(3)∶403
, http://www.100md.com
6 Du Zej,et al.Cloning,sequencing and characterization of a novel DNA re pair gene pprA from Deinococcus radiodurans.J Radiat Res Radiat Proces. 1998,16(4)∶218
7 Kitayama S,et al.Isolation of a DNA-binding protein for Deinococcus radiodurans have an affinity for a Z-form polynucleotide.J Biochem,1988,104( 1)∶127
8 Du Zeji,et al.The morphology and the growth characteristics of Deino coccus radiodurans.Acta Academiae Medicinae Suzhou,1998,18(11)∶1131(in Chines e).
(1999年9月19日收稿), 百拇医药