Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达
作者：崔学芝 刘梅 刘炎 谭湘陵 顾晓松
单位：南通医学院神经科学研究所,南通226001
关键词：Tropic1808基因；克隆；表达；氨基酸序列分析
南通医学院学报000201 [摘 要] 目的：在大肠杆菌宿主系统中表达Tropic1808基因编码的蛋白。方法：用PCR方法从质粒中扩增出Tropic1808cDNA开放阅读框架片段(828bp)，并重组入表达载体pET-21a中，转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导Tropic1808融合蛋白的表达,经SDS-PAGE,表达蛋白条带转至PVDF膜进行氨基酸序列分析。结果：构建了pET-21a-1808重组质粒,外源性Tropic1808基因可在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占细菌总蛋白的14%以上,表达蛋白的N端氨基酸序列与基因编码序列一致。结论：Tropic1808基因可在大肠杆菌中获得表达，这为进一步纯化该基因表达蛋白、制备相应抗体以及研究其结构与功能奠定了基础。
, 百拇医药
[中图分类号] Q785 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)02-0119-03
EXPRESSION OF THE TROPIC 1808 GENE IN ESCHERICHIA COLI
CUI Xuezhi，LIU Mei，LIU Yan，TAN Xiangling，GU Xiaosong
(Institute of Neuroscience, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective:To express Tropic1808 gene in Escherichia coli . Methods: PCR methods were conducted to obtain 828bp cDNA fragment encoding for open reading frame of Tropic 1808 gene. The PCR product was cloned into the pET-21a vector and transformed into Escherichia coli BL21(DE3). Cultures of this transformation were induced by IPTG for the expression of recombinant protein, after SDS-PAGE ,the expression protein was transferred to PVDF membrane and analysed amino acid sequence. Results: pET-21a-1808 vector was constructed and Tropic 1808 gene was expressed efficiently in Escherichia coli. The recombinant Tropic 1808 gene accounted for more than 14% of the total bacterial proteins. N-terminal sequence is consistent with Tropic 1808 gene encoding sequence. Conclusion: Tropic 1808 gene can be expressed in Escherichia coli,which provides a basis for purifying this protein、 preparing antibody、researching its structure and functions.
, 百拇医药
[Key words] Tropic1808 gene;cloning;expression;amino acid sequence analysis
神经轴突的导向生长是当今发育神经生物学中的一个重要课题。新近的研究表明，神经损伤后其远侧端不仅发生Wallerian氏溃变，同时还发生复杂的细胞学和生物化学对损伤与再生的反应性调控过程，特别是非神经元细胞如雪旺氏细胞、成纤维细胞、神经内膜细胞等合成和分泌多种可溶性因子，维持细胞存活，调节神经元轴突的生长方向[1]。1995年，顾晓松等通过自然凝胶电泳分离到周围神经损伤时远侧端表达增强的组份，并通过与DRG细胞联合培养显示这些蛋白具有促神经生长的生物学作用[2]。为了克隆神经损伤后特异表达的相关活性因子,我们用免疫学方法,通过相关的抗体对大鼠损伤性周围神经组织cDNA文库进行了筛选[3]。在克隆的过程中，我们获得了一个长度为2.7kb的鼠源性的cDNA序列，命名为Tropic1808基因[4]。该基因经Genbank检索，为一个新的序列，基因登陆号为AF078811，其中有828bp长的完整的开放阅读框架，编码275个氨基酸，可表达30.2kD大小的蛋白质。为了从基因水平上进一步证实，我们进行了该基因片段在大肠杆菌宿主系统中的表达。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 PCR扩增Tropic 1808基因片段 以本实验室制备的PUC18-1808质粒为模板，按Tropic1808基因序列，由中科院上海植物生理研究所人工合成一对引物5a和3a，在上游及下游引物分别加入EcoRⅠ位点和HindⅢ位点
5a 5'TATGAATTCAAGATGAATTTGGCTCAAATCGC 3'
3a 5'GCGAAGCTTAGATATGACTAAGGTTATTGTCG 3'
在TaqDNA聚合酶(Promega公司)作用下行PCR,94℃预变性3min后，反应条件为：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸5min。预计扩增产物长度约为870bp，以1%琼脂糖凝胶电泳检测Tropic1808扩增产物并纯化。
, 百拇医药
1.2 pET-21a-1808重组质粒的构建 将pET-21a 质粒(上海医科大学基因中心惠赠)和纯化的PCR产物分别用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ(GibcoBRL)双酶切后，冻融法回收，在T4DNA连接酶(Promega公司)的作用下将回收的目的片段定向插入载体中，转化BL21(DE3)菌，挑取多个单斑，扩增后用碱裂解法提纯质粒DNA，经双酶切鉴定，获得pET-21a-1808重组质粒(图1)。酶切、连接、转化、碱裂解法提纯质粒DNA操作参考文献[5]。
1.3 重组Tropic1808基因在大肠杆菌中的表达 接种含重组表达质粒的BL21(DE3)单菌落于LB培养基(含60μgAmp/ml)中，37℃振荡培养过夜，然后用LB以1∶50稀释，继续培养至OD600=0.6(约2.5小时)，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L诱导外源基因的表达，3小时后离心收获菌体,悬于SDS-PAGE样品缓冲液中，100℃煮沸5分钟，12,000g离心5分钟,取上清作10%SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色,通过凝胶扫描确定重组蛋白表达水平。以未诱导的含重组质粒的菌体为对照。
, 百拇医药
图1 表达载体pET-21a-1808构建示意图
1.4 表达蛋白氨基酸测序分析 含pET-21a-1808质粒的菌体诱导表达后的蛋白经10%SDS-PAGE转移至PVDF膜，割下目的蛋白条带经Beckman蛋白/多肽氨基酸自动测序仪(中科院上海植物生理研究所)分析该蛋白N端氨基酸序列。
2 结 果
2.1 表达载体pET-21a-1808的构建及鉴定 以PUC18-1808质粒为模板，5a和3a为引物，经PCR扩增得到约870bp长的Tropic1808基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳图谱见图2。i
图2 PCR扩增Tropic1808cDNA电泳图
, 百拇医药 A:λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ Marker(GibcoBRL); B:870bp Tropic 1808 cDNA
pET-21a-1808组建后全长6.2kb，经双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示长度为5.4kb和870bp的两个片段,说明构建正确,而PEF21a质粒酶切后无870bp片段的产生(图3)。
图3 pET-21a-1808酶切鉴定图
A: λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ Marker(GibcoBRL)；B: pET-21a-1808/EcoRⅠ+HindⅢcoRⅠ[5.4kb,870bp]；C: pET-21a/EcoRⅠ+HindⅢ[5.4kb]；D: pET-21a[5.4kb]；E：DL2000 Marker(TaKaRa公司)
, 百拇医药
2.2 重组Tropic1808的表达 经IPTG诱导后的含重组质粒的BL21(DE3)菌体上清的 SDS-PAGE图谱显示，在分子量32kD左右蛋白区带明显增加，而未诱导的阴性对照在此处无特异性条带出现。目的蛋白分子量与预计的大小相同，且蛋白能以可溶性形式存在。菌体蛋白的SDS-PAGE图谱经凝胶成像系统分析可溶的目的蛋白占菌体总蛋白14%以上。
图4 表达Tropic1808的BL21(DE3)菌的SDS-PAGE分析
A:含pET-21a-1808的菌体，诱导；B:含pET-21a-1808的菌体，不诱导；C:低分子量标准蛋白
2.3 表达蛋白氨基酸序列分析 经Beckman蛋白质/多肽测序仪自动分析，读出N端25个氨基酸序列：ASMTGGQQMGRGSEFKMNLAQIAAL，第17至第25个氨基酸序列与Tropic1808 开放阅读框架编码的氨基酸序列完全一致。
, 百拇医药
3 讨 论
神经诱向学说揭示了神经再生过程中化学诱向性生长的机制在于某种具有化学诱向生长的活性物质-神经诱向因子的存在，对神经诱向因子结构与功能以及在临床上的应用价值进行研究已成为这一科学领域的研究热点。
Tropic1808基因是在克隆与促神经生长相关因子的过程中获得的一个新基因。本研究用原核表达的方法获得了Tropic1808基因编码的融合蛋白。原核表达具有操作容易、可获得高表达等众多优点，融合蛋白具有稳定性、可溶性，而且易于鉴定和分离纯化。pET载体属于T7RNA聚合酶启动子的表达体系，是一种高效可诱导的原核表达体系，已被成功地用来表达多种原核和真核蛋白。我们在实验中利用方便有效的PCR技术直接克隆到目的基因，并将此片段插入到pET-21a载体中，此载体的N端有T7*Tag序列，产生的融合蛋白被其编码的部分只有11个氨基酸，加上酶切位点编码的部分总共16个氨基酸，Tropic1808基因完整的阅读框架为828bp，编码275个氨基酸，可表达30.2kD，加上表达系统的融合蛋白部分，预期表达产物为32kD，SDS-PAGE图谱显示在分子量32kD左右的蛋白区带明显增加。一般情况下可采用相应抗体显示表达蛋白的特异性，为了获得直接证据，我们进行了表达蛋白的测序，获得N端25个氨基酸序列，结果从第17位氨基酸MET开始至第25位的序列，与Tropic1808开放阅读框架编码的氨基酸完全一致，证实了所表达蛋白的正确性。
, 百拇医药
Tropic1808原核表达的成功为进一步研究此蛋白的结构和功能打下了基础。
[基金项目]国家杰出青年科学 基金资助项目(编号39425006)
[参考文献]
[1] Heffner CD,Lumsden AGS and O'leary DDM.Target control of collateral extension and directional axon growth in the mammalian brain[J]. Science,1990,24∶217.
[2] Xiaosong GU, Thomas PK and King RHM.Chemotropism in nerve regeneration studied in tissue culture[J]. J Anat,1995,186∶153.
, http://www.100md.com
[3] 谭湘陵,顾晓松,印其友，等. 大鼠损伤性周围神经cDNA文库的构建[J].解剖学报,1998,29(2)∶139.
[4] Xiaosong Gu, Thomas P K,Xiangling Tan etal. Molecular cloning of Tropic 1808 protein,a noval factor induced by nerve injury[J]. J Anat,1999,194∶604.
[5] 萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼可T.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,1992.
(2000-03-21收稿), 百拇医药
单位：南通医学院神经科学研究所,南通226001
关键词：Tropic1808基因；克隆；表达；氨基酸序列分析
南通医学院学报000201 [摘 要] 目的：在大肠杆菌宿主系统中表达Tropic1808基因编码的蛋白。方法：用PCR方法从质粒中扩增出Tropic1808cDNA开放阅读框架片段(828bp)，并重组入表达载体pET-21a中，转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导Tropic1808融合蛋白的表达,经SDS-PAGE,表达蛋白条带转至PVDF膜进行氨基酸序列分析。结果：构建了pET-21a-1808重组质粒,外源性Tropic1808基因可在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占细菌总蛋白的14%以上,表达蛋白的N端氨基酸序列与基因编码序列一致。结论：Tropic1808基因可在大肠杆菌中获得表达，这为进一步纯化该基因表达蛋白、制备相应抗体以及研究其结构与功能奠定了基础。
, 百拇医药
[中图分类号] Q785 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)02-0119-03
EXPRESSION OF THE TROPIC 1808 GENE IN ESCHERICHIA COLI
CUI Xuezhi，LIU Mei，LIU Yan，TAN Xiangling，GU Xiaosong
(Institute of Neuroscience, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective:To express Tropic1808 gene in Escherichia coli . Methods: PCR methods were conducted to obtain 828bp cDNA fragment encoding for open reading frame of Tropic 1808 gene. The PCR product was cloned into the pET-21a vector and transformed into Escherichia coli BL21(DE3). Cultures of this transformation were induced by IPTG for the expression of recombinant protein, after SDS-PAGE ,the expression protein was transferred to PVDF membrane and analysed amino acid sequence. Results: pET-21a-1808 vector was constructed and Tropic 1808 gene was expressed efficiently in Escherichia coli. The recombinant Tropic 1808 gene accounted for more than 14% of the total bacterial proteins. N-terminal sequence is consistent with Tropic 1808 gene encoding sequence. Conclusion: Tropic 1808 gene can be expressed in Escherichia coli,which provides a basis for purifying this protein、 preparing antibody、researching its structure and functions.
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[Key words] Tropic1808 gene;cloning;expression;amino acid sequence analysis
神经轴突的导向生长是当今发育神经生物学中的一个重要课题。新近的研究表明，神经损伤后其远侧端不仅发生Wallerian氏溃变，同时还发生复杂的细胞学和生物化学对损伤与再生的反应性调控过程，特别是非神经元细胞如雪旺氏细胞、成纤维细胞、神经内膜细胞等合成和分泌多种可溶性因子，维持细胞存活，调节神经元轴突的生长方向[1]。1995年，顾晓松等通过自然凝胶电泳分离到周围神经损伤时远侧端表达增强的组份，并通过与DRG细胞联合培养显示这些蛋白具有促神经生长的生物学作用[2]。为了克隆神经损伤后特异表达的相关活性因子,我们用免疫学方法,通过相关的抗体对大鼠损伤性周围神经组织cDNA文库进行了筛选[3]。在克隆的过程中，我们获得了一个长度为2.7kb的鼠源性的cDNA序列，命名为Tropic1808基因[4]。该基因经Genbank检索，为一个新的序列，基因登陆号为AF078811，其中有828bp长的完整的开放阅读框架，编码275个氨基酸，可表达30.2kD大小的蛋白质。为了从基因水平上进一步证实，我们进行了该基因片段在大肠杆菌宿主系统中的表达。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 PCR扩增Tropic 1808基因片段 以本实验室制备的PUC18-1808质粒为模板，按Tropic1808基因序列，由中科院上海植物生理研究所人工合成一对引物5a和3a，在上游及下游引物分别加入EcoRⅠ位点和HindⅢ位点
5a 5'TATGAATTCAAGATGAATTTGGCTCAAATCGC 3'
3a 5'GCGAAGCTTAGATATGACTAAGGTTATTGTCG 3'
在TaqDNA聚合酶(Promega公司)作用下行PCR,94℃预变性3min后，反应条件为：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸5min。预计扩增产物长度约为870bp，以1%琼脂糖凝胶电泳检测Tropic1808扩增产物并纯化。
, 百拇医药
1.2 pET-21a-1808重组质粒的构建 将pET-21a 质粒(上海医科大学基因中心惠赠)和纯化的PCR产物分别用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ(GibcoBRL)双酶切后，冻融法回收，在T4DNA连接酶(Promega公司)的作用下将回收的目的片段定向插入载体中，转化BL21(DE3)菌，挑取多个单斑，扩增后用碱裂解法提纯质粒DNA，经双酶切鉴定，获得pET-21a-1808重组质粒(图1)。酶切、连接、转化、碱裂解法提纯质粒DNA操作参考文献[5]。
1.3 重组Tropic1808基因在大肠杆菌中的表达 接种含重组表达质粒的BL21(DE3)单菌落于LB培养基(含60μgAmp/ml)中，37℃振荡培养过夜，然后用LB以1∶50稀释，继续培养至OD600=0.6(约2.5小时)，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L诱导外源基因的表达，3小时后离心收获菌体,悬于SDS-PAGE样品缓冲液中，100℃煮沸5分钟，12,000g离心5分钟,取上清作10%SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色,通过凝胶扫描确定重组蛋白表达水平。以未诱导的含重组质粒的菌体为对照。
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图1 表达载体pET-21a-1808构建示意图
1.4 表达蛋白氨基酸测序分析 含pET-21a-1808质粒的菌体诱导表达后的蛋白经10%SDS-PAGE转移至PVDF膜，割下目的蛋白条带经Beckman蛋白/多肽氨基酸自动测序仪(中科院上海植物生理研究所)分析该蛋白N端氨基酸序列。
2 结 果
2.1 表达载体pET-21a-1808的构建及鉴定 以PUC18-1808质粒为模板，5a和3a为引物，经PCR扩增得到约870bp长的Tropic1808基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳图谱见图2。i
图2 PCR扩增Tropic1808cDNA电泳图
, 百拇医药 A:λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ Marker(GibcoBRL); B:870bp Tropic 1808 cDNA
pET-21a-1808组建后全长6.2kb，经双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示长度为5.4kb和870bp的两个片段,说明构建正确,而PEF21a质粒酶切后无870bp片段的产生(图3)。
图3 pET-21a-1808酶切鉴定图
A: λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ Marker(GibcoBRL)；B: pET-21a-1808/EcoRⅠ+HindⅢcoRⅠ[5.4kb,870bp]；C: pET-21a/EcoRⅠ+HindⅢ[5.4kb]；D: pET-21a[5.4kb]；E：DL2000 Marker(TaKaRa公司)
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2.2 重组Tropic1808的表达 经IPTG诱导后的含重组质粒的BL21(DE3)菌体上清的 SDS-PAGE图谱显示，在分子量32kD左右蛋白区带明显增加，而未诱导的阴性对照在此处无特异性条带出现。目的蛋白分子量与预计的大小相同，且蛋白能以可溶性形式存在。菌体蛋白的SDS-PAGE图谱经凝胶成像系统分析可溶的目的蛋白占菌体总蛋白14%以上。
图4 表达Tropic1808的BL21(DE3)菌的SDS-PAGE分析
A:含pET-21a-1808的菌体，诱导；B:含pET-21a-1808的菌体，不诱导；C:低分子量标准蛋白
2.3 表达蛋白氨基酸序列分析 经Beckman蛋白质/多肽测序仪自动分析，读出N端25个氨基酸序列：ASMTGGQQMGRGSEFKMNLAQIAAL，第17至第25个氨基酸序列与Tropic1808 开放阅读框架编码的氨基酸序列完全一致。
, 百拇医药
3 讨 论
神经诱向学说揭示了神经再生过程中化学诱向性生长的机制在于某种具有化学诱向生长的活性物质-神经诱向因子的存在，对神经诱向因子结构与功能以及在临床上的应用价值进行研究已成为这一科学领域的研究热点。
Tropic1808基因是在克隆与促神经生长相关因子的过程中获得的一个新基因。本研究用原核表达的方法获得了Tropic1808基因编码的融合蛋白。原核表达具有操作容易、可获得高表达等众多优点，融合蛋白具有稳定性、可溶性，而且易于鉴定和分离纯化。pET载体属于T7RNA聚合酶启动子的表达体系，是一种高效可诱导的原核表达体系，已被成功地用来表达多种原核和真核蛋白。我们在实验中利用方便有效的PCR技术直接克隆到目的基因，并将此片段插入到pET-21a载体中，此载体的N端有T7*Tag序列，产生的融合蛋白被其编码的部分只有11个氨基酸，加上酶切位点编码的部分总共16个氨基酸，Tropic1808基因完整的阅读框架为828bp，编码275个氨基酸，可表达30.2kD，加上表达系统的融合蛋白部分，预期表达产物为32kD，SDS-PAGE图谱显示在分子量32kD左右的蛋白区带明显增加。一般情况下可采用相应抗体显示表达蛋白的特异性，为了获得直接证据，我们进行了表达蛋白的测序，获得N端25个氨基酸序列，结果从第17位氨基酸MET开始至第25位的序列，与Tropic1808开放阅读框架编码的氨基酸完全一致，证实了所表达蛋白的正确性。
, 百拇医药
Tropic1808原核表达的成功为进一步研究此蛋白的结构和功能打下了基础。
[基金项目]国家杰出青年科学 基金资助项目(编号39425006)
[参考文献]
[1] Heffner CD,Lumsden AGS and O'leary DDM.Target control of collateral extension and directional axon growth in the mammalian brain[J]. Science,1990,24∶217.
[2] Xiaosong GU, Thomas PK and King RHM.Chemotropism in nerve regeneration studied in tissue culture[J]. J Anat,1995,186∶153.
, http://www.100md.com
[3] 谭湘陵,顾晓松,印其友，等. 大鼠损伤性周围神经cDNA文库的构建[J].解剖学报,1998,29(2)∶139.
[4] Xiaosong Gu, Thomas P K,Xiangling Tan etal. Molecular cloning of Tropic 1808 protein,a noval factor induced by nerve injury[J]. J Anat,1999,194∶604.
[5] 萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼可T.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,1992.
(2000-03-21收稿), 百拇医药