融合蛋白dot-ELISA法检测猪囊尾蚴病人循环抗体
作者：王敏 舒晶 徐之杰 王光岳
单位：王敏(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 舒晶(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 徐之杰(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 王光岳(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：融合蛋白；囊尾蚴病；dot-ELISA
哈尔滨医科大学学报000104 摘 要：目的 检测用基因重组技术所获得的融合蛋白的特异性与敏感性。方法 用猪囊尾蚴cDNA文库筛选的含编码28、18、14、34KDa抗原的基因片段阳性克隆，等比联合使用，以液相培养法经IPTG诱导重组噬菌体gt11/E.ColiY1090表达融合蛋白，并用做抗原，用dot-ELISA法诊断囊虫病。结果 血清以1∶50倍稀释，囊虫病人血清3份，阳性率为83.3%，正常人和肝吸虫病人血清30份，包虫病人血清16份均为阴性。结论 与部分提纯囊虫抗原酶联免疫检测试剂盒相比，具有特异性强，制备简便及重复性好的特点。
, http://www.100md.com
分类号：R383.3+4 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0008-02
A dot-ELISA test using fusion protein antigen for detecting cysticercosis antibody
WANG Min SHU Jing XU Zhi-jie et al
(Department of Parasitology,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To examine the specificity and sensitivity of the fusion protein produced by gene recombination technique.Methods The fusion protein antigens were obtained from the expression of the clones which encode 28,18,14 and 34 KDa fragments.Such clones were screened from cysticercus cellulosae cDNA library and induced into λ gt11/E.ColiY1090.Through fluid culture,the recombination espressed fusion protein which were detected by dot-ELISA to diagnose cysticercosis.Results The results showed that the positive rate of 30 cases of cysticercosis was 83.3% with the serum dilution titer was 1∶50.While none of the samples from 30 healthy controls,30 cases of clonorchiasis and 16 cases of echinococcosis was positive.Conclusion The dot-ELISA using fusion protein is higher specific than the ELISA dit made by practical purification antigen.And the assay is very convenient and easy to repeat.
, 百拇医药
Key words： fusion protein;cysticercosis;dot ELISA▲
血清学技术检测抗体是进行寄生虫病诊断及流行病学调查的重要手段之一。然而，检测抗体所用的抗原，常由虫体制备，不仅虫源短缺，而且不易去除无关成份的干扰，造成假阳性反应。近年来基因重组技术的应用，使这一问题得以解决。如恶性疟原虫，由于寄生人红细胞内，而人血循环中存在抗红细胞抗体，以往的提纯方法很难去除这部分干扰，而用基因重组技术，可将编码恶性疟原虫的特异基因进行表达[1]，可获得高度特异的恶性疟原虫抗原。运用基因工程技术生产的诊断用抗原、探针等，是目前最有希望的、高度特异、高度灵敏的诊断试剂。Vogel[2]从多房棘球绦虫cDNA文库中筛选Ⅱ/3抗原基因，克隆表达Ⅱ/3融合蛋白，并将其解为3.1和3.2KDa多肽，用Western blot法检测，效果较好。本文应用从猪囊尾蚴cDNA文库筛选出的[3，4]编码4个抗原的cDNA段片，通过液相培养法制备囊虫基因编码的融合蛋白，以此蛋白作为抗原，首创用dot-ELISA法，对人囊虫病抗体进行检测。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 血清标本
囊虫病人血清30份采自经本教研室确诊的住院患者，正常人血清30份采自我校二院血库献血员，肝吸虫病人血清30份及包虫病人血清16份采自本教研室门诊确诊的患者。
1.2 抗原制备参照文献[1]
取E.Coli Y1090 1ml，摇育过夜，8944g/min离心5min，去上清。加入100μl SM缓冲液使沉淀混悬，然后加入100μl重组噬菌体液(3×104，四种重组噬菌体液1∶1∶1∶1)。37℃温育20min后，加入1mol/L IPTG15μl和25mg/ml氨苄青霉素200μl的LB肉汤培养液10ml，置37℃摇育过夜，释放融合蛋白，收集培养液4℃保存。
1.3 dot-ELISA操作步骤参照文献[5]
, 百拇医药
将2μl融合蛋白抗原滴在0.5×1.0大小NC膜上(华美生物工程公司产品)，室温凉干。以1%脱脂乳粉-TBS室温封闭30min，晾干。用0.05%NP40-TBS稀释的待测血清，室温反应1h，4℃过夜。上法洗涤后，加入1%脱脂乳粉-TBS 1∶200倍稀释的HRP-羊抗人IgG，37℃温育30min，上法洗涤5次，加入4-氯-1奈酚底物显色。加入抗原处出现蓝紫色斑点为阳性，无斑点者为阴性。
1.4 试剂盒检测
人囊虫病CYT酶免疫检测试剂盒(博赛生物试剂实验研究所产品)检测囊虫病人血清30份、肝吸虫病人血清30份、包虫病人血清16份及正常人血清30份，操作步骤参照使用说明书。
2 结果
囊虫病人、肝吸虫病人及正常人血清各30份，包虫病人血清16份以1%脱脂乳粉-TBS 1∶50倍稀释后，一式两份进行试验，结果见附表。
, 百拇医药
附表 融合蛋白dot-ELISA与ELISA试剂盒检测抗体结果 血清
例数
ELISA试剂盒阳性数
(%)
dot-ELISA阳性数
(%)
囊虫病
30
24(80.0)
25(83.3)
肝吸虫病
30
, 百拇医药
3(10.0)
0(0)
包虫病
10
1(6.2)
0(0)
健康人
30
2(6.7)
0(0)
以χ2检测进行统计学分析，结果显示：融合蛋白进行的dot-ELISA与ELISA试剂盒检测囊虫病患者血清的阳性率，两组间无显著性差异(P>0.05)；肝吸虫、包虫患者及健康人血清的阳性率，经检测亦无显著性差异。但在肝吸虫、包虫患者及健康人血清检测中，融合蛋白进行的dot-ELISA法无1例阳性，其特异性为100%，克服了交叉反应。而在以部分提纯抗原为抗原的ELISA试剂盒检测中，肝吸虫、包虫患者及健康人血清检测中存在假阳性。表中30例囊虫病患者以融合蛋白进行的dot-ELISA与ELISA试剂盒两种方法检测均为阳性者23例，未完全重叠，推测因融合蛋白与部分提纯抗原的抗原成份不同，导致所识别的抗体存在差异所致。在应用中，条件允许的前提下，同时用多种方法检测可提高检出率。
, 百拇医药
3 讨论
由于现阶段囊虫病诊断中所用的抗原，大多来自囊尾蚴，为粗抗原或部分提纯抗原，其与肝吸虫病，尤其是包虫病患者血清存在交叉反应。在本试验中，所用试剂盒为囊尾蚴粗抗原经层析后所得的部分提纯抗原。试验结果证明部分提纯抗原[6，7]仍不能完全克服交叉反应。应用cDNA文库获得的特异基因进行表达，并用此表达产物作为抗原，检测囊虫病人血清抗体，检出率为83.3%，且特异性达到100%。而这种融合蛋白可根据需要随时通过培养大肠杆菌诱导表达获得，容易保持抗原质与量的不变，保证了抗原稳定、均一的来源。dot-ELISA法较Western blot法[8]不仅在抗原制备方面省略了许多步骤，易于一次性大批量生产，而且检测方法便于推广应用。
本文所用融合蛋白未经纯化，效果较好。而人血循环中存在抗大肠杆菌抗体，用融合蛋白作为抗原检测囊虫病人血清抗体时，应进行前处理，去除这部分干扰，以避免非特异反应，本研究对血清未进行前处理，效果较好，认为与人血清起反应的大肠杆菌抗原主要位于细菌细胞表面[5]，抗原制备时的高速离心去掉了细菌的有形成份，同时也去除了大肠杆菌抗原，另外，说明该反应中的融合蛋白抗原性较强，而大肠杆菌抗原成份已减少至不足以与血清中的大肠杆菌抗体发生反应。■
, 百拇医药
作者简介：王敏(1964-)，女，副教授，博士研究生
参考文献：
[1]刘克义，等.自然释放法制备融合蛋白的研究[J].山东医科大学学报，1990，28：1.
[2]Vogel M,et al.Production of a recombinant antigen of Echinococcus multiocularis with high immunodiagnostic sensitivity and specificity[J].Mol Biochem Parasitol,1988,31(1):117.
[3]王俊霞，彭郁葱，姚玉霞.囊尾蚴特异性抗原编码cDNA的阶段特异性表达[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1996，14(2)：89.
, http://www.100md.com [4]孙树汉，王俊霞，陈蕊霞.囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1997，15：15.
[5]刘克义，Kidson C.融合蛋白斑点ELISA检测恶性疟抗体[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1991，9：43.
[6]杜军，等.猪囊尾囊蚴可溶性蛋白的提纯和分析[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1994，12：155.
[7]王凯慧，徐之杰，甄殿魁.应用免疫印迹技术和ELISA对猪囊尾蚴抗原对比分析[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1993，11：53.
[8]王敏，郭瀛军，陈蕊霞，等.Western blot法诊断囊虫病的应用研究.中国寄生虫与寄生虫病杂志，1998，16：201.
收稿日期：1999-05-31
修改日期：1999-12-03
, 百拇医药
单位：王敏(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 舒晶(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 徐之杰(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 王光岳(哈尔滨医科大学 寄生虫学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：融合蛋白；囊尾蚴病；dot-ELISA
哈尔滨医科大学学报000104 摘 要：目的 检测用基因重组技术所获得的融合蛋白的特异性与敏感性。方法 用猪囊尾蚴cDNA文库筛选的含编码28、18、14、34KDa抗原的基因片段阳性克隆，等比联合使用，以液相培养法经IPTG诱导重组噬菌体gt11/E.ColiY1090表达融合蛋白，并用做抗原，用dot-ELISA法诊断囊虫病。结果 血清以1∶50倍稀释，囊虫病人血清3份，阳性率为83.3%，正常人和肝吸虫病人血清30份，包虫病人血清16份均为阴性。结论 与部分提纯囊虫抗原酶联免疫检测试剂盒相比，具有特异性强，制备简便及重复性好的特点。
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分类号：R383.3+4 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0008-02
A dot-ELISA test using fusion protein antigen for detecting cysticercosis antibody
WANG Min SHU Jing XU Zhi-jie et al
(Department of Parasitology,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To examine the specificity and sensitivity of the fusion protein produced by gene recombination technique.Methods The fusion protein antigens were obtained from the expression of the clones which encode 28,18,14 and 34 KDa fragments.Such clones were screened from cysticercus cellulosae cDNA library and induced into λ gt11/E.ColiY1090.Through fluid culture,the recombination espressed fusion protein which were detected by dot-ELISA to diagnose cysticercosis.Results The results showed that the positive rate of 30 cases of cysticercosis was 83.3% with the serum dilution titer was 1∶50.While none of the samples from 30 healthy controls,30 cases of clonorchiasis and 16 cases of echinococcosis was positive.Conclusion The dot-ELISA using fusion protein is higher specific than the ELISA dit made by practical purification antigen.And the assay is very convenient and easy to repeat.
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Key words： fusion protein;cysticercosis;dot ELISA▲
血清学技术检测抗体是进行寄生虫病诊断及流行病学调查的重要手段之一。然而，检测抗体所用的抗原，常由虫体制备，不仅虫源短缺，而且不易去除无关成份的干扰，造成假阳性反应。近年来基因重组技术的应用，使这一问题得以解决。如恶性疟原虫，由于寄生人红细胞内，而人血循环中存在抗红细胞抗体，以往的提纯方法很难去除这部分干扰，而用基因重组技术，可将编码恶性疟原虫的特异基因进行表达[1]，可获得高度特异的恶性疟原虫抗原。运用基因工程技术生产的诊断用抗原、探针等，是目前最有希望的、高度特异、高度灵敏的诊断试剂。Vogel[2]从多房棘球绦虫cDNA文库中筛选Ⅱ/3抗原基因，克隆表达Ⅱ/3融合蛋白，并将其解为3.1和3.2KDa多肽，用Western blot法检测，效果较好。本文应用从猪囊尾蚴cDNA文库筛选出的[3，4]编码4个抗原的cDNA段片，通过液相培养法制备囊虫基因编码的融合蛋白，以此蛋白作为抗原，首创用dot-ELISA法，对人囊虫病抗体进行检测。
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1 材料与方法
1.1 血清标本
囊虫病人血清30份采自经本教研室确诊的住院患者，正常人血清30份采自我校二院血库献血员，肝吸虫病人血清30份及包虫病人血清16份采自本教研室门诊确诊的患者。
1.2 抗原制备参照文献[1]
取E.Coli Y1090 1ml，摇育过夜，8944g/min离心5min，去上清。加入100μl SM缓冲液使沉淀混悬，然后加入100μl重组噬菌体液(3×104，四种重组噬菌体液1∶1∶1∶1)。37℃温育20min后，加入1mol/L IPTG15μl和25mg/ml氨苄青霉素200μl的LB肉汤培养液10ml，置37℃摇育过夜，释放融合蛋白，收集培养液4℃保存。
1.3 dot-ELISA操作步骤参照文献[5]
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将2μl融合蛋白抗原滴在0.5×1.0大小NC膜上(华美生物工程公司产品)，室温凉干。以1%脱脂乳粉-TBS室温封闭30min，晾干。用0.05%NP40-TBS稀释的待测血清，室温反应1h，4℃过夜。上法洗涤后，加入1%脱脂乳粉-TBS 1∶200倍稀释的HRP-羊抗人IgG，37℃温育30min，上法洗涤5次，加入4-氯-1奈酚底物显色。加入抗原处出现蓝紫色斑点为阳性，无斑点者为阴性。
1.4 试剂盒检测
人囊虫病CYT酶免疫检测试剂盒(博赛生物试剂实验研究所产品)检测囊虫病人血清30份、肝吸虫病人血清30份、包虫病人血清16份及正常人血清30份，操作步骤参照使用说明书。
2 结果
囊虫病人、肝吸虫病人及正常人血清各30份，包虫病人血清16份以1%脱脂乳粉-TBS 1∶50倍稀释后，一式两份进行试验，结果见附表。
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附表 融合蛋白dot-ELISA与ELISA试剂盒检测抗体结果 血清
例数
ELISA试剂盒阳性数
(%)
dot-ELISA阳性数
(%)
囊虫病
30
24(80.0)
25(83.3)
肝吸虫病
30
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3(10.0)
0(0)
包虫病
10
1(6.2)
0(0)
健康人
30
2(6.7)
0(0)
以χ2检测进行统计学分析，结果显示：融合蛋白进行的dot-ELISA与ELISA试剂盒检测囊虫病患者血清的阳性率，两组间无显著性差异(P>0.05)；肝吸虫、包虫患者及健康人血清的阳性率，经检测亦无显著性差异。但在肝吸虫、包虫患者及健康人血清检测中，融合蛋白进行的dot-ELISA法无1例阳性，其特异性为100%，克服了交叉反应。而在以部分提纯抗原为抗原的ELISA试剂盒检测中，肝吸虫、包虫患者及健康人血清检测中存在假阳性。表中30例囊虫病患者以融合蛋白进行的dot-ELISA与ELISA试剂盒两种方法检测均为阳性者23例，未完全重叠，推测因融合蛋白与部分提纯抗原的抗原成份不同，导致所识别的抗体存在差异所致。在应用中，条件允许的前提下，同时用多种方法检测可提高检出率。
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3 讨论
由于现阶段囊虫病诊断中所用的抗原，大多来自囊尾蚴，为粗抗原或部分提纯抗原，其与肝吸虫病，尤其是包虫病患者血清存在交叉反应。在本试验中，所用试剂盒为囊尾蚴粗抗原经层析后所得的部分提纯抗原。试验结果证明部分提纯抗原[6，7]仍不能完全克服交叉反应。应用cDNA文库获得的特异基因进行表达，并用此表达产物作为抗原，检测囊虫病人血清抗体，检出率为83.3%，且特异性达到100%。而这种融合蛋白可根据需要随时通过培养大肠杆菌诱导表达获得，容易保持抗原质与量的不变，保证了抗原稳定、均一的来源。dot-ELISA法较Western blot法[8]不仅在抗原制备方面省略了许多步骤，易于一次性大批量生产，而且检测方法便于推广应用。
本文所用融合蛋白未经纯化，效果较好。而人血循环中存在抗大肠杆菌抗体，用融合蛋白作为抗原检测囊虫病人血清抗体时，应进行前处理，去除这部分干扰，以避免非特异反应，本研究对血清未进行前处理，效果较好，认为与人血清起反应的大肠杆菌抗原主要位于细菌细胞表面[5]，抗原制备时的高速离心去掉了细菌的有形成份，同时也去除了大肠杆菌抗原，另外，说明该反应中的融合蛋白抗原性较强，而大肠杆菌抗原成份已减少至不足以与血清中的大肠杆菌抗体发生反应。■
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作者简介：王敏(1964-)，女，副教授，博士研究生
参考文献：
[1]刘克义，等.自然释放法制备融合蛋白的研究[J].山东医科大学学报，1990，28：1.
[2]Vogel M,et al.Production of a recombinant antigen of Echinococcus multiocularis with high immunodiagnostic sensitivity and specificity[J].Mol Biochem Parasitol,1988,31(1):117.
[3]王俊霞，彭郁葱，姚玉霞.囊尾蚴特异性抗原编码cDNA的阶段特异性表达[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1996，14(2)：89.
, http://www.100md.com [4]孙树汉，王俊霞，陈蕊霞.囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1997，15：15.
[5]刘克义，Kidson C.融合蛋白斑点ELISA检测恶性疟抗体[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1991，9：43.
[6]杜军，等.猪囊尾囊蚴可溶性蛋白的提纯和分析[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1994，12：155.
[7]王凯慧，徐之杰，甄殿魁.应用免疫印迹技术和ELISA对猪囊尾蚴抗原对比分析[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志，1993，11：53.
[8]王敏，郭瀛军，陈蕊霞，等.Western blot法诊断囊虫病的应用研究.中国寄生虫与寄生虫病杂志，1998，16：201.
收稿日期：1999-05-31
修改日期：1999-12-03
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