乳腺癌细胞DNA含量测定的临床意义
作者：邓文胜 戴勇 马榕
单位：山东医科大学附属医院 山东济南250012
关键词：
山东医药002141
传统评估乳腺癌患者预后的诸项指标(临床分期、组织学分型和腋淋巴结转移状况等)不能准确客观地判断乳腺癌细胞的增殖活性，不能合理、适度地估价预后和指导治疗，有一定的局限性。近10年来，乳腺癌细胞DNA含量测定已逐渐开展起来，它可以从细胞动力学的方面提供与肿瘤患者预后有关的生物学信息，定量检测细胞周期各阶段的改变。结合其他病理及临床资料，可对乳腺癌患者的预后作出比较准确全面的评估。而术前细针穿刺进行乳腺癌细胞DNA含量的测定，则为术前新辅助化疗和手术方式提供了一个有重要参考价值的量化指标。现综述如下。
1 取材方法
, 百拇医药
取材方法有三种：第一种取自石蜡包埋组织块，第二种取自新鲜切除组织标本，第三种通过术前细针穿刺(FNA)肿瘤组织制备单细胞悬液。第一种方法较为复杂，需经过脱蜡、水化、水洗、胃蛋白酶消化等步骤，容易造成细胞碎片过多，影响结果，且其DNA含量流式细胞仪(FCM)分析不易找到合适的内外标准细胞，故现在多不采用。第二种方法为获取新鲜组织标本后，立即用机械法将其分散成为单细胞，可以获取足够量的细胞制备单细胞悬液，适用于FCM，但只能用于术后FCM测定，对术前诊断无帮助。细针穿刺取材方法安全、简洁，既可以制成单细胞悬液用于流式细胞仪检测，也可以制成涂片用于图像细胞仪(ICM)进行DNA定量测定，能在术前获知乳腺癌细胞的DNA检测指标，为选定术前新辅助化疗方案及确定手术方式提供重要参考。
2 检测仪器
2.1 FCM 优点：具有高速度、高效率、高灵敏度的优点。缺点：需较多的标本量制成单细胞悬液(每份样品需1万～10万个细胞)，制备细胞悬液过程较复杂，测定结果易受细胞核碎片及间质细胞的影响。
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2.2 ICM 为90年代问世的静态测定系统，主要结构为带摄像机的光学显微镜及相应的计算机，检测标本是组织切片、印片或涂片。优点：标本制作简单，测定结果精确和重复性好，所需样本量少(通常为100个细胞)。缺点：检测速度较慢。Rijken等认为图像细胞仪DNA定量测定在细胞学检查中有一定的辅助诊断价值，即当穿刺涂片细胞学诊断无法确定良恶性时，如ICM-DNA定量测定为异倍体，则术后病理常证实为浸润性乳腺癌。但对于二倍体肿瘤来说，ICM-DNA定量测定无辅助诊断价值[1]。
3 检测指标与意义
3.1 检测指标 国内外学者报道的检测指标不尽相同，一般包括DNA指数(DI)、倍体分类(二倍体，异倍体)、细胞周期分析〔包括G0-1期细胞比率、G2-M期细胞比率、S期细胞比率(SPF)〕、增殖指数，以及>2C%(超2倍体细胞比率)、>4C%(超4倍体细胞比率)、DNA量值分布等。
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3.2 意义 DNA含量主要以DNA指数表示：DI＝(肿瘤标本细胞G0/G1)/(标准样品G0/G1)。一般DI＝1为二倍体，DI>1为异倍体。但由于各地区所使用的FCM产地及型号不同，所采用的校正方法不同，故其正常值范围有所差异。G0-1期细胞比率表示处于静止期或(和)合成前期肿瘤细胞的比率，G2-M期细胞比率表示处于DNA合成后期和有丝分裂期肿瘤细胞的比率，SPF表示处于DNA合成期的细胞比率SPF＝[S÷(G0/1+S+G2M)〕×100%；增殖指数即PI＝〔CS+G2M÷(G0/1+S+G2M)〕×100%，而>2C%、>4C%及DNA量值分布则反映非克隆性异倍体的存在情况。
有关DNA倍体及SPF的报道较多。多数学者认为二倍体肿瘤是预后较好的一类肿瘤[2]，Auer等于早期应用静态细胞计量法测定了乳腺癌细胞DNA倍体水平，并分析了倍体类型与患者手术后生存的关系。他们发现二倍体癌患者手术后15年的生存率明显高于异倍体患者[3]。而异倍体作为一个独立的预后指标已得到了普遍的认可。Barlogie等总结了4941例各种恶性肿瘤的DNA倍性，约三分之二的恶性肿瘤表现为异倍体，其中乳腺癌的异倍体率平均为79%[4]。Bychkova-NV等研究了上皮来源恶性肿瘤的倍性和细胞增殖特性，认为DI增高者肿瘤侵袭性明显增强，而非整倍体细胞是肿瘤复发的原因之一[5]。Hedley和Fallenius认为DNA倍性可以准确地评估患者的预后，是一种直接评估乳腺癌恶性程度的指标[6]。大多数学者报告在雌激素受体(ER)阴性患者中，异倍体肿瘤的检出率较高。
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但也有一些研究者得出完全相反的结论。Konstantin等研究了180例乳腺癌患者的预后指出，DNA倍体性与乳腺癌细胞分化程度无关，DNA倍体性正常并不能排除核形的异常改变。DNA倍体性虽与患者预后有一定关系，但并不显著[7]。O’Relly等也发现倍体水平与存活率及复发率无关，而SPF则是唯一反映细胞分化程度的指标[8]。德国的Schollotter-CM等研究了125例原发乳腺癌患者，结果显示，组织学分级与倍体无关[9]。Wong-SW认为腋淋巴结阴性的二倍体与异倍体乳腺癌患者的无病生存期(DFS)无明显区别[10]。Charlotte R.Wenger等总结了近10年来273篇有关乳腺癌SPF研究的文献指出，SPF与其他乳腺癌的预后指标有明显的相关性，高SPF者常常肿瘤分级较差，缺乏类固醇受体，肿瘤直径较大，腋窝淋巴结转移阳性等。SPF较高患者生存期较短。SPF可以反映乳腺癌细胞的增殖活性和侵袭能力。另外，ER阳性者SPF较低而ER阴性者SPF较高是因为乳腺致癌后可失去合成ER的能力，ER表达有赖于细胞分化，与增殖呈负相关，这也从本质上解释了ER阳性乳腺癌患者预后较好[11]。Kute等研究指出，高SPF(>100%)患者如接受大剂量化疗，其生存期要大于接受小剂量或标准剂量化疗的患者[12]。Chavillard等评估了SPF作为一个对新辅助化疗反应的因素，他们发现对新辅助化疗反应敏感的患者其SPF值要高于对新辅助化疗反应不敏感的病人。因此，将SPF与其他指标相结合用于评估患者的临床进程，可为制定合理的治疗方案提供进一步参考。
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4 术前针吸细胞DNA含量测定的意义
术后石蜡包埋及新鲜肿瘤组织DNA测定对乳腺癌患者预后的意义已得到国内外学者的普遍认同。如能在术前即获得乳腺癌的DNA倍体类型，进行细胞周期分析，并结合其他临床特性，则可以在术前进一步明确其生物学行为，较全面掌握患者的预后信息，为制定术前放疗及新辅助化疗等辅助治疗方案，并为决定手术方式提供重要的依据。但术前针吸细胞DNA测定与术后石蜡包埋及新鲜组织测定在统计学方面是否有差异，即术前细针穿刺DNA测定能否代替术后组织块的DNA含量测定，目前尚有争议。Tomita M等比较了66例乳腺癌患者术前针吸细胞与术后石蜡包埋组织FCM DNA含量的测定，结果两者统计学无显著差异，并且认为21G(相当于我国的7号)针头穿刺能够获得更好的标本[14]。而国内有学者认为FCM需要较多的标本制成单细胞悬液(1万～10万个细胞)，细针穿刺标本细胞数较少，往往不能满足需要，测定结果易受影响。而ICM的应用，则可以较少的样本量(通常为100个细胞)达到同样的目的[15]。
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综合以往文献，我们认为将乳腺癌细胞DNA含量的分析，特别是SPF与患者的其他临床信息相结合，将会为乳腺癌患者的诊断治疗提供更进一步的帮助，而乳腺癌术前针吸细胞学DNA分析与术后组织DNA分析的一致性问题尚有待于进一步探讨。
参考文献
1.Rijken A，deker A，Taylors，et al.Diagnostic valne of DNA analysis by flow cytometry and image analysis.Am J Clin pathel，1991，95(1)：6.
2.Dougle E.Ploidy proliferative and prognosis.Cancer，1990，65：1195.
3.Auer G.Prognostic significance of nuclear DNA content in mammary adenocarcinomas in human.Cancer Research，1984，394：1447.
, http://www.100md.com
4.B Barlogie.Flow cytometry in clinic cancer research.Cancer res，1983，43：3982.
5.Bychkova-NV，Meshkova-IE，Pozharisskii-KM，et al.Comparative study of the ploidy and cell proliferation of malignant epithelial neoplasms of various origin flow cytometric assay.Vopr-Onkol，1998，44(1)：54.
6.Hdeley DW.Influencen of celluar DNA content on disease-free survival of stage Ⅱ breast cancer patients.Cancer res，1984，44：5395.
, http://www.100md.com
7.Konstantin C.DNA aneuploidy and cell proliferation in breast tumors.Cancer，1989，64：673.
8.O’Relli SM.DNA index，S-phase fraction，histological grade and prognosis in breast cancer.Br J Cancer，1988，61：420.
9.Schlotter-CM，Kropp-S，Wichert-S，et al.Clinical importance of histology，grading and ploidies in primary breast cancer.Zentralbl-Gynakol，1999，121(8)：384.
10.Wong-SW，Rangan-AM，Bilons-AM，et al.The value of s-phase and DNA ploidy analysis as prognostic markers for node-negative breast cancer in the austrilian setting.Pathology，1999 May，31(2)：90.
, http://www.100md.com
11.Charlotte R.S-phase fraction and breast cancer-a decade of experience.Breast cancer Reseach and Treatment，1998.51：255.
12.Kute TE，Qnadri Y，Muss H，et al.Flow cytometry in node-positive breast cancer：Cancer leukemia Group Bprotocol 8869.C-
ytometry，1995，22；297.
13.Chavillard S，Pouillart P，Beldjord C，et al.Sequential assessment of multidrug resistance phenotype and measurement of S-phase fraction as pridictive markers of breast cancer response to neoajuvant chemotherapy.Cancer，1996，77：292.
14.Masao tomita.Significance of flow cytomytric DNA analysis from freshly aspirated samples.Breast cancer，1995，2：113.
15.梁春立，阎波.乳腺肿块术前细针穿刺涂片DNA定量测定及其临床意义.实用癌症杂志，1998，15：(13)：171., 百拇医药
单位：山东医科大学附属医院 山东济南250012
关键词：
山东医药002141
传统评估乳腺癌患者预后的诸项指标(临床分期、组织学分型和腋淋巴结转移状况等)不能准确客观地判断乳腺癌细胞的增殖活性，不能合理、适度地估价预后和指导治疗，有一定的局限性。近10年来，乳腺癌细胞DNA含量测定已逐渐开展起来，它可以从细胞动力学的方面提供与肿瘤患者预后有关的生物学信息，定量检测细胞周期各阶段的改变。结合其他病理及临床资料，可对乳腺癌患者的预后作出比较准确全面的评估。而术前细针穿刺进行乳腺癌细胞DNA含量的测定，则为术前新辅助化疗和手术方式提供了一个有重要参考价值的量化指标。现综述如下。
1 取材方法
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取材方法有三种：第一种取自石蜡包埋组织块，第二种取自新鲜切除组织标本，第三种通过术前细针穿刺(FNA)肿瘤组织制备单细胞悬液。第一种方法较为复杂，需经过脱蜡、水化、水洗、胃蛋白酶消化等步骤，容易造成细胞碎片过多，影响结果，且其DNA含量流式细胞仪(FCM)分析不易找到合适的内外标准细胞，故现在多不采用。第二种方法为获取新鲜组织标本后，立即用机械法将其分散成为单细胞，可以获取足够量的细胞制备单细胞悬液，适用于FCM，但只能用于术后FCM测定，对术前诊断无帮助。细针穿刺取材方法安全、简洁，既可以制成单细胞悬液用于流式细胞仪检测，也可以制成涂片用于图像细胞仪(ICM)进行DNA定量测定，能在术前获知乳腺癌细胞的DNA检测指标，为选定术前新辅助化疗方案及确定手术方式提供重要参考。
2 检测仪器
2.1 FCM 优点：具有高速度、高效率、高灵敏度的优点。缺点：需较多的标本量制成单细胞悬液(每份样品需1万～10万个细胞)，制备细胞悬液过程较复杂，测定结果易受细胞核碎片及间质细胞的影响。
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2.2 ICM 为90年代问世的静态测定系统，主要结构为带摄像机的光学显微镜及相应的计算机，检测标本是组织切片、印片或涂片。优点：标本制作简单，测定结果精确和重复性好，所需样本量少(通常为100个细胞)。缺点：检测速度较慢。Rijken等认为图像细胞仪DNA定量测定在细胞学检查中有一定的辅助诊断价值，即当穿刺涂片细胞学诊断无法确定良恶性时，如ICM-DNA定量测定为异倍体，则术后病理常证实为浸润性乳腺癌。但对于二倍体肿瘤来说，ICM-DNA定量测定无辅助诊断价值[1]。
3 检测指标与意义
3.1 检测指标 国内外学者报道的检测指标不尽相同，一般包括DNA指数(DI)、倍体分类(二倍体，异倍体)、细胞周期分析〔包括G0-1期细胞比率、G2-M期细胞比率、S期细胞比率(SPF)〕、增殖指数，以及>2C%(超2倍体细胞比率)、>4C%(超4倍体细胞比率)、DNA量值分布等。
, http://www.100md.com
3.2 意义 DNA含量主要以DNA指数表示：DI＝(肿瘤标本细胞G0/G1)/(标准样品G0/G1)。一般DI＝1为二倍体，DI>1为异倍体。但由于各地区所使用的FCM产地及型号不同，所采用的校正方法不同，故其正常值范围有所差异。G0-1期细胞比率表示处于静止期或(和)合成前期肿瘤细胞的比率，G2-M期细胞比率表示处于DNA合成后期和有丝分裂期肿瘤细胞的比率，SPF表示处于DNA合成期的细胞比率SPF＝[S÷(G0/1+S+G2M)〕×100%；增殖指数即PI＝〔CS+G2M÷(G0/1+S+G2M)〕×100%，而>2C%、>4C%及DNA量值分布则反映非克隆性异倍体的存在情况。
有关DNA倍体及SPF的报道较多。多数学者认为二倍体肿瘤是预后较好的一类肿瘤[2]，Auer等于早期应用静态细胞计量法测定了乳腺癌细胞DNA倍体水平，并分析了倍体类型与患者手术后生存的关系。他们发现二倍体癌患者手术后15年的生存率明显高于异倍体患者[3]。而异倍体作为一个独立的预后指标已得到了普遍的认可。Barlogie等总结了4941例各种恶性肿瘤的DNA倍性，约三分之二的恶性肿瘤表现为异倍体，其中乳腺癌的异倍体率平均为79%[4]。Bychkova-NV等研究了上皮来源恶性肿瘤的倍性和细胞增殖特性，认为DI增高者肿瘤侵袭性明显增强，而非整倍体细胞是肿瘤复发的原因之一[5]。Hedley和Fallenius认为DNA倍性可以准确地评估患者的预后，是一种直接评估乳腺癌恶性程度的指标[6]。大多数学者报告在雌激素受体(ER)阴性患者中，异倍体肿瘤的检出率较高。
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但也有一些研究者得出完全相反的结论。Konstantin等研究了180例乳腺癌患者的预后指出，DNA倍体性与乳腺癌细胞分化程度无关，DNA倍体性正常并不能排除核形的异常改变。DNA倍体性虽与患者预后有一定关系，但并不显著[7]。O’Relly等也发现倍体水平与存活率及复发率无关，而SPF则是唯一反映细胞分化程度的指标[8]。德国的Schollotter-CM等研究了125例原发乳腺癌患者，结果显示，组织学分级与倍体无关[9]。Wong-SW认为腋淋巴结阴性的二倍体与异倍体乳腺癌患者的无病生存期(DFS)无明显区别[10]。Charlotte R.Wenger等总结了近10年来273篇有关乳腺癌SPF研究的文献指出，SPF与其他乳腺癌的预后指标有明显的相关性，高SPF者常常肿瘤分级较差，缺乏类固醇受体，肿瘤直径较大，腋窝淋巴结转移阳性等。SPF较高患者生存期较短。SPF可以反映乳腺癌细胞的增殖活性和侵袭能力。另外，ER阳性者SPF较低而ER阴性者SPF较高是因为乳腺致癌后可失去合成ER的能力，ER表达有赖于细胞分化，与增殖呈负相关，这也从本质上解释了ER阳性乳腺癌患者预后较好[11]。Kute等研究指出，高SPF(>100%)患者如接受大剂量化疗，其生存期要大于接受小剂量或标准剂量化疗的患者[12]。Chavillard等评估了SPF作为一个对新辅助化疗反应的因素，他们发现对新辅助化疗反应敏感的患者其SPF值要高于对新辅助化疗反应不敏感的病人。因此，将SPF与其他指标相结合用于评估患者的临床进程，可为制定合理的治疗方案提供进一步参考。
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4 术前针吸细胞DNA含量测定的意义
术后石蜡包埋及新鲜肿瘤组织DNA测定对乳腺癌患者预后的意义已得到国内外学者的普遍认同。如能在术前即获得乳腺癌的DNA倍体类型，进行细胞周期分析，并结合其他临床特性，则可以在术前进一步明确其生物学行为，较全面掌握患者的预后信息，为制定术前放疗及新辅助化疗等辅助治疗方案，并为决定手术方式提供重要的依据。但术前针吸细胞DNA测定与术后石蜡包埋及新鲜组织测定在统计学方面是否有差异，即术前细针穿刺DNA测定能否代替术后组织块的DNA含量测定，目前尚有争议。Tomita M等比较了66例乳腺癌患者术前针吸细胞与术后石蜡包埋组织FCM DNA含量的测定，结果两者统计学无显著差异，并且认为21G(相当于我国的7号)针头穿刺能够获得更好的标本[14]。而国内有学者认为FCM需要较多的标本制成单细胞悬液(1万～10万个细胞)，细针穿刺标本细胞数较少，往往不能满足需要，测定结果易受影响。而ICM的应用，则可以较少的样本量(通常为100个细胞)达到同样的目的[15]。
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综合以往文献，我们认为将乳腺癌细胞DNA含量的分析，特别是SPF与患者的其他临床信息相结合，将会为乳腺癌患者的诊断治疗提供更进一步的帮助，而乳腺癌术前针吸细胞学DNA分析与术后组织DNA分析的一致性问题尚有待于进一步探讨。
参考文献
1.Rijken A，deker A，Taylors，et al.Diagnostic valne of DNA analysis by flow cytometry and image analysis.Am J Clin pathel，1991，95(1)：6.
2.Dougle E.Ploidy proliferative and prognosis.Cancer，1990，65：1195.
3.Auer G.Prognostic significance of nuclear DNA content in mammary adenocarcinomas in human.Cancer Research，1984，394：1447.
, http://www.100md.com
4.B Barlogie.Flow cytometry in clinic cancer research.Cancer res，1983，43：3982.
5.Bychkova-NV，Meshkova-IE，Pozharisskii-KM，et al.Comparative study of the ploidy and cell proliferation of malignant epithelial neoplasms of various origin flow cytometric assay.Vopr-Onkol，1998，44(1)：54.
6.Hdeley DW.Influencen of celluar DNA content on disease-free survival of stage Ⅱ breast cancer patients.Cancer res，1984，44：5395.
, http://www.100md.com
7.Konstantin C.DNA aneuploidy and cell proliferation in breast tumors.Cancer，1989，64：673.
8.O’Relli SM.DNA index，S-phase fraction，histological grade and prognosis in breast cancer.Br J Cancer，1988，61：420.
9.Schlotter-CM，Kropp-S，Wichert-S，et al.Clinical importance of histology，grading and ploidies in primary breast cancer.Zentralbl-Gynakol，1999，121(8)：384.
10.Wong-SW，Rangan-AM，Bilons-AM，et al.The value of s-phase and DNA ploidy analysis as prognostic markers for node-negative breast cancer in the austrilian setting.Pathology，1999 May，31(2)：90.
, http://www.100md.com
11.Charlotte R.S-phase fraction and breast cancer-a decade of experience.Breast cancer Reseach and Treatment，1998.51：255.
12.Kute TE，Qnadri Y，Muss H，et al.Flow cytometry in node-positive breast cancer：Cancer leukemia Group Bprotocol 8869.C-
ytometry，1995，22；297.
13.Chavillard S，Pouillart P，Beldjord C，et al.Sequential assessment of multidrug resistance phenotype and measurement of S-phase fraction as pridictive markers of breast cancer response to neoajuvant chemotherapy.Cancer，1996，77：292.
14.Masao tomita.Significance of flow cytomytric DNA analysis from freshly aspirated samples.Breast cancer，1995，2：113.
15.梁春立，阎波.乳腺肿块术前细针穿刺涂片DNA定量测定及其临床意义.实用癌症杂志，1998，15：(13)：171., 百拇医药