人体基因治疗用VEGF质粒DNA的纯化与质控
作者：王露 茹远斌 曹颖 杨璐 范慧 马大龙
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：基因疗法；血管内皮生长因子；质粒；分离和提纯；DNA；分离和提纯
北京医科大学学报000429 [中图分类号] Q342.4 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0383-01
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是特异性促进血管内皮细胞增殖的多肽生长因子。本文对用于基因治疗的人VEGF121真核表达质粒进行了批量纯化技术路线的研究，并率先在国内建立了人体基因治疗用表达质粒的质控指标。通过QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit提取的pcD2/VEGF121质粒DNA,纯度好,超螺旋比例高,可直接用于基因治疗，动物实验已取得良好的效果。
, 百拇医药
1 材料与方法
质粒的提取：大肠杆菌XL1-Blue含pcD2/VEGF121质粒转化后挑取单克隆，接种到含有2 ml LA培养基的瓦氏管内，37℃振荡培养8 h。将培养菌稀释到2 000 ml LA培养基中，培养至细菌密度到1×109 ml-1。离心收获菌体。加P1、P2、P3缓冲液，冰浴30 min。除去沉淀，将样品上层析柱，加QC缓冲液洗柱2次。加QN缓冲液洗脱DNA，加0.7倍体积的异丙醇，混匀，离心弃上清。加入70%(体积分数)乙醇 10ml，离心弃上清。干燥。加PBS，使DNA溶解。
质粒DNA的质控：(1)紫外吸收比值：待检样品用生理盐水稀释，利用Beckman DU640紫外分光光度计在260和280 nm分别对待检样品进行测定；(2)超螺旋质粒DNA含量：样品每10 μl 2 μg上样，10 g*L-1琼脂糖电泳后利用凝胶成相系统扫描输入计算机进行超螺旋质粒DNA的分析测定；(3)残留染色体DNA含量检测：取2 μg细菌染色体DNA用Hind Ⅲ酶切,酚、氯仿、异戊醇抽提后乙醇沉淀。用DuPont公司的Random Primer Fluorescein Labeling Kit进行标记。VEGF质粒DNA点于尼龙膜后按DuPont公司的随机引物荧光素标记试剂盒的操作说明进行杂交；(4)残留工程菌蛋白质含量检测：利用免疫斑点测定技术检测，将对照工程菌蛋白和待检DNA经系列稀释, 取1 μl点于PVDF膜上,干燥，封闭，兔抗工程菌全菌蛋白的抗血清室温孵育2 h，洗膜3次,每次10 min。再用碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体孵育2 h。洗膜后加BCIP和NBT底物显色。(5)内切酶分析：利用VEGF 基因表达质粒特异性的内切酶分析；(6)PCR 分析：利用VEGF表达质粒的上下游引物进行PCR分析。
, 百拇医药
2 结果
质粒产量 ： VEGF表达质粒可从每批500 ml细菌培养液中纯化出2.5 mg无热源的质粒DNA。紫外吸收比值：经测定，3批样品的紫外吸收比值均为1.8～2.0。三批DNA经电泳后扫描分析，其超螺旋质粒DNA含量均达90%，无染色体DNA和RNA存在(图1)。按照染色体DNA杂交技术测定所得残留染色体DNA为4%。免疫斑点测定残留工程菌蛋白含量为0.06%。内切酶鉴定PCR与预期结果相符(图1)。
Lane 1，VEGF plasmid DNA ；Lane 2，VEGF plasmid DNA cut by Hind Ⅲ；
Lane 3，VEGF plasmid DNA cut by BamH I +EcoR I；
, http://www.100md.com
Lane 4，VEGF PCR product；Lane 5， Maker(Lamda DNA cut by Hind Ⅲ).
图1 VEGF质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Figure 1 Identification of VEGF plasmid DNA by using
agarose gel electrophoresis
3 讨论
VEGF基因治疗肢体闭塞性血管病的临床方案已获美国FDA和NIH批准，正在临床试用。目前国内尚缺乏明确的用于基因治疗的质粒DNA制剂的纯化和质控指标研究(Ferreira GN，Cabral JM，Prazaeres DM， et al. Bio Prog， 1999，15(4)；725-731)，本文对此进行了探讨，利用QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit纯化pcD2/VEGF121质粒，可以从500 ml细菌培养液中纯化出2.5 mg无热源的质粒DNA，此方法 提取的质粒具有收获量大、纯度高、超螺旋比例高、无热源等优点，其工程菌蛋白残留和染色体DNA残留、氨苄残留均能达到基因治疗的标准，已用于下肢闭塞性脉管病的动物试验，并取得良好的效果。本实验不仅为VEGF的基因治疗打下了基础，而且为其它的裸DNA基因治疗的临床研究提供了依据。
基金项目：国家863计划项目资助。(1999-09-22收稿), 百拇医药
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：基因疗法；血管内皮生长因子；质粒；分离和提纯；DNA；分离和提纯
北京医科大学学报000429 [中图分类号] Q342.4 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0383-01
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是特异性促进血管内皮细胞增殖的多肽生长因子。本文对用于基因治疗的人VEGF121真核表达质粒进行了批量纯化技术路线的研究，并率先在国内建立了人体基因治疗用表达质粒的质控指标。通过QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit提取的pcD2/VEGF121质粒DNA,纯度好,超螺旋比例高,可直接用于基因治疗，动物实验已取得良好的效果。
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1 材料与方法
质粒的提取：大肠杆菌XL1-Blue含pcD2/VEGF121质粒转化后挑取单克隆，接种到含有2 ml LA培养基的瓦氏管内，37℃振荡培养8 h。将培养菌稀释到2 000 ml LA培养基中，培养至细菌密度到1×109 ml-1。离心收获菌体。加P1、P2、P3缓冲液，冰浴30 min。除去沉淀，将样品上层析柱，加QC缓冲液洗柱2次。加QN缓冲液洗脱DNA，加0.7倍体积的异丙醇，混匀，离心弃上清。加入70%(体积分数)乙醇 10ml，离心弃上清。干燥。加PBS，使DNA溶解。
质粒DNA的质控：(1)紫外吸收比值：待检样品用生理盐水稀释，利用Beckman DU640紫外分光光度计在260和280 nm分别对待检样品进行测定；(2)超螺旋质粒DNA含量：样品每10 μl 2 μg上样，10 g*L-1琼脂糖电泳后利用凝胶成相系统扫描输入计算机进行超螺旋质粒DNA的分析测定；(3)残留染色体DNA含量检测：取2 μg细菌染色体DNA用Hind Ⅲ酶切,酚、氯仿、异戊醇抽提后乙醇沉淀。用DuPont公司的Random Primer Fluorescein Labeling Kit进行标记。VEGF质粒DNA点于尼龙膜后按DuPont公司的随机引物荧光素标记试剂盒的操作说明进行杂交；(4)残留工程菌蛋白质含量检测：利用免疫斑点测定技术检测，将对照工程菌蛋白和待检DNA经系列稀释, 取1 μl点于PVDF膜上,干燥，封闭，兔抗工程菌全菌蛋白的抗血清室温孵育2 h，洗膜3次,每次10 min。再用碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体孵育2 h。洗膜后加BCIP和NBT底物显色。(5)内切酶分析：利用VEGF 基因表达质粒特异性的内切酶分析；(6)PCR 分析：利用VEGF表达质粒的上下游引物进行PCR分析。
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2 结果
质粒产量 ： VEGF表达质粒可从每批500 ml细菌培养液中纯化出2.5 mg无热源的质粒DNA。紫外吸收比值：经测定，3批样品的紫外吸收比值均为1.8～2.0。三批DNA经电泳后扫描分析，其超螺旋质粒DNA含量均达90%，无染色体DNA和RNA存在(图1)。按照染色体DNA杂交技术测定所得残留染色体DNA为4%。免疫斑点测定残留工程菌蛋白含量为0.06%。内切酶鉴定PCR与预期结果相符(图1)。
Lane 1，VEGF plasmid DNA ；Lane 2，VEGF plasmid DNA cut by Hind Ⅲ；
Lane 3，VEGF plasmid DNA cut by BamH I +EcoR I；
, http://www.100md.com
Lane 4，VEGF PCR product；Lane 5， Maker(Lamda DNA cut by Hind Ⅲ).
图1 VEGF质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Figure 1 Identification of VEGF plasmid DNA by using
agarose gel electrophoresis
3 讨论
VEGF基因治疗肢体闭塞性血管病的临床方案已获美国FDA和NIH批准，正在临床试用。目前国内尚缺乏明确的用于基因治疗的质粒DNA制剂的纯化和质控指标研究(Ferreira GN，Cabral JM，Prazaeres DM， et al. Bio Prog， 1999，15(4)；725-731)，本文对此进行了探讨，利用QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit纯化pcD2/VEGF121质粒，可以从500 ml细菌培养液中纯化出2.5 mg无热源的质粒DNA，此方法 提取的质粒具有收获量大、纯度高、超螺旋比例高、无热源等优点，其工程菌蛋白残留和染色体DNA残留、氨苄残留均能达到基因治疗的标准，已用于下肢闭塞性脉管病的动物试验，并取得良好的效果。本实验不仅为VEGF的基因治疗打下了基础，而且为其它的裸DNA基因治疗的临床研究提供了依据。
基金项目：国家863计划项目资助。(1999-09-22收稿), 百拇医药