从培养细胞中快速提取总RNA的简便方法
作者：林炜 章涛 赵蓉
单位：福建医科大学分子医学教研室,福州 350004
关键词：RNA；分离和提纯；细胞；培养的
福建医科大学学报000342
中图分类号: R522-33; Q814.1; R394.3 文献标识码: A
文章编号:1000-2235(2000)03-0313-02
在分子生物学实验中,RNA 提取常常是令研究人员尤其是初学者头疼的项目,因为RNA酶在自然环境中广泛存在,且不易失活,所以,很难方便地提取纯度和完整性均满足分子生物学实验需要的RNA分子。尽管目前已有异硫氰酸胍-CsCl超速离心法[1]、TRIzol试剂法[2]等各种各样提取RNA的方法,但是,这些方法中有些方法步骤繁琐,耗时长,有些方法所需试剂昂贵,消耗大。笔者在实验中使用肝素作为RNase抑制剂,结合LiCl特异沉淀RNA,摸索一种新的从培养细胞中提取总RNA的快速简便方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 TEL 10 mmol /L Tris-HCl(pH 7.5),10 mmol/L EDTA,100 mmol/L LiCl。
1.1.2 TELH 10 mmolol/L Tris-HCl(pH 7.5),10 mmol/L EDTA,100 mmol/L LiCl,50 μg/ml Heparin(美国Sigma公司)。
1.1.3 TEL饱和酚 用TEL饱和重蒸酚,再用NaOH或Tris 调节pH到7.5～8.0
1.1.4 酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1(V/V)。
1.1.5 氯仿∶异戊醇为24∶1(V/V)。
, 百拇医药
1.1.6 5 mol/L LiCl。
1.1.7 焦碳酸二乙酯(DEPC,上海生工生物工程公司)。配制试剂均用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水,配制后4℃保存。
1.2 方法
所有器皿均按照提取RNA要求[3]严格处理,提取过程严格遵守提取RNA的规则,防止RNA酶的污染。
1.2.1 培养细胞收获
用胰蛋白酶液适度消化细胞,吸弃消化液。加4℃预冷PBS吹打悬浮细胞。800 g,4℃,离心5 min,弃上清。用适量(一般一个25 cm2培养瓶中汇合生长的细胞用PBS 1 ml)冷PBS重悬细胞后,800 g,4℃,离心5 min,弃净上清。
, 百拇医药
1.2.2 总RNA提取
1.2.2.1 用500 μl/管冰浴预冷的TELH重悬细胞,加250 μl/管预冷TEL饱和酚,翻转混匀30 s,加250 μl/管预冷氯仿∶异戊醇(24∶1),翻转混匀30 s,12000 g,4℃,离心10 min。
1.2.2.2 吸出水相到新Eppendorf管,加等体积预冷酚∶氯仿∶异戊醇,翻转混匀30 s,12000 g,4℃,离心7 min。
1.2.2.3 吸出水相到新Eppendorf管,加入1/10体积的5 mol/L LiCl,2倍体积无水乙醇,翻转混匀后置-20℃ 30 min,12000 g,4℃,离心7 min。
1.2.2.4 弃上清,RNA沉淀于离心管尖。加入75%乙醇,温和翻转数次,弃乙醇(必要时先在12000 g离心2 min)。置55℃温箱5 min,使乙醇完全挥发,加无RNase去离子水或TE 20 μl溶解RNA,置-70℃保存。
, http://www.100md.com
2 结 果
本法用于提取多种培养细胞的总RNA,所获RNA基本完整无降解,电泳检测可见清晰的28S、18S、5SrRNA条带。基本无DNA污染(附图)。OD260/280在1.85到2.0之间。每107个细胞可提取总RNA>50 μg,所获总RNA已成功地用于mRNA的分离和RT-PCR反应。
附图 TEL法与TRIzoL法提取RNA的比较
M1:λDNA/HindⅢ片段; 1.TRIzoL法提取的RNA; 2.TEL法提取的RNA; M2:1 kb DNA Ladder.
3 讨 论
, 百拇医药
该方法采用肝素作为RNase抑制剂[4],能够有效地抑制RNase。培养细胞用PBS洗涤后,经适量TELH重悬,直接与TEL饱和酚混合,同时完成细胞裂解和蛋白质变性两个过程,使RNA释出,经高速离心后细胞核DNA与变性的蛋白质存于有机相,含有RNA的水相加5 mol/L LiCl和无水乙醇特异沉淀RNA[5],由于该方法从细胞裂解到沉淀RNA在20 min内即可完成,也有效地避免了操作过程中的RNA降解。与目前常用的其他RNA提取法以及商品化的TRIzol试剂提取法相比较,方法稳定可靠,流程简单,操作时间短(不包括细胞收获,其他操作可在1 h内完成),所用试剂均为分子生物学实验室最常用试剂,便宜易得,整个实验中所用试剂总成本不到TRIzol试剂的1/10(表1～3)。不仅有利于有经验的操作者快速大批提取RNA,也有利于初学者迅速学习和掌握RNA提取的全过程,并获得满意的结果。所获得的总RNA能够满足mRNA分离、RT-PCR,以及其他一些与RNA有关的分子生物学实验的要求。
, 百拇医药 表1 不同提取方法提取几株培养细胞总RNA的量和纯度比较 细胞系
总RNA量(μg/107细胞)
纯度(OD260/280)
本法
TRIzol试剂法
本法
TRIzol试剂法
BGC-823
62
65
1.87
, 百拇医药
2.10
K562
78
74
1.92
1.95
SGC-7901
59
62
1.89
1.92
HepG-2
95
, 百拇医药
90
1.85
2.07
L-02
83
79
1.87
1.86
表2 不同的RNA提取方法各步骤使用时间比较(h)
本 法
异硫氰酸胍-CsCl超速离心
盐酸胍-
, http://www.100md.com 有机溶剂
TRIzol
试剂法
离心
≤0.5
>12
≥1.5
>0.5
其他操作
≤0.5
>0.5
>4
≥0.2
, http://www.100md.com
总耗时
≈1
>12
>5
≈1
表3 不同的RNA提取方法使用的主要试剂比较
本 法
异硫氰酸胍-CsCl超速离心
盐酸胍-
有机溶剂
TRIzol
试剂法
, 百拇医药 异硫氰酸胍
无
有
盐酸胍
TRIzol(含异硫
氰酸胍和酚)
SDS
无
有
SLS
无
酚,氯仿
有
, http://www.100md.com 有
有
有
乙醇
有(可用异丙醇代)
有
有
异丙醇
蛋白酶
无
无
无
无
无机试剂
, http://www.100md.com
LiCl
CsCl
NaAc
不确定
此方法的操作过程要点在于,(1)整个操作过程要尽量维持低温,所有试剂均应置于冰浴中,离心过程均在4℃下进行。(2)操作要迅速连贯,除了方法中标明的时间以外,其余操作均应尽量快速完成。低温条件能够有效抑制RNA酶活性,操作的快速连贯可减少外源性RNA酶污染的机会。
作者简介:林 炜(1964～),男,讲师,博士研究生.
参考文献:
[1] Chirgwin JJ,Przbyla AE,MacDonald RJ,et al. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease[J]. Biochemistry, 1979,18:5294.
, http://www.100md.com
[2] Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem, 1987,162:156～159.
[3] Sambrook J. 分子克隆实验指南[M].第2版. 北京:科学出版社, 1999.343.
[4] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M].第2版. 北京:中国协和医科大学出版社,1999.138.
[5] Palmiter RD. Magnesium prescripitation of ribonucleoprotein complexes:Expedient techniques for the isolation of undegraded polysomes and messenger ribonuleic acid[J]. Biochemistry, 1974,13:3606.
收稿日期:2000-05-23, http://www.100md.com
单位：福建医科大学分子医学教研室,福州 350004
关键词：RNA；分离和提纯；细胞；培养的
福建医科大学学报000342
中图分类号: R522-33; Q814.1; R394.3 文献标识码: A
文章编号:1000-2235(2000)03-0313-02
在分子生物学实验中,RNA 提取常常是令研究人员尤其是初学者头疼的项目,因为RNA酶在自然环境中广泛存在,且不易失活,所以,很难方便地提取纯度和完整性均满足分子生物学实验需要的RNA分子。尽管目前已有异硫氰酸胍-CsCl超速离心法[1]、TRIzol试剂法[2]等各种各样提取RNA的方法,但是,这些方法中有些方法步骤繁琐,耗时长,有些方法所需试剂昂贵,消耗大。笔者在实验中使用肝素作为RNase抑制剂,结合LiCl特异沉淀RNA,摸索一种新的从培养细胞中提取总RNA的快速简便方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 TEL 10 mmol /L Tris-HCl(pH 7.5),10 mmol/L EDTA,100 mmol/L LiCl。
1.1.2 TELH 10 mmolol/L Tris-HCl(pH 7.5),10 mmol/L EDTA,100 mmol/L LiCl,50 μg/ml Heparin(美国Sigma公司)。
1.1.3 TEL饱和酚 用TEL饱和重蒸酚,再用NaOH或Tris 调节pH到7.5～8.0
1.1.4 酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1(V/V)。
1.1.5 氯仿∶异戊醇为24∶1(V/V)。
, 百拇医药
1.1.6 5 mol/L LiCl。
1.1.7 焦碳酸二乙酯(DEPC,上海生工生物工程公司)。配制试剂均用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水,配制后4℃保存。
1.2 方法
所有器皿均按照提取RNA要求[3]严格处理,提取过程严格遵守提取RNA的规则,防止RNA酶的污染。
1.2.1 培养细胞收获
用胰蛋白酶液适度消化细胞,吸弃消化液。加4℃预冷PBS吹打悬浮细胞。800 g,4℃,离心5 min,弃上清。用适量(一般一个25 cm2培养瓶中汇合生长的细胞用PBS 1 ml)冷PBS重悬细胞后,800 g,4℃,离心5 min,弃净上清。
, 百拇医药
1.2.2 总RNA提取
1.2.2.1 用500 μl/管冰浴预冷的TELH重悬细胞,加250 μl/管预冷TEL饱和酚,翻转混匀30 s,加250 μl/管预冷氯仿∶异戊醇(24∶1),翻转混匀30 s,12000 g,4℃,离心10 min。
1.2.2.2 吸出水相到新Eppendorf管,加等体积预冷酚∶氯仿∶异戊醇,翻转混匀30 s,12000 g,4℃,离心7 min。
1.2.2.3 吸出水相到新Eppendorf管,加入1/10体积的5 mol/L LiCl,2倍体积无水乙醇,翻转混匀后置-20℃ 30 min,12000 g,4℃,离心7 min。
1.2.2.4 弃上清,RNA沉淀于离心管尖。加入75%乙醇,温和翻转数次,弃乙醇(必要时先在12000 g离心2 min)。置55℃温箱5 min,使乙醇完全挥发,加无RNase去离子水或TE 20 μl溶解RNA,置-70℃保存。
, http://www.100md.com
2 结 果
本法用于提取多种培养细胞的总RNA,所获RNA基本完整无降解,电泳检测可见清晰的28S、18S、5SrRNA条带。基本无DNA污染(附图)。OD260/280在1.85到2.0之间。每107个细胞可提取总RNA>50 μg,所获总RNA已成功地用于mRNA的分离和RT-PCR反应。
附图 TEL法与TRIzoL法提取RNA的比较
M1:λDNA/HindⅢ片段; 1.TRIzoL法提取的RNA; 2.TEL法提取的RNA; M2:1 kb DNA Ladder.
3 讨 论
, 百拇医药
该方法采用肝素作为RNase抑制剂[4],能够有效地抑制RNase。培养细胞用PBS洗涤后,经适量TELH重悬,直接与TEL饱和酚混合,同时完成细胞裂解和蛋白质变性两个过程,使RNA释出,经高速离心后细胞核DNA与变性的蛋白质存于有机相,含有RNA的水相加5 mol/L LiCl和无水乙醇特异沉淀RNA[5],由于该方法从细胞裂解到沉淀RNA在20 min内即可完成,也有效地避免了操作过程中的RNA降解。与目前常用的其他RNA提取法以及商品化的TRIzol试剂提取法相比较,方法稳定可靠,流程简单,操作时间短(不包括细胞收获,其他操作可在1 h内完成),所用试剂均为分子生物学实验室最常用试剂,便宜易得,整个实验中所用试剂总成本不到TRIzol试剂的1/10(表1～3)。不仅有利于有经验的操作者快速大批提取RNA,也有利于初学者迅速学习和掌握RNA提取的全过程,并获得满意的结果。所获得的总RNA能够满足mRNA分离、RT-PCR,以及其他一些与RNA有关的分子生物学实验的要求。
, 百拇医药 表1 不同提取方法提取几株培养细胞总RNA的量和纯度比较 细胞系
总RNA量(μg/107细胞)
纯度(OD260/280)
本法
TRIzol试剂法
本法
TRIzol试剂法
BGC-823
62
65
1.87
, 百拇医药
2.10
K562
78
74
1.92
1.95
SGC-7901
59
62
1.89
1.92
HepG-2
95
, 百拇医药
90
1.85
2.07
L-02
83
79
1.87
1.86
表2 不同的RNA提取方法各步骤使用时间比较(h)
本 法
异硫氰酸胍-CsCl超速离心
盐酸胍-
, http://www.100md.com 有机溶剂
TRIzol
试剂法
离心
≤0.5
>12
≥1.5
>0.5
其他操作
≤0.5
>0.5
>4
≥0.2
, http://www.100md.com
总耗时
≈1
>12
>5
≈1
表3 不同的RNA提取方法使用的主要试剂比较
本 法
异硫氰酸胍-CsCl超速离心
盐酸胍-
有机溶剂
TRIzol
试剂法
, 百拇医药 异硫氰酸胍
无
有
盐酸胍
TRIzol(含异硫
氰酸胍和酚)
SDS
无
有
SLS
无
酚,氯仿
有
, http://www.100md.com 有
有
有
乙醇
有(可用异丙醇代)
有
有
异丙醇
蛋白酶
无
无
无
无
无机试剂
, http://www.100md.com
LiCl
CsCl
NaAc
不确定
此方法的操作过程要点在于,(1)整个操作过程要尽量维持低温,所有试剂均应置于冰浴中,离心过程均在4℃下进行。(2)操作要迅速连贯,除了方法中标明的时间以外,其余操作均应尽量快速完成。低温条件能够有效抑制RNA酶活性,操作的快速连贯可减少外源性RNA酶污染的机会。
作者简介:林 炜(1964～),男,讲师,博士研究生.
参考文献:
[1] Chirgwin JJ,Przbyla AE,MacDonald RJ,et al. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease[J]. Biochemistry, 1979,18:5294.
, http://www.100md.com
[2] Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem, 1987,162:156～159.
[3] Sambrook J. 分子克隆实验指南[M].第2版. 北京:科学出版社, 1999.343.
[4] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M].第2版. 北京:中国协和医科大学出版社,1999.138.
[5] Palmiter RD. Magnesium prescripitation of ribonucleoprotein complexes:Expedient techniques for the isolation of undegraded polysomes and messenger ribonuleic acid[J]. Biochemistry, 1974,13:3606.
收稿日期:2000-05-23, http://www.100md.com