丹参对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响
作者：石 缨 温进 坤
单位：河北医科大学(050017)基础所生化室
关键词：丹参；血管平滑肌细胞；骨桥蛋白
心肺血管病杂志990321 摘要 观察丹参对血管平滑肌细胞迁移的作用，并探讨其作用机理 。本研究用羟基脲抑制血管平滑肌细胞增殖后，观察丹参对血管平滑肌细胞迁移、迁移相关 基因表达及能量转换的影响。发现丹参对新生小牛血清诱导的血管平滑肌细胞迁移具有显著 抑制作用；Northern杂交结果表明丹参可抑制与细胞迁移相关的骨桥蛋白基因表达；肌酸激 酶活性分析显示丹参可显著降低该酶活性。上述结果提示：丹参抑制血管平滑肌细胞迁移的 作用与抑制骨桥蛋白基因表达和减缓能量转换有关。
Studies of Salvia Miltiorrhiza Bunge on Rat Vascular Smooth Muscl e Cell Migration
, 百拇医药
Shi Ying, Wen Jinkun
Dept. of Biochemistry, Institute of Basic Medcine,Hebei Medical University, Shijiazhuang(050017)
Abstract In order to investigate the effects and the m echanisms of Salvia Miltiorrhiza Bunge(SMB) on the vascular smooth muscle cell ( V SMC) migration, the behaviors of VSMC, including migration, migration related ge n e expression and energy transmission, were observed. It was shown in the result that the migration of VSMC induced by newborn calf serum can be suppressed by SM B. The result of northern blot suggested that the cell migration related osteopontin g ene expression can be suppressed by SMB. It was observed that the CK activity ca n be reduced remarkably by SMB. These results proposed that the inhibition of SMB o n VSMC migration is associated with the decrease of osteopontin gene expression and energy transmission.
, 百拇医药
Key words: Salvia miltiorrhiza bunge; Vascular smooth muscle cel l; Osteopontin
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的增殖和迁移 在动脉粥样硬化斑块形成及血管成形术后再狭窄的发生过程中起着重要作用，因此如何有效 抑制VSMC的增殖和迁移成为近年来研究的热点。以往的研究证实丹参注射液能显著抑制VSMC 增殖[1]，但其对VSMC迁移有无影响尚未见报道。本研究以体外培养的大鼠VSMC为 对象，观察丹参注射液对VSMC迁移及迁移相关基因表达的影响，以期为丹参的活血化瘀功效 提供新的实验依据。
材料与方法
一、 材料 SD大鼠由河北省实验动物中心提供；M199培养基为GIBCO公司产品 ；新生小牛血清为本室自制；丹参注射液为常熟制药厂产品，批号960514，规格2 ml/支， 每ml含生药1.5g；羟基脲为Sigma公司产品；骨桥蛋白cDNA探针为本室保存；(α-32 P)dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司；肌酸激酶试剂盒为上海长征医学科学公司产品。
, 百拇医药
二、 方法 1. 大鼠VSMC培养 选用8～10周龄雄性SD大鼠，取其胸主动脉，应用贴块法 [2]，于37℃5%CO2培养箱内，用含10%新生小牛血清的M199培养液(含青霉素1.0× 105U/L，链霉素0.1g/L)进行原代培养，待VSMC爬满培养瓶后，胰蛋白酶消化传代， 取5 ～10代细胞进行实验。2. 丹参注射液对VSMC迁移的影响 参照我室以往建立的方法[ 3]，在传代时将盖玻片置于培养瓶中，待细胞长满后，以无血清M199培养液+0.005mol /L 羟基脲饥饿培养24h后，取出盖玻片，在显微镜下用无菌刀片将VSMC沿直线刮除一侧，放入 含20%新生小牛血清+0.005mol/L羟基脲的M199培养液(对照组)中继续培养，实验组同时给予 7.5g/L或15g/L的丹参注射液，分别于24 h，48h和72h在显微镜下用测微尺测定各组细胞的 迁移距离。3. 丹参注射液对骨桥蛋白基因表达的影响 接近铺满80%瓶底的传代VSMC以无血 清M199培养液+0.005mol/L羟基脲饥饿培养24 h后，分别换成含20%新生小牛血清+0.005 mol/ L羟基脲或20%新生小牛血清+15g/L丹参注射液+0.005mol/L羟基脲的M199培养液，继续培养2 4 h后，采用异硫氰酸胍一步法[4]提取细胞总RNA。取RNA30 μg，经1%琼脂糖-甲 醛变性凝胶电泳后，转移至尼龙膜上。骨桥蛋白cDNA片段用随机引物法进行标记，按文献 [5]方法与尼龙膜杂交。4. 肌酸激酶活性测定：VSMC在上述条件下培养24 h后，用po liceman刮取细胞，回收的细胞用0.1ml生理盐水悬浮，于冰水浴中匀浆后，4℃5 000g离心5 min，取上清液按Folin酚法测定蛋白含量。将各样品用生理盐水调整蛋白浓度一致后，取 等 体积提取液按酶偶联法用自动生化分析仪测定肌酸激酶活性。每种样品重复测定5次，取平 均值。
, 百拇医药
三、 统计学处理 全部实验数据均采用
±s表示，差异的显著性检验采用组间t检验 。
结 果
一、 丹参对VSMC迁移的影响 由图1可见，丹参能显著抑制体外培养的VSMC迁移(P<0.01)。在所观察的各时间点，丹参组细胞的迁移距离显著低于对照组，2种浓 度的丹参对VSMC迁移距离的影响无明显差异，提示7.5g/L的丹参对VSMC迁移已产生显著抑制 作用。
图1 丹参对血管平滑肌细胞迁移的影响
20%新生小牛血清(对照组) △20%新生小牛血清+7.5g/L丹参注射液 ■20%新生小牛血清 +15g/L丹参注射液与对照相比，*P<0.01
, 百拇医药
二、 丹参对VSMC骨桥蛋白基因表达的影响 在无血清培养液中生长的VSMC，其RNA与骨桥蛋 白cDNA探针杂交后无明显的杂交信号(照片未显示)；在含新生小牛血清的培养液中培养 24 h(对照组)后，可见明显的杂交带，表明新生小牛血清能诱导VSMC骨桥蛋白基因表达；丹 参作用于VSMC 24 h后，其杂交信号比对照组明显减弱，提示丹参对新生小牛血清诱导的骨 桥蛋白基因表达具有抑制作用(图2)。
图2 丹参对血管平滑肌细胞骨桥蛋白基因表达的影响
A：20%新生小牛血清(对照)B：20%新生小牛血清+15g/L丹参注射液
三、 丹参对VSMC肌酸激酶活性的影响 VSMC在含有丹参的培养液中培养24 h后，其 肌酸激酶活性明显低于对照组(P<0.05)，见图3。
, 百拇医药
图3 丹参对VSMC肌酸激酶活性的影响
A：20%新生小牛血清(对照组)B：20%新生小牛血清+15g/L丹参注射液与对照相比，*P<0.05
讨 论
动脉粥样硬化主要病理学特征是血管壁中层的VSMC增殖及向内膜下迁移。正常情况下，动脉 壁中层的VSMC处于分化状态，呈收缩表型，没有增殖和迁移的能力，但在多种刺激因素作用 下，VSMC可由分化状态转变为去分化状态，表型从收缩型转变为合成型，并从中膜迁移至 内 膜进行大量增殖。已经证明两种表型的VSMC在基因表达上存在明显差异，Shanahan等[ 6]用差异cD NA显示技术在呈增殖状态的VSMC中分离到两种显著表达的cDNA，分别为骨桥蛋白(osteopont in)cDNA和基质Gla蛋白cDNA，两者在呈分化状态的VSMC中几乎不进行表达。骨 桥蛋白是一种细胞外基质，其氨基酸序列中含有一个RGD(Arg-Gly-Asp)细胞粘附基元，这一 特殊结构与细胞粘附和迁移功能密切相关[7]，其它一些与细胞粘附和迁移功能有 关的细胞基质粘附蛋白如纤维连结蛋白，层粘连蛋白，玻连蛋白等也都具备该结构。VSMC迁 移的机制非常复杂，众多的生长因子、细胞因子和细胞外基质均能够刺激VSMC的迁移。我们 先前的研究表明：新生小牛血清能显著促进VSMC的迁移，并证实此作用与诱导VSMC骨桥蛋白 基因表达有关。
, 百拇医药
动脉粥样硬化属于中医学中的“血瘀”“瘀阻”等范畴[8]。中医学认为丹参具有 活血化瘀功效，现代医学研究证明，丹参的活血化瘀作用与其具有抑制血小板聚集、抗凝、 抗血栓的功能有关[9]。近年来研究还证实丹参能抑制VSMC的增殖[1]，但 其对VSMC迁移有无直接作用尚无报道。本研究通过羟基脲抑制VSMC增殖，去除细胞增殖给测 定细胞迁移距离造成的误差后，观察丹参对VSMC迁移的影响。结果发现，7.5g/L丹参注射液 即可显著抑制VSMC迁移，Northern杂交结果提示，在无血清培养液中培养的静止期细胞，骨 桥蛋白几乎不进行表达，在新生小牛血清刺激后发生迁移的VSMC中，骨桥蛋白表达被显著诱 导，而丹参在抑制VSMC迁移的同时，也明显抑制了骨桥蛋白基因的表达，提示丹参抑制VSMC 迁移的作用与抑制VSMC骨桥蛋白基因表达有关，即丹参可能通过抑制骨桥蛋白基因表达， 使VSMC分泌骨桥蛋白减少而起到抑制细胞迁移的作用。肌酸激酶是细胞内与能量转换有关的 酶类，VSMC迁移是消耗能量的过程，从丹参能抑制VSMC肌酸激酶的活性这一点表明丹参还可 通过抑制细胞能量转换而达到抑制VSMC迁移的目的。本研究为丹参活血化瘀以及抗动脉粥样 硬化的功效提供了又一新的实验依据。
, 百拇医药
参考文献
1 周小明，陆再英，汪道文.丹参防治实验性动脉再狭窄及其机制的初 步研究.中国中西医结合杂志，1996，16：480.
2 Hirata Y, Takagi Y, Takata S, et al. Calcitonin generelated peptide receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells. Biochem Biophys Res Co mmun, 1988, 151:1113.
3 石缨，温进坤.碱性成纤维细胞生长因子新生小牛血清和肝素对大鼠血管平滑肌细胞迁 移的影响.中国动脉硬化杂志，1998，6：271.
4 Chinczyski P, Sacchi N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidin ium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156.
, 百拇医药
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 363～371.
6 Shanahan CM, Weissberg PL, Metcalfe JC. Isolation of gene markers of differen tiated and proliferating vascular smooth muscle cells. Circ Res, 1993,73:193
7 Oldberg A, Franzen A, Heinegard D. Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence. P roc Natl Acad Sci USA, 1986,83:8819.
8 陈可冀.90年代心血管病中医药的临床研究方向.中医杂志，1990，31：48.
9 张白嘉，刘榴.丹参水溶部分药理研究进展.中草药，1996，27：634.
(1998-11-12收稿)
(1999-12-28修回), 百拇医药
单位：河北医科大学(050017)基础所生化室
关键词：丹参；血管平滑肌细胞；骨桥蛋白
心肺血管病杂志990321 摘要 观察丹参对血管平滑肌细胞迁移的作用，并探讨其作用机理 。本研究用羟基脲抑制血管平滑肌细胞增殖后，观察丹参对血管平滑肌细胞迁移、迁移相关 基因表达及能量转换的影响。发现丹参对新生小牛血清诱导的血管平滑肌细胞迁移具有显著 抑制作用；Northern杂交结果表明丹参可抑制与细胞迁移相关的骨桥蛋白基因表达；肌酸激 酶活性分析显示丹参可显著降低该酶活性。上述结果提示：丹参抑制血管平滑肌细胞迁移的 作用与抑制骨桥蛋白基因表达和减缓能量转换有关。
Studies of Salvia Miltiorrhiza Bunge on Rat Vascular Smooth Muscl e Cell Migration
, 百拇医药
Shi Ying, Wen Jinkun
Dept. of Biochemistry, Institute of Basic Medcine,Hebei Medical University, Shijiazhuang(050017)
Abstract In order to investigate the effects and the m echanisms of Salvia Miltiorrhiza Bunge(SMB) on the vascular smooth muscle cell ( V SMC) migration, the behaviors of VSMC, including migration, migration related ge n e expression and energy transmission, were observed. It was shown in the result that the migration of VSMC induced by newborn calf serum can be suppressed by SM B. The result of northern blot suggested that the cell migration related osteopontin g ene expression can be suppressed by SMB. It was observed that the CK activity ca n be reduced remarkably by SMB. These results proposed that the inhibition of SMB o n VSMC migration is associated with the decrease of osteopontin gene expression and energy transmission.
, 百拇医药
Key words: Salvia miltiorrhiza bunge; Vascular smooth muscle cel l; Osteopontin
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的增殖和迁移 在动脉粥样硬化斑块形成及血管成形术后再狭窄的发生过程中起着重要作用，因此如何有效 抑制VSMC的增殖和迁移成为近年来研究的热点。以往的研究证实丹参注射液能显著抑制VSMC 增殖[1]，但其对VSMC迁移有无影响尚未见报道。本研究以体外培养的大鼠VSMC为 对象，观察丹参注射液对VSMC迁移及迁移相关基因表达的影响，以期为丹参的活血化瘀功效 提供新的实验依据。
材料与方法
一、 材料 SD大鼠由河北省实验动物中心提供；M199培养基为GIBCO公司产品 ；新生小牛血清为本室自制；丹参注射液为常熟制药厂产品，批号960514，规格2 ml/支， 每ml含生药1.5g；羟基脲为Sigma公司产品；骨桥蛋白cDNA探针为本室保存；(α-32 P)dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司；肌酸激酶试剂盒为上海长征医学科学公司产品。
, 百拇医药
二、 方法 1. 大鼠VSMC培养 选用8～10周龄雄性SD大鼠，取其胸主动脉，应用贴块法 [2]，于37℃5%CO2培养箱内，用含10%新生小牛血清的M199培养液(含青霉素1.0× 105U/L，链霉素0.1g/L)进行原代培养，待VSMC爬满培养瓶后，胰蛋白酶消化传代， 取5 ～10代细胞进行实验。2. 丹参注射液对VSMC迁移的影响 参照我室以往建立的方法[ 3]，在传代时将盖玻片置于培养瓶中，待细胞长满后，以无血清M199培养液+0.005mol /L 羟基脲饥饿培养24h后，取出盖玻片，在显微镜下用无菌刀片将VSMC沿直线刮除一侧，放入 含20%新生小牛血清+0.005mol/L羟基脲的M199培养液(对照组)中继续培养，实验组同时给予 7.5g/L或15g/L的丹参注射液，分别于24 h，48h和72h在显微镜下用测微尺测定各组细胞的 迁移距离。3. 丹参注射液对骨桥蛋白基因表达的影响 接近铺满80%瓶底的传代VSMC以无血 清M199培养液+0.005mol/L羟基脲饥饿培养24 h后，分别换成含20%新生小牛血清+0.005 mol/ L羟基脲或20%新生小牛血清+15g/L丹参注射液+0.005mol/L羟基脲的M199培养液，继续培养2 4 h后，采用异硫氰酸胍一步法[4]提取细胞总RNA。取RNA30 μg，经1%琼脂糖-甲 醛变性凝胶电泳后，转移至尼龙膜上。骨桥蛋白cDNA片段用随机引物法进行标记，按文献 [5]方法与尼龙膜杂交。4. 肌酸激酶活性测定：VSMC在上述条件下培养24 h后，用po liceman刮取细胞，回收的细胞用0.1ml生理盐水悬浮，于冰水浴中匀浆后，4℃5 000g离心5 min，取上清液按Folin酚法测定蛋白含量。将各样品用生理盐水调整蛋白浓度一致后，取 等 体积提取液按酶偶联法用自动生化分析仪测定肌酸激酶活性。每种样品重复测定5次，取平 均值。
, 百拇医药
三、 统计学处理 全部实验数据均采用
±s表示，差异的显著性检验采用组间t检验 。结 果
一、 丹参对VSMC迁移的影响 由图1可见，丹参能显著抑制体外培养的VSMC迁移(P<0.01)。在所观察的各时间点，丹参组细胞的迁移距离显著低于对照组，2种浓 度的丹参对VSMC迁移距离的影响无明显差异，提示7.5g/L的丹参对VSMC迁移已产生显著抑制 作用。
图1 丹参对血管平滑肌细胞迁移的影响
20%新生小牛血清(对照组) △20%新生小牛血清+7.5g/L丹参注射液 ■20%新生小牛血清 +15g/L丹参注射液与对照相比，*P<0.01
, 百拇医药
二、 丹参对VSMC骨桥蛋白基因表达的影响 在无血清培养液中生长的VSMC，其RNA与骨桥蛋 白cDNA探针杂交后无明显的杂交信号(照片未显示)；在含新生小牛血清的培养液中培养 24 h(对照组)后，可见明显的杂交带，表明新生小牛血清能诱导VSMC骨桥蛋白基因表达；丹 参作用于VSMC 24 h后，其杂交信号比对照组明显减弱，提示丹参对新生小牛血清诱导的骨 桥蛋白基因表达具有抑制作用(图2)。
图2 丹参对血管平滑肌细胞骨桥蛋白基因表达的影响
A：20%新生小牛血清(对照)B：20%新生小牛血清+15g/L丹参注射液
三、 丹参对VSMC肌酸激酶活性的影响 VSMC在含有丹参的培养液中培养24 h后，其 肌酸激酶活性明显低于对照组(P<0.05)，见图3。
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图3 丹参对VSMC肌酸激酶活性的影响
A：20%新生小牛血清(对照组)B：20%新生小牛血清+15g/L丹参注射液与对照相比，*P<0.05
讨 论
动脉粥样硬化主要病理学特征是血管壁中层的VSMC增殖及向内膜下迁移。正常情况下，动脉 壁中层的VSMC处于分化状态，呈收缩表型，没有增殖和迁移的能力，但在多种刺激因素作用 下，VSMC可由分化状态转变为去分化状态，表型从收缩型转变为合成型，并从中膜迁移至 内 膜进行大量增殖。已经证明两种表型的VSMC在基因表达上存在明显差异，Shanahan等[ 6]用差异cD NA显示技术在呈增殖状态的VSMC中分离到两种显著表达的cDNA，分别为骨桥蛋白(osteopont in)cDNA和基质Gla蛋白cDNA，两者在呈分化状态的VSMC中几乎不进行表达。骨 桥蛋白是一种细胞外基质，其氨基酸序列中含有一个RGD(Arg-Gly-Asp)细胞粘附基元，这一 特殊结构与细胞粘附和迁移功能密切相关[7]，其它一些与细胞粘附和迁移功能有 关的细胞基质粘附蛋白如纤维连结蛋白，层粘连蛋白，玻连蛋白等也都具备该结构。VSMC迁 移的机制非常复杂，众多的生长因子、细胞因子和细胞外基质均能够刺激VSMC的迁移。我们 先前的研究表明：新生小牛血清能显著促进VSMC的迁移，并证实此作用与诱导VSMC骨桥蛋白 基因表达有关。
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动脉粥样硬化属于中医学中的“血瘀”“瘀阻”等范畴[8]。中医学认为丹参具有 活血化瘀功效，现代医学研究证明，丹参的活血化瘀作用与其具有抑制血小板聚集、抗凝、 抗血栓的功能有关[9]。近年来研究还证实丹参能抑制VSMC的增殖[1]，但 其对VSMC迁移有无直接作用尚无报道。本研究通过羟基脲抑制VSMC增殖，去除细胞增殖给测 定细胞迁移距离造成的误差后，观察丹参对VSMC迁移的影响。结果发现，7.5g/L丹参注射液 即可显著抑制VSMC迁移，Northern杂交结果提示，在无血清培养液中培养的静止期细胞，骨 桥蛋白几乎不进行表达，在新生小牛血清刺激后发生迁移的VSMC中，骨桥蛋白表达被显著诱 导，而丹参在抑制VSMC迁移的同时，也明显抑制了骨桥蛋白基因的表达，提示丹参抑制VSMC 迁移的作用与抑制VSMC骨桥蛋白基因表达有关，即丹参可能通过抑制骨桥蛋白基因表达， 使VSMC分泌骨桥蛋白减少而起到抑制细胞迁移的作用。肌酸激酶是细胞内与能量转换有关的 酶类，VSMC迁移是消耗能量的过程，从丹参能抑制VSMC肌酸激酶的活性这一点表明丹参还可 通过抑制细胞能量转换而达到抑制VSMC迁移的目的。本研究为丹参活血化瘀以及抗动脉粥样 硬化的功效提供了又一新的实验依据。
, 百拇医药
参考文献
1 周小明，陆再英，汪道文.丹参防治实验性动脉再狭窄及其机制的初 步研究.中国中西医结合杂志，1996，16：480.
2 Hirata Y, Takagi Y, Takata S, et al. Calcitonin generelated peptide receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells. Biochem Biophys Res Co mmun, 1988, 151:1113.
3 石缨，温进坤.碱性成纤维细胞生长因子新生小牛血清和肝素对大鼠血管平滑肌细胞迁 移的影响.中国动脉硬化杂志，1998，6：271.
4 Chinczyski P, Sacchi N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidin ium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156.
, 百拇医药
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 363～371.
6 Shanahan CM, Weissberg PL, Metcalfe JC. Isolation of gene markers of differen tiated and proliferating vascular smooth muscle cells. Circ Res, 1993,73:193
7 Oldberg A, Franzen A, Heinegard D. Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence. P roc Natl Acad Sci USA, 1986,83:8819.
8 陈可冀.90年代心血管病中医药的临床研究方向.中医杂志，1990，31：48.
9 张白嘉，刘榴.丹参水溶部分药理研究进展.中草药，1996，27：634.
(1998-11-12收稿)
(1999-12-28修回), 百拇医药