一种快速定量检测人血清载脂蛋白J的方法
作者：崇巍 商秀丽 张锦
单位：
商秀丽(第一临床学院神经内科)；商秀丽(第一临床学院内分泌科)；崇巍(中国医科大学第一临床学院急诊科，沈阳 110001)；商秀丽(中国医科大学第一临床学院急诊科，沈阳 110001)；张锦(中国医科大学第一临床学院急诊科，沈阳 110001)
关键词：载脂蛋白J；酶联免疫吸附法
中国医科大学学报000135 Desilva等[1]于1996年运用免疫吸附层析结合反向高效液相层析技术从人血清中分离提纯出一种新的载脂蛋白，命名为apoJ。结构分析揭示apoJ和sp40，40、CLI、PADHC、NAI/A2、PTB16及K611等为同一蛋白。apoJ在人体不同组织广泛存在，提示其基本而重要的生理功能。已知apoJ参与多种生理过程，如脂质的转运，补体功能的调节，精子的成熟、组织的再生及生物活性肽的转运等。apoJ在许多病理过程中有所表达，如肾小球肾炎、囊性肾病、肾小管损伤、动脉粥样硬化、心肌梗死、神经退行性疾病等。为对apoJ进行深入广泛的研究，亟待建立一种体液apoJ水平快速、高效、经济实用的检测方法。
, 百拇医药
本文旨在探索建立一种酶联免疫吸附法(ELISA)来测定血清apoJ水平。
1 材料与方法
材料：30例正常人空腹静脉血分离血清。人apoJ纯冻干品，人apoJ单克隆抗体(Quidel公司)。HRP标记的山羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。四甲联苯胺(TMB)反应液A，显色液B及终止液C(上海科华生物技术有限公司)。缓冲液：pH 7.4，7.6 mmol/L的PBS，稀释液：含0.2% Tween 20的上述缓冲液，洗涤液：含0.1% Tween 20的上述缓冲液(自配)。
方法：
(1) 用pH 7.2、10 mmol/L的PBS恢复apoJ冻干品，将其稀释为1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800 6个标准浓度，用于绘制标准曲线。
, 百拇医药
(2) 按1/4 000稀释待测人血清。
(3) 将(1)中的标准液和(2)中的待测血清稀释液加于酶标板上，用稀释液作空白对照，100 μl/孔。
(4) 4℃下包被48 h，甩干，洗板3次，每次3 min。
(5) 加入1/1 000稀释的apoJ单克隆抗体，100 μl/孔。
(6) 37℃下孵育1 h，甩干并洗板3次，3 min/次。
(7) 加入1/400稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG,100 μl/孔。
(8) 37℃下孵育1 h，甩干洗板3次，3 min/次。
(9) 加入TMB反应液及显色液。37℃下孵育5 min，加入终止液。
, http://www.100md.com
(10) 上酶标仪于450 nm处读取吸光度。
(11) 利用apoJ标准稀释液的吸光度绘制标准曲线。
(12) 据待测血清的吸光度在标准曲线上计算出相应的apoJ浓度。
2 结果与讨论
Hogasen等发现，apoJ对聚苯乙稀板，尤其是Nunc板有极强的结合能力。这种结合力属于疏水作用，在Tween 20存在时得以加强，而且不被阻断或其它去污剂清除。这一特性只为少数血清蛋白所有[2]。
本研究采用单抗体ELISA测定血清apoJ水平，血清标本的稀释度达1/400，结果为(99±36) mg/L。Murphy和Choi等应用双抗夹心ELISA测定血清apoJ水平，血清标本稀释度为1/10，中位数分别为62 mg/L和123 mg/L[3，4]。因为apoJ对聚苯乙烯酶的非特异吸附作用，双抗夹心ELISA中的一抗实际上几乎没起作用，因此本研究采用单抗体ELISA。
, 百拇医药
本方法将标本的包被时间由24 h延长为48 h，从而提高了血清apoJ对酶标板的吸附效率。用TMB取代ABTS显色，显色效果明显改善，而且更加敏感。同时降低了检测成本。和既往其它方法相比，本研究建立的单抗体ELISA，使用材料少，标准品及单克隆抗体稀释度大，检测成本降低，为一种高效、快速、经济实用的血清apoJ测定方法。
辽宁省自然科学基金资助项目，962294
参考文献
1，Desilva HV, Stuart WD, Duvic CR, et al. A70-Kda apolipoprotein designated APOJ is a marker for subclasses of human plasma high density lipoproteins. J Biol Chem, 1990,265:13240_13247
, 百拇医药
2，，Hogasen K, Mollnes TE, Tschopp J, et al. Quantitation of vitronectin and clusterin: pitfalls and solutions in enzyme imunoassays for adensive proteins. J Immunol Methods, 1993,160:107_115
3，，Murphy BF, Kirszbaum L, Walker ID, et al. SP-40, 40 a newly identified normal human serum protein found in the SC56-9 complex of complement and in the immune deposits of glomerulonephritis. J Clin Invest, 1988,81:1858_1864
4，，Choi NH, Tobe T, Hara K, et al. Sandwich ELISA assay for quantative measurement of SP-40, 40 in seminal plasma and serum. J Immunol Methods, 1990,31:159_163
收稿1999-09-18, http://www.100md.com
单位：
商秀丽(第一临床学院神经内科)；商秀丽(第一临床学院内分泌科)；崇巍(中国医科大学第一临床学院急诊科，沈阳 110001)；商秀丽(中国医科大学第一临床学院急诊科，沈阳 110001)；张锦(中国医科大学第一临床学院急诊科，沈阳 110001)
关键词：载脂蛋白J；酶联免疫吸附法
中国医科大学学报000135 Desilva等[1]于1996年运用免疫吸附层析结合反向高效液相层析技术从人血清中分离提纯出一种新的载脂蛋白，命名为apoJ。结构分析揭示apoJ和sp40，40、CLI、PADHC、NAI/A2、PTB16及K611等为同一蛋白。apoJ在人体不同组织广泛存在，提示其基本而重要的生理功能。已知apoJ参与多种生理过程，如脂质的转运，补体功能的调节，精子的成熟、组织的再生及生物活性肽的转运等。apoJ在许多病理过程中有所表达，如肾小球肾炎、囊性肾病、肾小管损伤、动脉粥样硬化、心肌梗死、神经退行性疾病等。为对apoJ进行深入广泛的研究，亟待建立一种体液apoJ水平快速、高效、经济实用的检测方法。
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本文旨在探索建立一种酶联免疫吸附法(ELISA)来测定血清apoJ水平。
1 材料与方法
材料：30例正常人空腹静脉血分离血清。人apoJ纯冻干品，人apoJ单克隆抗体(Quidel公司)。HRP标记的山羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。四甲联苯胺(TMB)反应液A，显色液B及终止液C(上海科华生物技术有限公司)。缓冲液：pH 7.4，7.6 mmol/L的PBS，稀释液：含0.2% Tween 20的上述缓冲液，洗涤液：含0.1% Tween 20的上述缓冲液(自配)。
方法：
(1) 用pH 7.2、10 mmol/L的PBS恢复apoJ冻干品，将其稀释为1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800 6个标准浓度，用于绘制标准曲线。
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(2) 按1/4 000稀释待测人血清。
(3) 将(1)中的标准液和(2)中的待测血清稀释液加于酶标板上，用稀释液作空白对照，100 μl/孔。
(4) 4℃下包被48 h，甩干，洗板3次，每次3 min。
(5) 加入1/1 000稀释的apoJ单克隆抗体，100 μl/孔。
(6) 37℃下孵育1 h，甩干并洗板3次，3 min/次。
(7) 加入1/400稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG,100 μl/孔。
(8) 37℃下孵育1 h，甩干洗板3次，3 min/次。
(9) 加入TMB反应液及显色液。37℃下孵育5 min，加入终止液。
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(10) 上酶标仪于450 nm处读取吸光度。
(11) 利用apoJ标准稀释液的吸光度绘制标准曲线。
(12) 据待测血清的吸光度在标准曲线上计算出相应的apoJ浓度。
2 结果与讨论
Hogasen等发现，apoJ对聚苯乙稀板，尤其是Nunc板有极强的结合能力。这种结合力属于疏水作用，在Tween 20存在时得以加强，而且不被阻断或其它去污剂清除。这一特性只为少数血清蛋白所有[2]。
本研究采用单抗体ELISA测定血清apoJ水平，血清标本的稀释度达1/400，结果为(99±36) mg/L。Murphy和Choi等应用双抗夹心ELISA测定血清apoJ水平，血清标本稀释度为1/10，中位数分别为62 mg/L和123 mg/L[3，4]。因为apoJ对聚苯乙烯酶的非特异吸附作用，双抗夹心ELISA中的一抗实际上几乎没起作用，因此本研究采用单抗体ELISA。
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本方法将标本的包被时间由24 h延长为48 h，从而提高了血清apoJ对酶标板的吸附效率。用TMB取代ABTS显色，显色效果明显改善，而且更加敏感。同时降低了检测成本。和既往其它方法相比，本研究建立的单抗体ELISA，使用材料少，标准品及单克隆抗体稀释度大，检测成本降低，为一种高效、快速、经济实用的血清apoJ测定方法。
辽宁省自然科学基金资助项目，962294
参考文献
1，Desilva HV, Stuart WD, Duvic CR, et al. A70-Kda apolipoprotein designated APOJ is a marker for subclasses of human plasma high density lipoproteins. J Biol Chem, 1990,265:13240_13247
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2，，Hogasen K, Mollnes TE, Tschopp J, et al. Quantitation of vitronectin and clusterin: pitfalls and solutions in enzyme imunoassays for adensive proteins. J Immunol Methods, 1993,160:107_115
3，，Murphy BF, Kirszbaum L, Walker ID, et al. SP-40, 40 a newly identified normal human serum protein found in the SC56-9 complex of complement and in the immune deposits of glomerulonephritis. J Clin Invest, 1988,81:1858_1864
4，，Choi NH, Tobe T, Hara K, et al. Sandwich ELISA assay for quantative measurement of SP-40, 40 in seminal plasma and serum. J Immunol Methods, 1990,31:159_163
收稿1999-09-18, http://www.100md.com