重组葡激酶的人体药代动力学研究
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南京医科大学学报 2000年第2期第20卷 论著
作者：童明庆 戴传箴 蒋理 赵旺胜
单位：南京医科大学第一附属医院检验中心，南京 210029
关键词：葡激酶；药代动力学；酶联免疫吸附试验
南京医科大学学报000204
摘 要 目的 研究重组葡激酶(r-SAK)静脉给药后在健康人体内的药代动力学。方法 9例健康成人每人给药10 mg(先静脉推注1 mg，2 min内推完，余下9 mg 30 min内推完)，采血时间为开始给药后的1、10、20、30、35、40、50、60、70、90、120、210和270 min。以双夹心酶联免疫吸附法检测血药浓度。结果 中心室分布容积为(4.45±1.62) L，药-时曲线下面积(AUC0～270)为(89 935±13 228) min.ng/ml，药物总清除率为(6.30±1.05) L/h，T1/2α(分布相半衰期)为(13.30±2.06) min，T1/2β(消除相半衰期)为(67.94±21.39) min。结论 r-SAK在健康人体内的药代动力学类型符合二室模型。建议临床给药方式为10 mg r-SAK 30 min内静脉输注，必要时在第1次给药结束后30～60 min可再给10 mg。
, 百拇医药
中图号 R969.1；Q555+.7
A Study on Pharmacokinetics of Recombinant Staphylokinase (r-SAK) in Healthy Subjects
Tong Mingqing Dai Chuanzhen Jiang Li
(Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To study the pharmacokinetics of r-SAK by intravenous administration in healthy chinese subjects.Methods 10 mg of r-SAK were separately given to 9 subjects (first 1 mg in 2 min, then 9 mg in 30 min).The times of taking blood were 1、10、20、30、35、40、50、60、70、90、120 and 270 min after intravenous administration. The plasma concentration of r-SAK were detected by sandwich ELISA.Results The pharmacokinetics parameters Vc， AUC0～270 CL. T1/2α and T1/2β were (4.45±1.62) L， (89 939±13 228) min.ng/ml， (6.30±1.05) L/h， (13.30±2.06) min and (67.94±21.39) min respectively.Conclusion The pharmacokinetics of r-SAK was adapted to two-compartent model and intravenous administration of 10 mg r-SAK in 30 minuts is suggested, if necessary, after 30 to 60 minutes once again will be available.
, 百拇医药
Key words staphylokinase; pharmacokinetics; ELISA
葡激酶(staphylokinase,SAK)[1，2]是由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质。它类似于尿激酶和链激酶，具有溶血栓的作用。SAK对纤维蛋白呈高度特异性，可激活血栓表面上的纤溶酶原为纤溶酶，从而发挥溶栓作用，但对循环中的纤维蛋白原却无降解作用；另外，SAK对富含血小板血栓的溶栓作用特强。这些特点和优点，使SAK在临床上有着广阔的应用前景。成都金鹏生物技术有限公司生产的冻干注射用重组葡激酶(r-SAK)是SAK的基因工程产品。经耐受性试验证实，健康成人单次15 mg静脉给药未见明显不良反应。为了测定r-SAK静脉给药后在健康人体内的药代动力学参数，推导其动力学模型，为临床用药的方法提供依据，我们进行了r-SAK的人体药代动力学研究。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料
1.1.1 受试药
r-SAK冻干粉针剂，每支含r-SAK 1.3 mg(每毫克相当于6.2×104活性单位)和人血白蛋白15 mg(保护剂)。由成都金鹏生物制品有限公司提供，批号980601。本品经卫生部北京药品生物制品检定所检定，检定文号SJLS980894。
1.1.2 受试对象
选择健康成人9名，经一般体格检查合格后，作血、尿常规，乙肝标志物，血液生化，出凝血机制，心电图，二维超声心动图及胸透检查，均属正常。受试者3个月内未用过对脏器有损害的药物，2周内未服用过任何药物，不嗜烟酒。
1.2 方法
1.2.1 血浆中r-SAK含量测定方法的建立
, 百拇医药
本研究采用现代免疫化学技术，建立了双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，以对r-SAK进行特异性检测。
抗r-SAK兔血清的制备 取r-SAK纯品(2 mg/ml，不含人血清白蛋白，金鹏生物技术有限公司提供)与福氏完全佐剂(Sigma产品，批号37H8910)等量混合，以两个互相连接的注射器来回吹打，使其充分混匀成均匀油包水乳剂。采用多点肌肉注射的方法免疫家兔，每兔每次给予1 mg抗原r-SAK。10天和1个月后加强免疫1次，并静脉采血测定效价。双扩散效价达1∶16以上时心脏放血分离血清。
抗r-SAK血清的效价测定及特异性分析 在凝固的1.5%的琼脂板(约1.5～2.0 mm厚)上打孔(图1)，孔径3 mm，孔距4～5 mm。测定抗血清效价时，中央孔加1 μg r-SAK，周围各孔分别加不同稀释度的兔抗r-SAK血清10 μl，37℃湿盒中扩散24 h，以出现沉淀线的最高稀释度为该抗血清的效价。进行特异性分析时，中央孔加原倍的抗血清10 μl，周围各孔加r-SAK、人血浆、小牛血清等，沉淀线只出现在中央孔与r-SAK孔之间为合格。
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图1 抗r-SAK血清的效价测定及特异性分析
抗r-SAK抗体IgG的纯化 取Protein G柱1支(Pharmacia产品，批号：243395)，以0.05 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液平衡，将2 ml抗血清加于柱上，待血清流入柱中后关闭流出口，使血清在柱中作用10 min，打开流出口，以平衡缓冲液流洗，至蛋白流尽后再洗20 min(流速约1 ml/min)。以盐酸-甘氨酸缓冲液(0.05 mol/L,pH2.8)洗脱IgG，并立即以0.1mol/L NaOH中和至中性。于280 nm处比色，根据公式：IgG浓度(g/L)=0.62 A1 cm280 nm，计算IgG的浓度。
抗r-SAK IgG的辣根过氧化物酶标记 采用改良过碘酸钠法，参照文献[3]进行。
检测程序的设计[3，4] 将一定量抗r-SAK IgG溶于pH9.6、0.01 mol/L碳酸盐缓冲液中，加入到酶标反应板(Nunc-Immuno Module，批号038891，丹麦产品)各孔中，每孔100 μl，4℃包被过夜。翌日以酶标洗涤液(0.02 mol/L，pH7.4，Tris-HCl-Tween 20缓冲液)常规洗板3次。加入适当稀释的标准品或被测血浆，每孔100 μl，混匀，37℃ 2 h，取出洗板3次。加适当稀释的酶标抗体，每孔100 μl，混匀，37℃2 h，取出洗板3次。各孔加底物溶液(8 mg邻苯二胺加入10 ml pH5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，再加3% H2O20.05 ml，临用时配制)100 μl，37℃ 30 min，每孔加2 mol/L H2SO4一滴中止反应，于492 nm比色(CliniBio 128C, Ansfra生产)。根据检测孔的吸光度查标准曲线即得相应的r-SAK含量。
, 百拇医药
检测最佳条件的选择 采用棋盘滴定法选择包被抗体和酶标抗体的浓度，试验结果显示包被抗体的浓度以20 μg/ml为好，酶标抗体以1∶50稀释为好。
标准曲线的制备 将r-SAK标准品(20 μg/支，相当于1 000活性单位，批号：97卫生参字01号)复溶后，以正常人枸橼酸钠抗凝血浆稀释成50、100、200、400、800、1 200、1 600和2 000 ng/ml不同浓度，与被检血浆标本同时，同样以酶标稀释液(含15%小牛血清的酶标洗涤液)1∶20稀释，加入到已包被的酶标板孔中，按上述程序操作，每一稀释度均做复孔，取吸光度均值(Y)对浓度(X)作回归曲线。当待测标本中r-SAK浓度低于50 ng/ml时，另作一标准曲线，标准品浓度取10、20、30、40、50 ng/ml，与血浆标本同时以1∶4稀释后按上述程序操作，并绘制曲线。
1.2.2 药代动力学试验
给药前的准备 受试者早餐后1 h卧床静脉穿刺开通输液通道，缓慢滴注生理盐水，滴速约30 ml/h，以10 μg/0.1ml r-SAK于受试者前臂行皮内注射，15 min后看结果，皮试阴性者开始给药。
, 百拇医药
给药方法 参照文献[5]，每人10 mg r-SAK的给药方法为：先静脉推注1 mg r-SAK(以1 ml 生理盐水为溶剂)，在2 min内推完；然后将剩余的9 mg r-SAK溶于50 ml 生理盐水中，用微电脑输液泵缓慢输入静脉，在30 min内推完。
血样采集方法 给药前采血1次，在开始给药后的1、10、20 min以及给药结束后的0、5、10、20、30、40、60、90、120、180和240 min各采血1次，以枸橼酸钠抗凝，分离血浆并存于-70℃冰箱中备用。
血浆中r-SAK浓度检测 同标准曲线的制备。
1.3 数据的处理
根据给药后不同时间血药浓度的测定数据，以AIC值作为模型识别指标，用PKBP-N1程序软件拟合药-时曲线，根据曲线特点，推导其动力学类型并计算各项药代动力学参数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 所制抗r-SAK的效价及特异性
所制抗r-SAK效价达1∶16，并仅与r-SAK之间有沉淀线，与人血浆、小牛血清等之间无交叉反应(图1)。
2.2 所制标准曲线的线性
高低浓度两条曲线的回归方程分别为Y=0.000 797 5X-0.039 25和lg Y=0.013 66X-0.451，相关系数(r)分别为0.999 4和0.996 4。
2.3 所建方法的精密度与回收率
用高浓度标准曲线对2 000、400和50 ng/ml的标准品进行了批内和批间变异及回收率的检测。用低浓度曲线对50和10 ng/ml的标准品进行批内变异和回收率的检测。结果见表1。
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表1 所建方法的精密度与回收率 采用的标
准曲线
加入的标准品
浓度(ng/ml)
变异系数(%)
回收率(%)
批内(n)
批间(n)
高浓度曲线
2 000
5.26(5)
7.94(3)
, 百拇医药
97.2±6.3
400
3.35(5)
6.09(3)
99.3±4.0
50
8.89(5)
16.80(3)
114.8±14.6
低浓度曲线
50
1.16(5)
, 百拇医药
-
100.5±1.17
10
6.67(5)
-
136.6±9.1
2.4 受试者的基本情况及用药量
见表2。表2 志愿受试者的基本情况、用药顺序和用药量 编号
(用药顺序)
性别
年龄
(岁)
, 百拇医药
体质量
(kg)
用药剂量
总量(mg)
mg/kg
1
男
20
63.5
10
0.157
2
男
, 百拇医药
24
62
10
0.161
3
男
25
66
10
0.152
4
女
42
67
, 百拇医药
10
0.149
5
男
21
59
10
0.169
6
男
22
73
10
0.137
, http://www.100md.com
7
男
27
60
10
0.167
8
男
20
59
10
0.169
9
男
, http://www.100md.com
21
55
10
0.182
x
24.7
62.7
10
0.160
s
6.9
5.4
0
, http://www.100md.com 0.013
2.5 受试者r-SAK的血药浓度
9例受试者注射r-SAK后各时间点的血药浓度见表3。将各时间点的血药浓度均值绘制药-时曲线及其半对数曲线(图2)。表3 静脉输注(10 mg/30 min)后经时过程的血药浓度 (ng/ml) 时间(min)
1
2
3
4
5
6
7
8
, 百拇医药
9
x
s
输注过程
1
74
76
59
110
6
26
100
204
77
, http://www.100md.com
59
10
588
490
766
779
714
544
903
1017
1178
775
227
, 百拇医药
20
1146
870
1198
919
1111
1215
1535
1376
1565
1215
243
输注停止后
, http://www.100md.com
0
1456
1351
1486
1506
1669
1427
1754
1589
1773
1557
148
5
, 百拇医药
1123
975
1148
1219
979
1300
1641
1527
1603
1279
256
10
1061
, http://www.100md.com
852
911
1027
743
1206
1074
1206
1331
1046
188
20
900
638
, 百拇医药
597
620
690
771
714
903
960
755
136
30
594
412
428
, 百拇医药
473
658
556
544
639
714
558
105
40
455
375
258
341
, 百拇医药
584
383
469
465
480
423
95
60
401
195
175
218
340
, http://www.100md.com
151
241
208
233
240
80
90
360
180
137
176
198
65
, http://www.100md.com 194
137
142
177
80
120
292
145
127
166
132
40
123
, 百拇医药 71
76
130
73
180
222
130
68
144
39
33
98
27
52
, http://www.100md.com
90
65
240
147
118
60
110
35
26
71
22
30
69
46
, 百拇医药
图2 9例受试者的平均药-时曲线
2.6 受试者输注r-SAK后的药代动力学参数
见表4。表4 药代动力学参数
α
(min-1)
β
(min-1)
T1/2α
(min)
T1/2β
(min)
, 百拇医药
K21
(min-1)
K12
(min-1)
K10
(min-1)
VC
(L)
CL
(L/h)
AUC0～270
, 百拇医药 (min.ng/ml)
AUC0～∞
(min.ng/ml)
1
0.056
0.0061
12.33
114.13
0.019
0.025
0.018
4.14
, 百拇医药
4.30
115369
139467
2
0.048
0.0087
14.51
80.00
0.016
0.014
0.026
4.93
6.45
, 百拇医药
79398
92961
3
0.056
0.0110
12.45
63.50
0.016
0.012
0.039
3.59
7.24
77470
, 百拇医药
82924
4
0.054
0.0087
12.88
79.53
0.016
0.017
0.029
3.92
5.94
88418
101062
, 百拇医药
5
0.060
0.0120
11.52
55.37
0.026
0.018
0.029
3.93
6.68
86918
89835
6
, 百拇医药
0.038
0.0150
18.03
45.75
0.022
0.005
0.027
7.89
8.03
72996
74729
7
0.050
, 百拇医药
0.0100
13.92
69.59
0.024
0.015
0.021
5.97
5.68
98529
105629
8
0.054
0.0150
, 百拇医药
12.94
46.74
0.021
0.010
0.037
3.02
6.58
89699
91166
9
0.062
0.0120
11.13
, 百拇医药
56.82
0.022
0.018
0.034
2.69
5.82
100621
103121
x
0.053
0.0109
13.30
67.94
, 百拇医药
0.020
0.015
0.029
4.45
6.30
89935
97877
s
0.007
0.0029
2.06
21.39
0.004
, http://www.100md.com
0.006
0.007
1.62
1.05
13228
18442
AUC(药-时曲线下面积)值为梯形面积法算得；VC：中心室分布容积；CL：药物总清除率；T1/α：分布相半衰期；T1/β：消除相半衰期。
3 讨论
r-SAK是一种纤溶酶原激活剂[1，2]，其生物活性系通过激活纤溶酶原为纤溶酶，然后由后者水解血栓中的纤维蛋白来实现的。由于人体内存在内源性纤溶酶原激活剂，如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)干扰，故不能简单地用检测生物活性的方法来测定r-SAK。本研究建立并采用双抗体夹心ELISA法来检测r-SAK，借助于特异性抗体的制备以保证方法的特异性，借助于酶的放大作用以保证方法的敏感性，实为生物大分子药代动力学研究的一个理想方法。
, 百拇医药
r-SAK ELISA检测方法的关键是抗r-SAK抗血清的制备。r-SAK是一个小分子蛋白，相对分子质量约1.5万，抗原性较弱，常规免疫多不能获得高效价的抗体。我们从荷兰购进的抗血清其双扩效价也仅1∶2左右，达不到建立ELISA方法的要求。为此，我们摸索了多种免疫方法，发现以福氏完全佐剂制成的油包水抗原多点肌肉注射法最好，其所获抗血清效价高于多点皮内和淋巴结注射等法。
为了防止受试者对r-SAK发生过敏反应，保证实验的安全，我们摸索了r-SAK的皮试方法，确定皮试剂量为10 μg/0.1 ml为好。在受试者筛选过程中，我们确实发现3例皮试阳性者，经询问病史，皆为过敏体质。
由表3和图2可见，按本研究方法给药，在静脉输注10 mg r-SAK结束时(30 min点)的血药浓度最高，其Cmax在1 351～1 773 ng/ml，平均(1 557±148)ng/ml。根据AIC拟合度指标进行模型识别，静脉缓慢输注r-SAK的药代动力学类型以二室模型解释为宜。其主要药代动力学参数中心室分布容积(Vc)为(4.45±1.62)L，AUC0～270为(89 935±13 228) min.ng/ml，CL为(6.30±1.05) L/h，T1/2α为(13.30±2.06) min，T1/2β为(67.94±21.39)min。
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Collen等[5]曾用10 mg r-SAK静脉输注30 min的方法治疗5例急性心梗的患者，并测定了药代动力学参数，在输注结束时血药浓度在900～1 700 ng/ml，其T1/2α为(6.3±0.6)min，T1/2β为(37±15)min。其峰浓度与我们的结果相近，但变异较大，其T1/2α和T1/2β较我们的结果略小，可能与患者消耗r-SAK较快，亦可能与人种的差异有关。
本研究过程中，有3例受试者在开始给药后15～30 min出现牙龈渗血，立即查出血时间、激活部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间，均未见明显改变，至给药30～60 min后，渗血自动停止。经追问病史，3例受试者有牙龈炎，早晨刷牙偶有出血，实验中渗血的发生与r-SAK溶解牙龈部的血栓有关，是r-SAK溶栓作用的药理表现。根据上述渗血发生和停止的时间，结合药代动力学研究结果，r-SAK的溶栓起效浓度约在500 ng/ml左右，建议临床给药方式为10 mg 30 min内静脉输注，必要时，在第1次给药结束后的30～60 min，可再给药1次。
, 百拇医药
致谢：本研究工作蒙成都金鹏生物技术有限公司佟彬经理和上海植物生理研究所王家驯教授的大力支持，特致由衷谢意。
国家1035工程“九五”科技攻关基金资助项目(No96-901-01-44)
参考文献
1，翟中金综述.葡激酶的研究进展.国外医学.临床生化与检验分册，1998，19(4)：156
2，Collen D.Staphylokinase: a potent uniquely fibrin-selective thrombolytic agent. Nature Medicine,1998,4(3):279
3，武建国.实用临床免疫学检验.第1版.南京：江苏科技出版社，1990.88
4，童明庆，孙南雄译.实用免疫化学.第1版.南京：南京出版社，1990.37～354
5，Collen D, Van DE, Werf E. Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation,1993,87(6):1850
(2000-01-17收稿), http://www.100md.com
单位：南京医科大学第一附属医院检验中心，南京 210029
关键词：葡激酶；药代动力学；酶联免疫吸附试验
南京医科大学学报000204
摘 要 目的 研究重组葡激酶(r-SAK)静脉给药后在健康人体内的药代动力学。方法 9例健康成人每人给药10 mg(先静脉推注1 mg，2 min内推完，余下9 mg 30 min内推完)，采血时间为开始给药后的1、10、20、30、35、40、50、60、70、90、120、210和270 min。以双夹心酶联免疫吸附法检测血药浓度。结果 中心室分布容积为(4.45±1.62) L，药-时曲线下面积(AUC0～270)为(89 935±13 228) min.ng/ml，药物总清除率为(6.30±1.05) L/h，T1/2α(分布相半衰期)为(13.30±2.06) min，T1/2β(消除相半衰期)为(67.94±21.39) min。结论 r-SAK在健康人体内的药代动力学类型符合二室模型。建议临床给药方式为10 mg r-SAK 30 min内静脉输注，必要时在第1次给药结束后30～60 min可再给10 mg。
, 百拇医药
中图号 R969.1；Q555+.7
A Study on Pharmacokinetics of Recombinant Staphylokinase (r-SAK) in Healthy Subjects
Tong Mingqing Dai Chuanzhen Jiang Li
(Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To study the pharmacokinetics of r-SAK by intravenous administration in healthy chinese subjects.Methods 10 mg of r-SAK were separately given to 9 subjects (first 1 mg in 2 min, then 9 mg in 30 min).The times of taking blood were 1、10、20、30、35、40、50、60、70、90、120 and 270 min after intravenous administration. The plasma concentration of r-SAK were detected by sandwich ELISA.Results The pharmacokinetics parameters Vc， AUC0～270 CL. T1/2α and T1/2β were (4.45±1.62) L， (89 939±13 228) min.ng/ml， (6.30±1.05) L/h， (13.30±2.06) min and (67.94±21.39) min respectively.Conclusion The pharmacokinetics of r-SAK was adapted to two-compartent model and intravenous administration of 10 mg r-SAK in 30 minuts is suggested, if necessary, after 30 to 60 minutes once again will be available.
, 百拇医药
Key words staphylokinase; pharmacokinetics; ELISA
葡激酶(staphylokinase,SAK)[1，2]是由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质。它类似于尿激酶和链激酶，具有溶血栓的作用。SAK对纤维蛋白呈高度特异性，可激活血栓表面上的纤溶酶原为纤溶酶，从而发挥溶栓作用，但对循环中的纤维蛋白原却无降解作用；另外，SAK对富含血小板血栓的溶栓作用特强。这些特点和优点，使SAK在临床上有着广阔的应用前景。成都金鹏生物技术有限公司生产的冻干注射用重组葡激酶(r-SAK)是SAK的基因工程产品。经耐受性试验证实，健康成人单次15 mg静脉给药未见明显不良反应。为了测定r-SAK静脉给药后在健康人体内的药代动力学参数，推导其动力学模型，为临床用药的方法提供依据，我们进行了r-SAK的人体药代动力学研究。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料
1.1.1 受试药
r-SAK冻干粉针剂，每支含r-SAK 1.3 mg(每毫克相当于6.2×104活性单位)和人血白蛋白15 mg(保护剂)。由成都金鹏生物制品有限公司提供，批号980601。本品经卫生部北京药品生物制品检定所检定，检定文号SJLS980894。
1.1.2 受试对象
选择健康成人9名，经一般体格检查合格后，作血、尿常规，乙肝标志物，血液生化，出凝血机制，心电图，二维超声心动图及胸透检查，均属正常。受试者3个月内未用过对脏器有损害的药物，2周内未服用过任何药物，不嗜烟酒。
1.2 方法
1.2.1 血浆中r-SAK含量测定方法的建立
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本研究采用现代免疫化学技术，建立了双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，以对r-SAK进行特异性检测。
抗r-SAK兔血清的制备 取r-SAK纯品(2 mg/ml，不含人血清白蛋白，金鹏生物技术有限公司提供)与福氏完全佐剂(Sigma产品，批号37H8910)等量混合，以两个互相连接的注射器来回吹打，使其充分混匀成均匀油包水乳剂。采用多点肌肉注射的方法免疫家兔，每兔每次给予1 mg抗原r-SAK。10天和1个月后加强免疫1次，并静脉采血测定效价。双扩散效价达1∶16以上时心脏放血分离血清。
抗r-SAK血清的效价测定及特异性分析 在凝固的1.5%的琼脂板(约1.5～2.0 mm厚)上打孔(图1)，孔径3 mm，孔距4～5 mm。测定抗血清效价时，中央孔加1 μg r-SAK，周围各孔分别加不同稀释度的兔抗r-SAK血清10 μl，37℃湿盒中扩散24 h，以出现沉淀线的最高稀释度为该抗血清的效价。进行特异性分析时，中央孔加原倍的抗血清10 μl，周围各孔加r-SAK、人血浆、小牛血清等，沉淀线只出现在中央孔与r-SAK孔之间为合格。
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图1 抗r-SAK血清的效价测定及特异性分析
抗r-SAK抗体IgG的纯化 取Protein G柱1支(Pharmacia产品，批号：243395)，以0.05 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液平衡，将2 ml抗血清加于柱上，待血清流入柱中后关闭流出口，使血清在柱中作用10 min，打开流出口，以平衡缓冲液流洗，至蛋白流尽后再洗20 min(流速约1 ml/min)。以盐酸-甘氨酸缓冲液(0.05 mol/L,pH2.8)洗脱IgG，并立即以0.1mol/L NaOH中和至中性。于280 nm处比色，根据公式：IgG浓度(g/L)=0.62 A1 cm280 nm，计算IgG的浓度。
抗r-SAK IgG的辣根过氧化物酶标记 采用改良过碘酸钠法，参照文献[3]进行。
检测程序的设计[3，4] 将一定量抗r-SAK IgG溶于pH9.6、0.01 mol/L碳酸盐缓冲液中，加入到酶标反应板(Nunc-Immuno Module，批号038891，丹麦产品)各孔中，每孔100 μl，4℃包被过夜。翌日以酶标洗涤液(0.02 mol/L，pH7.4，Tris-HCl-Tween 20缓冲液)常规洗板3次。加入适当稀释的标准品或被测血浆，每孔100 μl，混匀，37℃ 2 h，取出洗板3次。加适当稀释的酶标抗体，每孔100 μl，混匀，37℃2 h，取出洗板3次。各孔加底物溶液(8 mg邻苯二胺加入10 ml pH5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，再加3% H2O20.05 ml，临用时配制)100 μl，37℃ 30 min，每孔加2 mol/L H2SO4一滴中止反应，于492 nm比色(CliniBio 128C, Ansfra生产)。根据检测孔的吸光度查标准曲线即得相应的r-SAK含量。
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检测最佳条件的选择 采用棋盘滴定法选择包被抗体和酶标抗体的浓度，试验结果显示包被抗体的浓度以20 μg/ml为好，酶标抗体以1∶50稀释为好。
标准曲线的制备 将r-SAK标准品(20 μg/支，相当于1 000活性单位，批号：97卫生参字01号)复溶后，以正常人枸橼酸钠抗凝血浆稀释成50、100、200、400、800、1 200、1 600和2 000 ng/ml不同浓度，与被检血浆标本同时，同样以酶标稀释液(含15%小牛血清的酶标洗涤液)1∶20稀释，加入到已包被的酶标板孔中，按上述程序操作，每一稀释度均做复孔，取吸光度均值(Y)对浓度(X)作回归曲线。当待测标本中r-SAK浓度低于50 ng/ml时，另作一标准曲线，标准品浓度取10、20、30、40、50 ng/ml，与血浆标本同时以1∶4稀释后按上述程序操作，并绘制曲线。
1.2.2 药代动力学试验
给药前的准备 受试者早餐后1 h卧床静脉穿刺开通输液通道，缓慢滴注生理盐水，滴速约30 ml/h，以10 μg/0.1ml r-SAK于受试者前臂行皮内注射，15 min后看结果，皮试阴性者开始给药。
, 百拇医药
给药方法 参照文献[5]，每人10 mg r-SAK的给药方法为：先静脉推注1 mg r-SAK(以1 ml 生理盐水为溶剂)，在2 min内推完；然后将剩余的9 mg r-SAK溶于50 ml 生理盐水中，用微电脑输液泵缓慢输入静脉，在30 min内推完。
血样采集方法 给药前采血1次，在开始给药后的1、10、20 min以及给药结束后的0、5、10、20、30、40、60、90、120、180和240 min各采血1次，以枸橼酸钠抗凝，分离血浆并存于-70℃冰箱中备用。
血浆中r-SAK浓度检测 同标准曲线的制备。
1.3 数据的处理
根据给药后不同时间血药浓度的测定数据，以AIC值作为模型识别指标，用PKBP-N1程序软件拟合药-时曲线，根据曲线特点，推导其动力学类型并计算各项药代动力学参数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 所制抗r-SAK的效价及特异性
所制抗r-SAK效价达1∶16，并仅与r-SAK之间有沉淀线，与人血浆、小牛血清等之间无交叉反应(图1)。
2.2 所制标准曲线的线性
高低浓度两条曲线的回归方程分别为Y=0.000 797 5X-0.039 25和lg Y=0.013 66X-0.451，相关系数(r)分别为0.999 4和0.996 4。
2.3 所建方法的精密度与回收率
用高浓度标准曲线对2 000、400和50 ng/ml的标准品进行了批内和批间变异及回收率的检测。用低浓度曲线对50和10 ng/ml的标准品进行批内变异和回收率的检测。结果见表1。
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表1 所建方法的精密度与回收率 采用的标
准曲线
加入的标准品
浓度(ng/ml)
变异系数(%)
回收率(%)
批内(n)
批间(n)
高浓度曲线
2 000
5.26(5)
7.94(3)
, 百拇医药
97.2±6.3
400
3.35(5)
6.09(3)
99.3±4.0
50
8.89(5)
16.80(3)
114.8±14.6
低浓度曲线
50
1.16(5)
, 百拇医药
-
100.5±1.17
10
6.67(5)
-
136.6±9.1
2.4 受试者的基本情况及用药量
见表2。表2 志愿受试者的基本情况、用药顺序和用药量 编号
(用药顺序)
性别
年龄
(岁)
, 百拇医药
体质量
(kg)
用药剂量
总量(mg)
mg/kg
1
男
20
63.5
10
0.157
2
男
, 百拇医药
24
62
10
0.161
3
男
25
66
10
0.152
4
女
42
67
, 百拇医药
10
0.149
5
男
21
59
10
0.169
6
男
22
73
10
0.137
, http://www.100md.com
7
男
27
60
10
0.167
8
男
20
59
10
0.169
9
男
, http://www.100md.com
21
55
10
0.182
x
24.7
62.7
10
0.160
s
6.9
5.4
0
, http://www.100md.com 0.013
2.5 受试者r-SAK的血药浓度
9例受试者注射r-SAK后各时间点的血药浓度见表3。将各时间点的血药浓度均值绘制药-时曲线及其半对数曲线(图2)。表3 静脉输注(10 mg/30 min)后经时过程的血药浓度 (ng/ml) 时间(min)
1
2
3
4
5
6
7
8
, 百拇医药
9
x
s
输注过程
1
74
76
59
110
6
26
100
204
77
, http://www.100md.com
59
10
588
490
766
779
714
544
903
1017
1178
775
227
, 百拇医药
20
1146
870
1198
919
1111
1215
1535
1376
1565
1215
243
输注停止后
, http://www.100md.com
0
1456
1351
1486
1506
1669
1427
1754
1589
1773
1557
148
5
, 百拇医药
1123
975
1148
1219
979
1300
1641
1527
1603
1279
256
10
1061
, http://www.100md.com
852
911
1027
743
1206
1074
1206
1331
1046
188
20
900
638
, 百拇医药
597
620
690
771
714
903
960
755
136
30
594
412
428
, 百拇医药
473
658
556
544
639
714
558
105
40
455
375
258
341
, 百拇医药
584
383
469
465
480
423
95
60
401
195
175
218
340
, http://www.100md.com
151
241
208
233
240
80
90
360
180
137
176
198
65
, http://www.100md.com 194
137
142
177
80
120
292
145
127
166
132
40
123
, 百拇医药 71
76
130
73
180
222
130
68
144
39
33
98
27
52
, http://www.100md.com
90
65
240
147
118
60
110
35
26
71
22
30
69
46
, 百拇医药
图2 9例受试者的平均药-时曲线
2.6 受试者输注r-SAK后的药代动力学参数
见表4。表4 药代动力学参数
α
(min-1)
β
(min-1)
T1/2α
(min)
T1/2β
(min)
, 百拇医药
K21
(min-1)
K12
(min-1)
K10
(min-1)
VC
(L)
CL
(L/h)
AUC0～270
, 百拇医药 (min.ng/ml)
AUC0～∞
(min.ng/ml)
1
0.056
0.0061
12.33
114.13
0.019
0.025
0.018
4.14
, 百拇医药
4.30
115369
139467
2
0.048
0.0087
14.51
80.00
0.016
0.014
0.026
4.93
6.45
, 百拇医药
79398
92961
3
0.056
0.0110
12.45
63.50
0.016
0.012
0.039
3.59
7.24
77470
, 百拇医药
82924
4
0.054
0.0087
12.88
79.53
0.016
0.017
0.029
3.92
5.94
88418
101062
, 百拇医药
5
0.060
0.0120
11.52
55.37
0.026
0.018
0.029
3.93
6.68
86918
89835
6
, 百拇医药
0.038
0.0150
18.03
45.75
0.022
0.005
0.027
7.89
8.03
72996
74729
7
0.050
, 百拇医药
0.0100
13.92
69.59
0.024
0.015
0.021
5.97
5.68
98529
105629
8
0.054
0.0150
, 百拇医药
12.94
46.74
0.021
0.010
0.037
3.02
6.58
89699
91166
9
0.062
0.0120
11.13
, 百拇医药
56.82
0.022
0.018
0.034
2.69
5.82
100621
103121
x
0.053
0.0109
13.30
67.94
, 百拇医药
0.020
0.015
0.029
4.45
6.30
89935
97877
s
0.007
0.0029
2.06
21.39
0.004
, http://www.100md.com
0.006
0.007
1.62
1.05
13228
18442
AUC(药-时曲线下面积)值为梯形面积法算得；VC：中心室分布容积；CL：药物总清除率；T1/α：分布相半衰期；T1/β：消除相半衰期。
3 讨论
r-SAK是一种纤溶酶原激活剂[1，2]，其生物活性系通过激活纤溶酶原为纤溶酶，然后由后者水解血栓中的纤维蛋白来实现的。由于人体内存在内源性纤溶酶原激活剂，如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)干扰，故不能简单地用检测生物活性的方法来测定r-SAK。本研究建立并采用双抗体夹心ELISA法来检测r-SAK，借助于特异性抗体的制备以保证方法的特异性，借助于酶的放大作用以保证方法的敏感性，实为生物大分子药代动力学研究的一个理想方法。
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r-SAK ELISA检测方法的关键是抗r-SAK抗血清的制备。r-SAK是一个小分子蛋白，相对分子质量约1.5万，抗原性较弱，常规免疫多不能获得高效价的抗体。我们从荷兰购进的抗血清其双扩效价也仅1∶2左右，达不到建立ELISA方法的要求。为此，我们摸索了多种免疫方法，发现以福氏完全佐剂制成的油包水抗原多点肌肉注射法最好，其所获抗血清效价高于多点皮内和淋巴结注射等法。
为了防止受试者对r-SAK发生过敏反应，保证实验的安全，我们摸索了r-SAK的皮试方法，确定皮试剂量为10 μg/0.1 ml为好。在受试者筛选过程中，我们确实发现3例皮试阳性者，经询问病史，皆为过敏体质。
由表3和图2可见，按本研究方法给药，在静脉输注10 mg r-SAK结束时(30 min点)的血药浓度最高，其Cmax在1 351～1 773 ng/ml，平均(1 557±148)ng/ml。根据AIC拟合度指标进行模型识别，静脉缓慢输注r-SAK的药代动力学类型以二室模型解释为宜。其主要药代动力学参数中心室分布容积(Vc)为(4.45±1.62)L，AUC0～270为(89 935±13 228) min.ng/ml，CL为(6.30±1.05) L/h，T1/2α为(13.30±2.06) min，T1/2β为(67.94±21.39)min。
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Collen等[5]曾用10 mg r-SAK静脉输注30 min的方法治疗5例急性心梗的患者，并测定了药代动力学参数，在输注结束时血药浓度在900～1 700 ng/ml，其T1/2α为(6.3±0.6)min，T1/2β为(37±15)min。其峰浓度与我们的结果相近，但变异较大，其T1/2α和T1/2β较我们的结果略小，可能与患者消耗r-SAK较快，亦可能与人种的差异有关。
本研究过程中，有3例受试者在开始给药后15～30 min出现牙龈渗血，立即查出血时间、激活部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间，均未见明显改变，至给药30～60 min后，渗血自动停止。经追问病史，3例受试者有牙龈炎，早晨刷牙偶有出血，实验中渗血的发生与r-SAK溶解牙龈部的血栓有关，是r-SAK溶栓作用的药理表现。根据上述渗血发生和停止的时间，结合药代动力学研究结果，r-SAK的溶栓起效浓度约在500 ng/ml左右，建议临床给药方式为10 mg 30 min内静脉输注，必要时，在第1次给药结束后的30～60 min，可再给药1次。
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致谢：本研究工作蒙成都金鹏生物技术有限公司佟彬经理和上海植物生理研究所王家驯教授的大力支持，特致由衷谢意。
国家1035工程“九五”科技攻关基金资助项目(No96-901-01-44)
参考文献
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(2000-01-17收稿), http://www.100md.com