瓜蒌皮提取物对大鼠主动脉PDC Ca2+内流的影响△
作者：莫尚武* 刘 宁 张坐奎 吴玉蓉 杨 涛
单位：莫尚武* 刘 宁 张坐奎 四川大学原子核科学技术研究所 成都 610064；吴玉蓉 杨 涛 四川大学化学系
关键词：瓜蒌皮；钙拮抗剂；放射性同位素45Ca；冠心病
中草药990918 摘 要 为了研究瓜蒌皮治疗冠心病的有效成分，用醚醇法和水煎醇沉法提取瓜蒌皮的有效成分，并用45Ca跨膜测量方法研究各提取物对大鼠主动脉PDC钙通道Ca2+内流的影响。发现氯仿和醇溶物能阻滞Ca2+内流，水溶物具有相反的作用，其中氯仿提取物浓度为30 mg/mL时，使Ca2+内流量比对照下降31.57%。实验结果表明瓜蒌皮中可能有7种组分具有治疗冠心病的活性。
, http://www.100md.com Influence of Extract of Mesocarp of Mongolian Snakegourd (Trichosanthes kirilowii)
on Transmembrane Ca2+ Influx in Rat Aortic Ring
Mo Shangwu, Wu Yurong, Liu Ning, et al
(Institute of Nuclear Sciences and Technology, Sichuan University, Chengdu 610064)
Abstract Powdered mesocarp of Trichosanthes kirilowii Maxim. was extracted with petroleum ether, ethanol and water, partitioned with chloroform and ethyl acetate or precipitated with the addition of ethanol to obtain a total of 14 fractions. Their effects on Ca2+ influx of rat aortic rings were studied with 45Ca transmembrane influx technique. Results showed that 7 fractions could block potential dependent Ca2+ influx, suggesting their potential use for the treatment of coronary heart diseases. Among them, chloroform extract resulted in a decrease of Ca2+ influx of 31.57% in comparison with the control.
, 百拇医药
Key words Trichosanthes kirilowii Maxim. Ca2+ antagonist 45Ca influx
瓜蒌始载于《名医别录》，原名栝楼实，为葫芦科植物栝楼Trichosanthes ririlowii Marim.或双边栝楼T. rosthornii Harms的干燥成熟果实。果实剖开，除去果瓤及种子称瓜蒌皮。皮、籽合用称瓜蒌。瓜蒌是一种常用中药，具有清热、涤痰、宽胸散结，润燥滑肠之功效，对肺热、咳嗽、胸痹心痛、乳痛、肺痈、大便秘结有显著疗效[1，2]。近年来研究证明瓜蒌有扩张冠脉、保护心肌缺血等功效[3]。为了阐明瓜蒌治疗冠心病的有效成分，笔者用醚醇法和水煎醇沉法[4]从瓜蒌皮中分离提取出14个组分，并用45Ca跨膜测量方法研究了各组分对大鼠主动脉电压依赖钙通道(PDC) Ca2+内流的影响。冠心病的发病机制，和 Ca2+大量涌入心血管细胞中有重要关系，用钙拮抗剂阻滞钙通道，减少 Ca2+内流，病况将出现好转[5，6]。因此，瓜蒌提取物中凡能阻滞钙通道，减少 Ca2+内流的组分将被认为是治疗冠心病的有效成分之一。血管平滑肌细胞膜上至少存在3种钙内流途径：(1)溢流(leak)钙通道，细胞处于静息状态下的 Ca2+内流；(2)电位依赖性钙通道(potentital-dependent Ca2+ channels,PDC)；(3)受体操纵性钙通道(recptor-operated Ca2+ chennels,ROC)。当高钾引起平滑肌细胞膜去极化，导致PDC开放时， Ca2+内流量较leak和ROC都强，因此研究瓜蒌皮提取物对大鼠主动脉PDC Ca2+ 内流的影响，对筛选治疗冠心病中药的有效成分有一定意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物及药品：Wistar大鼠，体重(200±20) g，雌雄兼用，购自成都抗生素研究所实验动物中心；放射性同位素45CaCl2(1 750 MBq/g Ca)英国Amershan公司产品，硅胶H60青岛海洋化工厂产品。其它药物市售分析纯。
1.2 试液：PSS溶液(mmol/L):NaCl 137,CaCl2 1.5,MgCl2 1.0,KCl 3.0,HEPES 20，葡萄糖 20；高钾PSS溶液(mmol/L):KCl 100, NaCl 40,其余成分同PSS溶液；无 Ca2+-EGTA洗涤液(mmol/L)：EGTA 10，无CaCl2，其余成分同PSS液，以上溶液用重蒸水配制pH7.4；甲苯闪烁液：PPO 5.0 g，POPOP 0.4 g，乙二醇乙醚300 mL加甲苯定容至1 000 mL。
, 百拇医药
1.3 瓜蒌皮分离提取方法
1.3.1 醚醇提取法：将瓜蒌皮粉碎用石油醚回流提取2 h，残渣再用95%乙醇回流2 h，然后将提取液浓缩，浓缩液分别用50 mL的水-氯仿=1∶1；水-乙酸乙酯=1∶1洗涤，得石油醚、氯仿、乙酸乙酯有机相和水相4个组分，将各组分除尽溶剂，配成30 mg/mL水溶液备用(若不溶可加少量吐温-40)。
1.3.2 水煎醇沉法：将瓜蒌皮粉碎，水煎3次，合并滤液蒸发成浸膏状，95%乙醇沉淀，滤液蒸干，过大孔树脂，分别用水和30%，70%，95%的乙醇梯度洗脱，除尽溶剂，配制成30 mg/mL水溶液备用。
1.4 45Ca跨膜测量：按文献[7，8]加以改进。击昏大鼠取出胸主动脉，置于PSS溶液中轻轻除去血管外结缔组织，剪成长5～6 mm的动脉环(重5 mg左右)，将动脉环置PSS液中保温1 h，移动脉环到含45Ca(37 kBq/mL)的PSS平衡10 min；再移动脉环到含45Ca(37 kBq/mL)高钾溶液中处理10 min,以上步骤都是在37℃连续通O2条件下进行。然后将动脉环移入0～2℃无钙EGTA中洗涤1 h，用滤纸吸干动脉环称重后，分别放入测量瓶中，加入70%HClO4 25 μL和30%H2O2 50 μL，于80℃水浴中消化20 min，冷却后加甲苯闪烁液4 mL黑暗中放置3 h，用EJ-2107P液体闪烁计数器测量放射性活度(dpm)。动脉环 Ca2+内流量由以下公式确定：
, 百拇医药
Ca2+内流量(μmol/kg)=
实验数据用
+s表示，用t检验计算显著性差异。操作过程中，待测药物于保温0.5 h后加入到PSS液中，继续保温0.5 h，移入到45Ca-PSS平衡液和45Ca-高钾液这两溶液中也含相同浓度待测药物。对照组于相应步骤加等量的三蒸水。
2 实验结果
2.1 瓜蒌皮醚醇法提取物 Ca2+拮抗作用：见表1。
表1 瓜蒌皮醚醇法提取物对PDCCa2+内流的影响 组别
, 百拇医药
浓度(mg/mL)
Ca2+内流量(μmol/kg)
对照
—
182.80±14.84
石油醚组
30
138.98±8.11**
石油醚组
3
167.27±13.58*
, 百拇医药
氯仿组
30
127.50±10.0***
氯仿组
3
158.16±11.34**
乙酸乙酯组
30
143.76±18.81**
乙酸乙酯组
3
169.87±13.32*
, 百拇医药
水溶组
30
216.79±8.55**
水溶组
3
208.79±14.39**
n=6，与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01
***P<0.001
石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物浓度在30 mg/mL时，都使 Ca2+内流显著减少，当浓度稀释10倍，即为3mg/mL时，仅氯仿组阻滞 Ca2+内流的作用仍显著。表明氯仿萃取物钙拮抗作用很好。水溶组分不使 Ca2+内流减少，反使 Ca2+内流上升。浓度为30和3mg/mL的 Ca2+内流量比对照分别增加33.99和25.99(μmol/kg)。说明水溶物不仅无钙拮抗作用，而且有激动作用。
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2.2 氯仿组分薄层分离的4种成分的钙拮抗作用：见表2。将氯仿提取物过硅胶柱(G60)，用丙酮-乙酸乙酯-石油醚=1∶2.7∶2.7进行薄层分析，发现共有4个斑点。A：Rf=0.86,B:为两种物质Rf1=0.61、Rf2=0.46，C：Rf=0.22，D：Rf=0(即在原点)。用展开剂分离洗脱获取A，B，C，D 4种成分。从表2看出，当浓度为10 mg/mL时，这4种成分的钙拮抗作用与对照组比都有显著差异。而相互之间差异不大。说明这4种成分药效学特性相近。
表2 氯仿组分中4种成分对PDC Ca2+内流的影响 组别
浓度(mg/mL)
Ca2+内流量(μmol/kg)
对照
, http://www.100md.com
—
179.52±10.26
A
10
156.39±6.40**
B
10
152.80±13.98**
C
10
152.49±3.61**
D
, 百拇医药
10
149.50±16.99**
n=6，与对照组比较：**P<0.05
2.3 水煎醇沉法提取物的 Ca2+拮抗作用：见表3。
表3 水煎醇沉法提取物对PDC Ca2+内流的影响 组 别
浓度(mg/mL)
Ca2+内流量(μmol/kg)
对照
—
189.25±10.84
, 百拇医药
水煎液
30
179.10±15.56*
水煎液的醇沉物
30
223.16±15.92**
醇溶液过柱30%乙醇洗
30
169.40±11.92**
70%乙醇洗
30
, 百拇医药
149.06±6.6**
95%乙醇洗
30
164.16±11.89**
水洗
30
198.27±14.61*
n=6，与对照组比较：*P>0.05 **P<0.05
结果表明：瓜蒌皮水煎液的钙拮抗作用很弱， Ca2+内流比对照组下降仅8.1 μmol/kg，差异不明显。水煎液乙醇的沉淀物没有钙拮抗作用，反而使 Ca2+内流增加35.91 μmol/kg。水煎液醇沉后的醇溶部分，经柱层析，水洗脱组分，也无钙拮抗作用，而且能使内流上升。乙醇30%～95%的洗脱组分，都使 Ca2+内流减少，共中70%乙醇洗脱组比对照降低达20.40%，有显著差异。
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3 讨论
3.1 瓜蒌中所含化学成分十分复杂，用常规方法筛选治冠心病的活性成分工作量较大，在分离筛选过程中，有效成分易丢失，最后得到的单体化合物往往不令人满意。用45Ca跨膜测量技术和化学分离方法相结合，初步确定氯仿萃取的4种成分和30%～95%乙醇洗脱的3种组分具有钙拮抗作用。这几种组分可能是瓜蒌皮治疗冠心病的有效成分之一。今后拟进一步分离纯化，再用质谱、核磁共振谱以确定其分子结构。
3.2 瓜蒌皮的水溶部份有明显的钙激动作用。目前有关钙拮抗剂研究资料较多，但钙激动剂研究资料还很少。其水溶部分主要由蛋白质、多糖、多肽组成。到底是那种物质有激动作用，有待深入研究。
3.3 45Ca跨膜流动测量方法，在筛选中药钙拮抗剂的有效成分研究中有快速、准确、直观等优点，可避免有效成分在分离、纯化过程中丢失。所得的有效成分是否真有价值，尚需进行临床检验。各提取组分对静流钙通道(leak)和受体钙通道(ROC)的影响，将另文报道。
, 百拇医药
参考文献
1 颜正华，主编.中药学.北京：人民卫生出版社，1991：611
2 巢志茂.中国中药杂志，1990，15(12)：49
3 杜上鉴.医药工业，1988，19(7)：301
4 陈 奇.中药药理研究方法.北京：人民卫生出版社，1993：66
5 张廷杰.心血管病学进展杂志.1995，16(1)：43
6 戴万生，等.云南中医学院学报，1994，17(2)：25
7 Godfraing T. J Pharmacol Exp Ther, 1983,224:443
8 陈恒留.新药与临床，1994，513(3)：144
收稿日期：1998-01-12, 百拇医药(莫尚武* 刘 宁 张坐奎 吴玉蓉 杨 涛)
单位：莫尚武* 刘 宁 张坐奎 四川大学原子核科学技术研究所 成都 610064；吴玉蓉 杨 涛 四川大学化学系
关键词：瓜蒌皮；钙拮抗剂；放射性同位素45Ca；冠心病
中草药990918 摘 要 为了研究瓜蒌皮治疗冠心病的有效成分，用醚醇法和水煎醇沉法提取瓜蒌皮的有效成分，并用45Ca跨膜测量方法研究各提取物对大鼠主动脉PDC钙通道Ca2+内流的影响。发现氯仿和醇溶物能阻滞Ca2+内流，水溶物具有相反的作用，其中氯仿提取物浓度为30 mg/mL时，使Ca2+内流量比对照下降31.57%。实验结果表明瓜蒌皮中可能有7种组分具有治疗冠心病的活性。
, http://www.100md.com Influence of Extract of Mesocarp of Mongolian Snakegourd (Trichosanthes kirilowii)
on Transmembrane Ca2+ Influx in Rat Aortic Ring
Mo Shangwu, Wu Yurong, Liu Ning, et al
(Institute of Nuclear Sciences and Technology, Sichuan University, Chengdu 610064)
Abstract Powdered mesocarp of Trichosanthes kirilowii Maxim. was extracted with petroleum ether, ethanol and water, partitioned with chloroform and ethyl acetate or precipitated with the addition of ethanol to obtain a total of 14 fractions. Their effects on Ca2+ influx of rat aortic rings were studied with 45Ca transmembrane influx technique. Results showed that 7 fractions could block potential dependent Ca2+ influx, suggesting their potential use for the treatment of coronary heart diseases. Among them, chloroform extract resulted in a decrease of Ca2+ influx of 31.57% in comparison with the control.
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Key words Trichosanthes kirilowii Maxim. Ca2+ antagonist 45Ca influx
瓜蒌始载于《名医别录》，原名栝楼实，为葫芦科植物栝楼Trichosanthes ririlowii Marim.或双边栝楼T. rosthornii Harms的干燥成熟果实。果实剖开，除去果瓤及种子称瓜蒌皮。皮、籽合用称瓜蒌。瓜蒌是一种常用中药，具有清热、涤痰、宽胸散结，润燥滑肠之功效，对肺热、咳嗽、胸痹心痛、乳痛、肺痈、大便秘结有显著疗效[1，2]。近年来研究证明瓜蒌有扩张冠脉、保护心肌缺血等功效[3]。为了阐明瓜蒌治疗冠心病的有效成分，笔者用醚醇法和水煎醇沉法[4]从瓜蒌皮中分离提取出14个组分，并用45Ca跨膜测量方法研究了各组分对大鼠主动脉电压依赖钙通道(PDC) Ca2+内流的影响。冠心病的发病机制，和 Ca2+大量涌入心血管细胞中有重要关系，用钙拮抗剂阻滞钙通道，减少 Ca2+内流，病况将出现好转[5，6]。因此，瓜蒌提取物中凡能阻滞钙通道，减少 Ca2+内流的组分将被认为是治疗冠心病的有效成分之一。血管平滑肌细胞膜上至少存在3种钙内流途径：(1)溢流(leak)钙通道，细胞处于静息状态下的 Ca2+内流；(2)电位依赖性钙通道(potentital-dependent Ca2+ channels,PDC)；(3)受体操纵性钙通道(recptor-operated Ca2+ chennels,ROC)。当高钾引起平滑肌细胞膜去极化，导致PDC开放时， Ca2+内流量较leak和ROC都强，因此研究瓜蒌皮提取物对大鼠主动脉PDC Ca2+ 内流的影响，对筛选治疗冠心病中药的有效成分有一定意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物及药品：Wistar大鼠，体重(200±20) g，雌雄兼用，购自成都抗生素研究所实验动物中心；放射性同位素45CaCl2(1 750 MBq/g Ca)英国Amershan公司产品，硅胶H60青岛海洋化工厂产品。其它药物市售分析纯。
1.2 试液：PSS溶液(mmol/L):NaCl 137,CaCl2 1.5,MgCl2 1.0,KCl 3.0,HEPES 20，葡萄糖 20；高钾PSS溶液(mmol/L):KCl 100, NaCl 40,其余成分同PSS溶液；无 Ca2+-EGTA洗涤液(mmol/L)：EGTA 10，无CaCl2，其余成分同PSS液，以上溶液用重蒸水配制pH7.4；甲苯闪烁液：PPO 5.0 g，POPOP 0.4 g，乙二醇乙醚300 mL加甲苯定容至1 000 mL。
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1.3 瓜蒌皮分离提取方法
1.3.1 醚醇提取法：将瓜蒌皮粉碎用石油醚回流提取2 h，残渣再用95%乙醇回流2 h，然后将提取液浓缩，浓缩液分别用50 mL的水-氯仿=1∶1；水-乙酸乙酯=1∶1洗涤，得石油醚、氯仿、乙酸乙酯有机相和水相4个组分，将各组分除尽溶剂，配成30 mg/mL水溶液备用(若不溶可加少量吐温-40)。
1.3.2 水煎醇沉法：将瓜蒌皮粉碎，水煎3次，合并滤液蒸发成浸膏状，95%乙醇沉淀，滤液蒸干，过大孔树脂，分别用水和30%，70%，95%的乙醇梯度洗脱，除尽溶剂，配制成30 mg/mL水溶液备用。
1.4 45Ca跨膜测量：按文献[7，8]加以改进。击昏大鼠取出胸主动脉，置于PSS溶液中轻轻除去血管外结缔组织，剪成长5～6 mm的动脉环(重5 mg左右)，将动脉环置PSS液中保温1 h，移动脉环到含45Ca(37 kBq/mL)的PSS平衡10 min；再移动脉环到含45Ca(37 kBq/mL)高钾溶液中处理10 min,以上步骤都是在37℃连续通O2条件下进行。然后将动脉环移入0～2℃无钙EGTA中洗涤1 h，用滤纸吸干动脉环称重后，分别放入测量瓶中，加入70%HClO4 25 μL和30%H2O2 50 μL，于80℃水浴中消化20 min，冷却后加甲苯闪烁液4 mL黑暗中放置3 h，用EJ-2107P液体闪烁计数器测量放射性活度(dpm)。动脉环 Ca2+内流量由以下公式确定：
, 百拇医药
Ca2+内流量(μmol/kg)=
实验数据用
+s表示，用t检验计算显著性差异。操作过程中，待测药物于保温0.5 h后加入到PSS液中，继续保温0.5 h，移入到45Ca-PSS平衡液和45Ca-高钾液这两溶液中也含相同浓度待测药物。对照组于相应步骤加等量的三蒸水。2 实验结果
2.1 瓜蒌皮醚醇法提取物 Ca2+拮抗作用：见表1。
表1 瓜蒌皮醚醇法提取物对PDCCa2+内流的影响 组别
, 百拇医药
浓度(mg/mL)
Ca2+内流量(μmol/kg)
对照
—
182.80±14.84
石油醚组
30
138.98±8.11**
石油醚组
3
167.27±13.58*
, 百拇医药
氯仿组
30
127.50±10.0***
氯仿组
3
158.16±11.34**
乙酸乙酯组
30
143.76±18.81**
乙酸乙酯组
3
169.87±13.32*
, 百拇医药
水溶组
30
216.79±8.55**
水溶组
3
208.79±14.39**
n=6，与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01
***P<0.001
石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物浓度在30 mg/mL时，都使 Ca2+内流显著减少，当浓度稀释10倍，即为3mg/mL时，仅氯仿组阻滞 Ca2+内流的作用仍显著。表明氯仿萃取物钙拮抗作用很好。水溶组分不使 Ca2+内流减少，反使 Ca2+内流上升。浓度为30和3mg/mL的 Ca2+内流量比对照分别增加33.99和25.99(μmol/kg)。说明水溶物不仅无钙拮抗作用，而且有激动作用。
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2.2 氯仿组分薄层分离的4种成分的钙拮抗作用：见表2。将氯仿提取物过硅胶柱(G60)，用丙酮-乙酸乙酯-石油醚=1∶2.7∶2.7进行薄层分析，发现共有4个斑点。A：Rf=0.86,B:为两种物质Rf1=0.61、Rf2=0.46，C：Rf=0.22，D：Rf=0(即在原点)。用展开剂分离洗脱获取A，B，C，D 4种成分。从表2看出，当浓度为10 mg/mL时，这4种成分的钙拮抗作用与对照组比都有显著差异。而相互之间差异不大。说明这4种成分药效学特性相近。
表2 氯仿组分中4种成分对PDC Ca2+内流的影响 组别
浓度(mg/mL)
Ca2+内流量(μmol/kg)
对照
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—
179.52±10.26
A
10
156.39±6.40**
B
10
152.80±13.98**
C
10
152.49±3.61**
D
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10
149.50±16.99**
n=6，与对照组比较：**P<0.05
2.3 水煎醇沉法提取物的 Ca2+拮抗作用：见表3。
表3 水煎醇沉法提取物对PDC Ca2+内流的影响 组 别
浓度(mg/mL)
Ca2+内流量(μmol/kg)
对照
—
189.25±10.84
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水煎液
30
179.10±15.56*
水煎液的醇沉物
30
223.16±15.92**
醇溶液过柱30%乙醇洗
30
169.40±11.92**
70%乙醇洗
30
, 百拇医药
149.06±6.6**
95%乙醇洗
30
164.16±11.89**
水洗
30
198.27±14.61*
n=6，与对照组比较：*P>0.05 **P<0.05
结果表明：瓜蒌皮水煎液的钙拮抗作用很弱， Ca2+内流比对照组下降仅8.1 μmol/kg，差异不明显。水煎液乙醇的沉淀物没有钙拮抗作用，反而使 Ca2+内流增加35.91 μmol/kg。水煎液醇沉后的醇溶部分，经柱层析，水洗脱组分，也无钙拮抗作用，而且能使内流上升。乙醇30%～95%的洗脱组分，都使 Ca2+内流减少，共中70%乙醇洗脱组比对照降低达20.40%，有显著差异。
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3 讨论
3.1 瓜蒌中所含化学成分十分复杂，用常规方法筛选治冠心病的活性成分工作量较大，在分离筛选过程中，有效成分易丢失，最后得到的单体化合物往往不令人满意。用45Ca跨膜测量技术和化学分离方法相结合，初步确定氯仿萃取的4种成分和30%～95%乙醇洗脱的3种组分具有钙拮抗作用。这几种组分可能是瓜蒌皮治疗冠心病的有效成分之一。今后拟进一步分离纯化，再用质谱、核磁共振谱以确定其分子结构。
3.2 瓜蒌皮的水溶部份有明显的钙激动作用。目前有关钙拮抗剂研究资料较多，但钙激动剂研究资料还很少。其水溶部分主要由蛋白质、多糖、多肽组成。到底是那种物质有激动作用，有待深入研究。
3.3 45Ca跨膜流动测量方法，在筛选中药钙拮抗剂的有效成分研究中有快速、准确、直观等优点，可避免有效成分在分离、纯化过程中丢失。所得的有效成分是否真有价值，尚需进行临床检验。各提取组分对静流钙通道(leak)和受体钙通道(ROC)的影响，将另文报道。
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参考文献
1 颜正华，主编.中药学.北京：人民卫生出版社，1991：611
2 巢志茂.中国中药杂志，1990，15(12)：49
3 杜上鉴.医药工业，1988，19(7)：301
4 陈 奇.中药药理研究方法.北京：人民卫生出版社，1993：66
5 张廷杰.心血管病学进展杂志.1995，16(1)：43
6 戴万生，等.云南中医学院学报，1994，17(2)：25
7 Godfraing T. J Pharmacol Exp Ther, 1983,224:443
8 陈恒留.新药与临床，1994，513(3)：144
收稿日期：1998-01-12, 百拇医药(莫尚武* 刘 宁 张坐奎 吴玉蓉 杨 涛)