心肌肽素对缺血-再灌流损伤大鼠离体心脏的影响
作者：万华印 孔祥平 易学瑞 宋珍 滕健 范礼理
单位：万华印 孔祥平 易学瑞(中国人民解放军第458医院传染病中心分子生物学科 广州 510602)；宋珍(中国医学科学院阜外医院临床药理基地)；滕健 范礼理(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所)
关键词：心肌肽素；再灌流损伤；心肌酶；脂质过氧化物
中草药000317 摘 要 为研究小分子多肽类物质心肌肽素抗心肌缺血-再灌流损伤作用，在大鼠离体Langendoff's心脏缺血-再灌流损伤模型上，观察心肌肽素对室颤(VF)发生率及心肌生化指标的影响。结果发现：心肌肽素能明显降低离体缺血-再灌流损伤心脏VF的发生率；剂量依赖性地降低心肌乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量；提高心肌肌酸磷酸激酶(CPK)活性。提示心肌肽素对缺血-再灌流损伤心肌有保护作用，这可能与其抗脂质过氧化和影响心肌酶的活性有关。
, 百拇医药
Effect of Cardiomyopeptidin on Isolated Rat Heart Injured by Ischemia-Reperfusion
Wan Huayin,Kong Xiangping and Yi Xuerui
(Department of Molecular Biology,the Infectious Disease Center of No.458 Hospital of PLA (Guangzhou 510602)
Song Zhen,Teng Jian and Fan Lili
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences)
, 百拇医药 Abstract Effects of the low molecular weight polypeptide cardiomyopeptidin (CMP) on ischemia-reperfusion injury (IRI) inflicted on myocardium of the Langendorff model of isolated rat heart were studied.The results showed that CMP could obviously decrease the incidence of ventricular fibrillation in heart damaged by IRI; reduce the activity of LDH and MDA content and increase the activity of CPK in anterior wall of ventricular myocardium in a dose dependent manner.The results indicated that CMP had a protective effect on IRI infliction of the myocardium which be related to its inhibitory effect on lipid peroxidation and influencing the activities of myocardial enzymes.
, 百拇医药
Key words cardiomyopeptidin ischemia-reperfusion injury myocardial enzyme lipid peroxidation▲
自Jennings等[1]1960年发现再灌损伤以来，抗缺血-再灌流损伤(ischemia-reperfusion injury,I-RI)的研究就成为医学基础与临床的重点课题之一[2]。有关多肽类物质抗缺血-再灌流损伤的研究也日益受到人们的重视[3]，但尚未见从乳猪心脏提取的活性多肽抗心肌缺血-再灌流损伤的报道。我们对该活性物质的药理作用进行了较系统的研究，旨在为新药开发提供药效学依据。
1 材料与方法
1.1 药物：心肌肽素(cardiomyopeptidin,CMP) 溶液，橙色透明，由中国人民解放军第四五八医院提供，多肽含量为10 mg/mL。盐酸维拉帕米(verapamil hydrochloride,Ver)注射液，江苏连云港制药厂生产，含量为5 mg/2 mL。
, 百拇医药
1.2 试剂：肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase,CPK)试剂盒及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒均购自北京化工二厂。硫代巴比妥酸为Sigma公司产品。
1.3 动物：Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物中心，体重为(300±50) g，雌雄兼用。10只动物为一组。
1.4 离体心脏心肌缺血-再灌流损伤模型[4]：大鼠ip麻醉后，经静注肝素抗凝，取心脏作主动脉插管，进行心脏灌流。灌流营养液成分：高Ca2+，低K+并充以95%O2+5% CO2的混合气体。灌流速度6～8 mL/min，温度(37±0.5) ℃。阻断左前降支(LAD) 10 min，再灌流15 min。
1.5 分组与给药：正常对照组行假手术，持续灌流营养液；给药组于缺血前5 min，开始灌流含有心肌肽素(终浓度为10，50，100 μg/mL)或维拉帕米(1 μg/mL)的营养液，直至再灌流5 min，换成不含药的营养液；缺血-再灌流组则持续灌流营养液。
, http://www.100md.com
1.6 检测指标：以试剂盒测定左心室前壁(缺血区)与后壁(非缺血区)心肌CPK、LDH活性，用硫代巴比妥酸法[5]测定脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量。蛋白质定量用Folin酚法。
1.7 统计处理：实验数据以百分率或均数±标准差表示。进行χ2检验或t检验。
2 结果
2.1 心肌肽素对缺血-再灌流离体大鼠心脏VF发生率的影响：缺血-再灌流组心脏VF发生率高达90%，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)。心肌肽素各剂量组VF发生率仅10%～20%，与缺血-再灌流组比较，下降均有非常显著意义(P<0.01)，见表1。
表1 心肌肽素对缺血-再灌流离体大鼠心脏
VF发生率的影响(n=10，
±s) 组别
, 百拇医药
剂量
(μg/mL)
心室纤颤
发生数
发生率(%)
假手术
—
0
0
缺血-再灌流
—
9
90△
, 百拇医药
缺血-再灌流+心肌肽素
10
1
10*
50
2
20*
100
1
10*
缺血-再灌流+维拉帕米
1
, 百拇医药
0
0*
与假手术组比较：△P<0.01
与缺血-再灌流组比较：*P<0.01
2.2 对离体大鼠心脏缺血-再灌流心肌CPK活性的影响：缺血-再灌流组左室前壁与后壁心肌的CPK活性均降低，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)，且以前壁(缺血区)降低更为明显。心肌肽素10～100 μg/mL 3 个剂量组的心肌CPK活性均较缺血-再灌流组升高，且均有非常显著意义(P<0.01)。其作用与灌流维拉帕米1 μg/mL相似，见表2。
表2 心肌肽素对离体大鼠心肌CPK活性的影响
(n=10，±s) 组别
, http://www.100md.com
剂量
(μg/mL)
心肌CPK(U/100 mg.pro)
前 壁
后 壁
假手术
—
271±25
245±21
缺血-再灌流
—
113±7.7△
, http://www.100md.com
174±18△
缺血-再灌流+心肌肽素
10
166±17*
206±13*
50
194±13*
203±11*
100
187±15*
201±16*
, http://www.100md.com
缺血-再灌流+维拉帕米
1
185±17*
206±27*
与假手术组比较：△P<0.01 与缺血-再灌流组比较：P<0.01
2.3 对离体大鼠心脏缺血-再灌流心肌LDH活性的影响：缺血-再灌流引起心肌LDH活性增加，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)。3 个剂量心肌肽素组LDH活性剂量依赖性下降(r前壁=-0.96，P<0.01)，与缺血-再灌流组比较均有非常显著意义(P<0.01)。此作用亦与维拉帕米1 μg/mL相似，见表3，图1。
表3 心肌肽素对离体大鼠心肌LDH活性的影响
, 百拇医药
(n=10，±s) 组别
剂量
(μg/mL)
心肌LDH(U/100 mg.pro)
前 壁
后 壁
假手术
—
21.0±1.5
21.2±0.92
缺血-再灌流
, http://www.100md.com
—
35.5±3.3△
24.3±1.5△
缺血-再灌流+心肌肽素
10
26.2±0.98*
21.9±0.99*
50
23.6±1.5*
21.1±0.73*
100
, 百拇医药
22.4±0.72*
20.7±0.93*
缺血-再灌流+维拉帕米
1
24.0±1.6*
22.3±1.3*
与假手术组比较：△P<0.01；与缺血-再灌流组比较：*P<0.01
图1 心肌肽素剂量与离体大鼠左室前壁心肌
, 百拇医药
LDH活性的关系
2.4 对离体大鼠心脏缺血-再灌流心肌MDA含量的影响：缺血-再灌流导致心肌MDA含量明显升高，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)。10～100 μg/mL心肌肽素灌流，能剂量依赖性地降低左室前壁MDA含量(r前壁=-0.98，P<0.01)，与缺血-再灌流组比较均有非常显著意义(P<0.01)；而对后壁MDA含量均无明显影响(P>0.05)。维拉帕米组MDA含量也下降，与缺血-再灌流组比较亦有非常显著意义(P<0.01)，见表4，图2。
3 讨论
在缺血-再灌流损伤中，氧自由基发挥了重要作用[6]，Ca2+的超载又易导致心律失常[7]。本实验以CPK、LDH活性反映缺血心肌细胞受损情况；检测脂质过氧化反应终产物MDA的含量，以反映氧自由基损伤的程度，并探讨它们与心室颤动的关系。结表4 心肌肽素对离体大鼠心肌MDA含量的影响
, 百拇医药
(n=10，±s) 组别
剂量
(μg/mL)
心肌MDA(nmol/100 mg.pro)
前 壁
后 壁
假手术
—
84.3±5.5
77.3±4.6
缺血-再灌流
, http://www.100md.com
—
161±14.0△△△
90.0±3.1△△△
缺血-再灌流+心肌肽素
10
112±7.7***
88.2±4.0*
50
94.7±4.0***
90.1±5.1*
, 百拇医药 100
83.8±5.3***
84.4±4.9*
缺血-再灌流+维拉帕米
1
89.3±3.6***
81.4±3.5***
与假手术组比较：△△△P<0.01
与缺血-再灌流组比较：*P>0.05 ***P<0.01
, 百拇医药
图2 心肌肽素剂量与离体大鼠左室 前壁心肌
MDA含量的关系
果发现损伤组心脏室颤发生率较假手术组显著提高，同时，心肌酶活性及MDA含量也发生显 著改变。
动物药是中药的一个重要组成部分[8]，利用生化技术提取脏器中有效成分，应用于临床治疗已有报道[9]。心肌肽素为从乳猪 心脏中提取的活性多肽，我们发现其对离体心脏缺血-再灌流损伤导致的室颤有明显的预防 作用。在缺血-再灌流后心肌脂质过氧化反应加强，MDA含量增加，心肌肽素可剂量依赖性 地降低MDA含量，减轻自由基损伤。损伤组心肌出现变性、坏死，使膜功能受损，细胞内CPK 外逸，致心肌CPK活性显著下降[10]，心肌肽素可显著提高心肌CPK活性，提示其可 减轻心肌损伤。心肌缺血后细胞内无氧代谢加强，诱导产生LDH增加[10]，心肌肽 素能剂量依赖性地降低心肌前壁LDH活性，改善缺血-再灌流心肌能量代谢。心肌MDA、CPK 及LDH的变化均以缺血部位心肌为甚，提示缺血损伤是缺血-再灌流损伤的基础。钙拮抗剂 预防性给药对缺血-再灌流损伤也有明显的保护作用。
, http://www.100md.com
上述结果提示心肌肽素对大鼠缺血-再灌流损伤离体心脏有保护作用，可能与其降低心肌MD A含量及LDH活性，提高CPK活性有关。至于其与细胞内Ca2+的关系等，将另文报道。■
“九.五”国家重点科技攻关项目(No.96-902-01-04)
万华印，男，1989年毕业于第一军医大学医疗系，获医学学士；1994年毕业于该校药理专业，获医学硕士。现为中国人民解放军第458医院主治医师。主要研究方向：心血管药理及临床，生化新药的基础研究与开发。现已发表论文12篇，参与编写著作1部，获军队科技进步奖3项。
参考文献
1，Jennings R B,et al.Arch Pathol,1960,70(7) :68
, 百拇医药
2，Hammerman C,et al.Clin Perinatol,1998,25(3 ):757
3，Kalfin R,et al.J Pharmacol Exp Ther,1994 2 68(2):952
4，Shekher A,et al.Methods Find Exp Clin Pharm acol,1997,19(4):223
5，万华印，等.中草药，1996，27(2)：103
6，Du G,et al.Free Radic Biol Med,1998,25(9) :1066
7，Yoshizumi M,et al.Scand Cardiovasc J,1998,32(3):167
8，邓明鲁，等.长春中医学院学报，1995，11(1)：50
9，傅建明，等.中国新药杂志，1997，6(1)：40
10，Ma X L,et al.Cardiovasc Res,1997,36(2):195
(收稿日期：1999-05-18), 百拇医药
单位：万华印 孔祥平 易学瑞(中国人民解放军第458医院传染病中心分子生物学科 广州 510602)；宋珍(中国医学科学院阜外医院临床药理基地)；滕健 范礼理(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所)
关键词：心肌肽素；再灌流损伤；心肌酶；脂质过氧化物
中草药000317 摘 要 为研究小分子多肽类物质心肌肽素抗心肌缺血-再灌流损伤作用，在大鼠离体Langendoff's心脏缺血-再灌流损伤模型上，观察心肌肽素对室颤(VF)发生率及心肌生化指标的影响。结果发现：心肌肽素能明显降低离体缺血-再灌流损伤心脏VF的发生率；剂量依赖性地降低心肌乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量；提高心肌肌酸磷酸激酶(CPK)活性。提示心肌肽素对缺血-再灌流损伤心肌有保护作用，这可能与其抗脂质过氧化和影响心肌酶的活性有关。
, 百拇医药
Effect of Cardiomyopeptidin on Isolated Rat Heart Injured by Ischemia-Reperfusion
Wan Huayin,Kong Xiangping and Yi Xuerui
(Department of Molecular Biology,the Infectious Disease Center of No.458 Hospital of PLA (Guangzhou 510602)
Song Zhen,Teng Jian and Fan Lili
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences)
, 百拇医药 Abstract Effects of the low molecular weight polypeptide cardiomyopeptidin (CMP) on ischemia-reperfusion injury (IRI) inflicted on myocardium of the Langendorff model of isolated rat heart were studied.The results showed that CMP could obviously decrease the incidence of ventricular fibrillation in heart damaged by IRI; reduce the activity of LDH and MDA content and increase the activity of CPK in anterior wall of ventricular myocardium in a dose dependent manner.The results indicated that CMP had a protective effect on IRI infliction of the myocardium which be related to its inhibitory effect on lipid peroxidation and influencing the activities of myocardial enzymes.
, 百拇医药
Key words cardiomyopeptidin ischemia-reperfusion injury myocardial enzyme lipid peroxidation▲
自Jennings等[1]1960年发现再灌损伤以来，抗缺血-再灌流损伤(ischemia-reperfusion injury,I-RI)的研究就成为医学基础与临床的重点课题之一[2]。有关多肽类物质抗缺血-再灌流损伤的研究也日益受到人们的重视[3]，但尚未见从乳猪心脏提取的活性多肽抗心肌缺血-再灌流损伤的报道。我们对该活性物质的药理作用进行了较系统的研究，旨在为新药开发提供药效学依据。
1 材料与方法
1.1 药物：心肌肽素(cardiomyopeptidin,CMP) 溶液，橙色透明，由中国人民解放军第四五八医院提供，多肽含量为10 mg/mL。盐酸维拉帕米(verapamil hydrochloride,Ver)注射液，江苏连云港制药厂生产，含量为5 mg/2 mL。
, 百拇医药
1.2 试剂：肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase,CPK)试剂盒及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒均购自北京化工二厂。硫代巴比妥酸为Sigma公司产品。
1.3 动物：Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物中心，体重为(300±50) g，雌雄兼用。10只动物为一组。
1.4 离体心脏心肌缺血-再灌流损伤模型[4]：大鼠ip麻醉后，经静注肝素抗凝，取心脏作主动脉插管，进行心脏灌流。灌流营养液成分：高Ca2+，低K+并充以95%O2+5% CO2的混合气体。灌流速度6～8 mL/min，温度(37±0.5) ℃。阻断左前降支(LAD) 10 min，再灌流15 min。
1.5 分组与给药：正常对照组行假手术，持续灌流营养液；给药组于缺血前5 min，开始灌流含有心肌肽素(终浓度为10，50，100 μg/mL)或维拉帕米(1 μg/mL)的营养液，直至再灌流5 min，换成不含药的营养液；缺血-再灌流组则持续灌流营养液。
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1.6 检测指标：以试剂盒测定左心室前壁(缺血区)与后壁(非缺血区)心肌CPK、LDH活性，用硫代巴比妥酸法[5]测定脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量。蛋白质定量用Folin酚法。
1.7 统计处理：实验数据以百分率或均数±标准差表示。进行χ2检验或t检验。
2 结果
2.1 心肌肽素对缺血-再灌流离体大鼠心脏VF发生率的影响：缺血-再灌流组心脏VF发生率高达90%，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)。心肌肽素各剂量组VF发生率仅10%～20%，与缺血-再灌流组比较，下降均有非常显著意义(P<0.01)，见表1。
表1 心肌肽素对缺血-再灌流离体大鼠心脏
VF发生率的影响(n=10，
±s) 组别, 百拇医药
剂量
(μg/mL)
心室纤颤
发生数
发生率(%)
假手术
—
0
0
缺血-再灌流
—
9
90△
, 百拇医药
缺血-再灌流+心肌肽素
10
1
10*
50
2
20*
100
1
10*
缺血-再灌流+维拉帕米
1
, 百拇医药
0
0*
与假手术组比较：△P<0.01
与缺血-再灌流组比较：*P<0.01
2.2 对离体大鼠心脏缺血-再灌流心肌CPK活性的影响：缺血-再灌流组左室前壁与后壁心肌的CPK活性均降低，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)，且以前壁(缺血区)降低更为明显。心肌肽素10～100 μg/mL 3 个剂量组的心肌CPK活性均较缺血-再灌流组升高，且均有非常显著意义(P<0.01)。其作用与灌流维拉帕米1 μg/mL相似，见表2。
表2 心肌肽素对离体大鼠心肌CPK活性的影响
(n=10，
±s) 组别, http://www.100md.com
剂量
(μg/mL)
心肌CPK(U/100 mg.pro)
前 壁
后 壁
假手术
—
271±25
245±21
缺血-再灌流
—
113±7.7△
, http://www.100md.com
174±18△
缺血-再灌流+心肌肽素
10
166±17*
206±13*
50
194±13*
203±11*
100
187±15*
201±16*
, http://www.100md.com
缺血-再灌流+维拉帕米
1
185±17*
206±27*
与假手术组比较：△P<0.01 与缺血-再灌流组比较：P<0.01
2.3 对离体大鼠心脏缺血-再灌流心肌LDH活性的影响：缺血-再灌流引起心肌LDH活性增加，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)。3 个剂量心肌肽素组LDH活性剂量依赖性下降(r前壁=-0.96，P<0.01)，与缺血-再灌流组比较均有非常显著意义(P<0.01)。此作用亦与维拉帕米1 μg/mL相似，见表3，图1。
表3 心肌肽素对离体大鼠心肌LDH活性的影响
, 百拇医药
(n=10，
±s) 组别剂量
(μg/mL)
心肌LDH(U/100 mg.pro)
前 壁
后 壁
假手术
—
21.0±1.5
21.2±0.92
缺血-再灌流
, http://www.100md.com
—
35.5±3.3△
24.3±1.5△
缺血-再灌流+心肌肽素
10
26.2±0.98*
21.9±0.99*
50
23.6±1.5*
21.1±0.73*
100
, 百拇医药
22.4±0.72*
20.7±0.93*
缺血-再灌流+维拉帕米
1
24.0±1.6*
22.3±1.3*
与假手术组比较：△P<0.01；与缺血-再灌流组比较：*P<0.01
图1 心肌肽素剂量与离体大鼠左室前壁心肌
, 百拇医药
LDH活性的关系
2.4 对离体大鼠心脏缺血-再灌流心肌MDA含量的影响：缺血-再灌流导致心肌MDA含量明显升高，与假手术组比较有非常显著意义(P<0.01)。10～100 μg/mL心肌肽素灌流，能剂量依赖性地降低左室前壁MDA含量(r前壁=-0.98，P<0.01)，与缺血-再灌流组比较均有非常显著意义(P<0.01)；而对后壁MDA含量均无明显影响(P>0.05)。维拉帕米组MDA含量也下降，与缺血-再灌流组比较亦有非常显著意义(P<0.01)，见表4，图2。
3 讨论
在缺血-再灌流损伤中，氧自由基发挥了重要作用[6]，Ca2+的超载又易导致心律失常[7]。本实验以CPK、LDH活性反映缺血心肌细胞受损情况；检测脂质过氧化反应终产物MDA的含量，以反映氧自由基损伤的程度，并探讨它们与心室颤动的关系。结表4 心肌肽素对离体大鼠心肌MDA含量的影响
, 百拇医药
(n=10，
±s) 组别剂量
(μg/mL)
心肌MDA(nmol/100 mg.pro)
前 壁
后 壁
假手术
—
84.3±5.5
77.3±4.6
缺血-再灌流
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—
161±14.0△△△
90.0±3.1△△△
缺血-再灌流+心肌肽素
10
112±7.7***
88.2±4.0*
50
94.7±4.0***
90.1±5.1*
, 百拇医药 100
83.8±5.3***
84.4±4.9*
缺血-再灌流+维拉帕米
1
89.3±3.6***
81.4±3.5***
与假手术组比较：△△△P<0.01
与缺血-再灌流组比较：*P>0.05 ***P<0.01
, 百拇医药
图2 心肌肽素剂量与离体大鼠左室 前壁心肌
MDA含量的关系
果发现损伤组心脏室颤发生率较假手术组显著提高，同时，心肌酶活性及MDA含量也发生显 著改变。
动物药是中药的一个重要组成部分[8]，利用生化技术提取脏器中有效成分，应用于临床治疗已有报道[9]。心肌肽素为从乳猪 心脏中提取的活性多肽，我们发现其对离体心脏缺血-再灌流损伤导致的室颤有明显的预防 作用。在缺血-再灌流后心肌脂质过氧化反应加强，MDA含量增加，心肌肽素可剂量依赖性 地降低MDA含量，减轻自由基损伤。损伤组心肌出现变性、坏死，使膜功能受损，细胞内CPK 外逸，致心肌CPK活性显著下降[10]，心肌肽素可显著提高心肌CPK活性，提示其可 减轻心肌损伤。心肌缺血后细胞内无氧代谢加强，诱导产生LDH增加[10]，心肌肽 素能剂量依赖性地降低心肌前壁LDH活性，改善缺血-再灌流心肌能量代谢。心肌MDA、CPK 及LDH的变化均以缺血部位心肌为甚，提示缺血损伤是缺血-再灌流损伤的基础。钙拮抗剂 预防性给药对缺血-再灌流损伤也有明显的保护作用。
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上述结果提示心肌肽素对大鼠缺血-再灌流损伤离体心脏有保护作用，可能与其降低心肌MD A含量及LDH活性，提高CPK活性有关。至于其与细胞内Ca2+的关系等，将另文报道。■
“九.五”国家重点科技攻关项目(No.96-902-01-04)
万华印，男，1989年毕业于第一军医大学医疗系，获医学学士；1994年毕业于该校药理专业，获医学硕士。现为中国人民解放军第458医院主治医师。主要研究方向：心血管药理及临床，生化新药的基础研究与开发。现已发表论文12篇，参与编写著作1部，获军队科技进步奖3项。
参考文献
1，Jennings R B,et al.Arch Pathol,1960,70(7) :68
, 百拇医药
2，Hammerman C,et al.Clin Perinatol,1998,25(3 ):757
3，Kalfin R,et al.J Pharmacol Exp Ther,1994 2 68(2):952
4，Shekher A,et al.Methods Find Exp Clin Pharm acol,1997,19(4):223
5，万华印，等.中草药，1996，27(2)：103
6，Du G,et al.Free Radic Biol Med,1998,25(9) :1066
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(收稿日期：1999-05-18), 百拇医药