一种提高新生大鼠原代培养心肌细胞收获率的方法
作者：龚素珍 潘敬运
单位：龚素珍(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；潘敬运(中山医科大学生理教研室，广州 510089)
关键词：心肌细胞；原代培养；收获率；免疫组化
广州医学院学报000122 中图分类号 R331.36 文献标识码：A 文章编号:1008-1836(2000)01-0069-04
由于培养的心肌细胞去掉了在体内心肌细胞的各种影响限制因素，作为实验工具具有简便、精确、重复性好等优点，现已广泛用于电生理、受体、药理及毒理、分子生物学等研究领域中。我们在新生大鼠心肌细胞原代培养的实验中，改进了以往心肌细胞制备方法，大大提高了心肌细胞的获得率，有效地提高了实验的成功率。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物 出生后1～3天的SD大鼠，雌雄不限。
1.2 培养液、试剂
1.2.1 培养液 含高糖和丙酮酸钠的DMEM干粉(Sigma)，由双蒸去离子水配置液体，正压过滤除菌，pH7.2～7.4，4℃保存。临用前，加入10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
1.2.2 D-Hank′s液组成(mmol/L):NaCl 137,KCl 5.4,NaH2PO4 0.37,KH2PO4 0.34,NaHCO3 4.2,用双蒸去离子水配制，pH7.2，高压蒸气灭菌，4℃保存。
1.2.3 D-Hank′s酶消化液 胰蛋白酶(Difco)，用D-Hank′s液配制成0.25%的液体，经正压过滤除菌，pH7.2。于-20℃保存。
, 百拇医药
1.2.4 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,Brdu)SERVA公司产品，用双蒸去离子水配制成10mmol/L储备液，过滤除菌，于-20℃保存。
1.3 心肌细胞分离和培养
取1～3天龄的SD大鼠，在无菌条件下开胸取出心脏，立即置入4℃ D-Hank′s液中剪取心室肌，充分洗净残血，剪成约1mm3大小的碎块，弃去D-Hank′s液，然而将碎块小心吸入25ml的三角烧瓶中，加入0.8%胰蛋白酶8ml左右，用盐水瓶胶塞盖紧瓶口，置37℃恒温干燥箱中，在磁力搅拌器上消化10min，再弃去首次的消化悬液(主要含血细胞)，加入胰蛋白酶消化液消化10min,如此重复，直至组织块消失。分别收集每次消化悬液，加等量含4%小牛血清DMEM培养液终止消化，离心(2000rpm/min，5min)，弃上清，再加入含4%小牛血清DMEM培养液，用吸管轻轻吹散沉淀细胞，同条件下再次离心，将每次离心后沉淀细胞合并，用含10%小牛血清DMEM培养液制成细胞悬液，以一定的心肌细胞密度分种于25ml玻璃培养瓶或24孔培养板中，置37℃、5%CO2培养箱内，根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁1h，分别获得心肌细胞和成纤维细胞。培养前48h，在心肌细胞的培养液中加入Brdu 0.1mmol/L,以抑制成纤维细胞的增殖。在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况并摄影记录。
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1.4 心脏成纤维细胞培养
差速贴壁的成纤维细胞生长至融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，接种于50ml的玻璃培养瓶至亚融合状态。实验用第2～3代心脏成纤维细胞。
1.5 免疫细胞化学方法
将浓度适中的心肌细胞和成纤维细胞分别接种于玻璃培养皿中，内有事先用1‰gelatin处理过的盖玻片。待细胞生长48h，状态良好时使用。实验时先将培养液倒去，用PBS液反复冲洗贴附有细胞的盖玻片，继用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PBS，0.1M，pH7.4)固定15min。盖玻片经PBS液冲洗后，先入1%牛血清白蛋白孵育1h(室温)；再入鼠抗a-actin(Sigma,1∶600)，震荡孵育36h(4℃)；然后入生物素标记的抗鼠IgG(华美生物制品公司，1∶200)及ABC液(Vector,1∶100)中孵育1h及40min(室温)。每次孵育后均用PBS液充分冲洗，最后切片入0.05%DBA和0.01%H2O2的反应液中显色，然后脱水、透明和封片。
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2 实验结果
采用0.08%胰蛋白酶消化，37℃恒温低速磁力搅拌及短时间反复多次消化心室组织，实验显示心肌细胞的收获率显著提高，细胞分散，无明显的组织碎块或细胞碎片，且整个实验时间缩短。苔酚蓝染色显示，成活细胞数在95%以上。
在倒置相差显微镜下观察，新生SD大鼠心室细胞(心肌细胞和成纤维细胞)，初呈圆形(图1)；数h后心肌细胞贴壁生长，逐渐伸展为短柱状及棒状；24h少许心肌细胞搏动，细胞展平呈不规则形；48h后心肌细胞呈自聚集现象(图2)，且进行同步搏动，在含10%小牛血清(Gibco)DMEM培养液中，搏动频率为70～150次/min,且同一批细胞的搏动频率一致。
图1 刚分离的圆形心肌细胞和成纤维细胞(×150)
, 百拇医药
图2 培养3天的心肌细胞(×150)
传代培养的初始成纤维细胞境界清楚，里梭形，随着细胞增生，渐呈亚融合(图3)及融合状态(图4)。
图3 培养7天的亚融合状态的成纤维细胞(×200)
图4 培养9天的融合状态的成纤维细胞(×200) 培养72小时，a-actin免疫组化显示，培养的心肌细胞里阳性反应(图5)，而心室成纤维细胞呈阴性反应(图6)，表明这两种细胞未相互夹杂，达到实验要求的纯度。
图5 a-actin免疫组化阳性心肌细胞(×150)
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图6 a-actin免疫组化阴性成纤维细胞(×150)3 讨论
尽管培养条件可以为心肌细胞提供有利的环境，使其很快恢复在分离过程中所受到的损伤，但许多实验显示体外培养心肌细胞的状态与分离方法有重要的关系。用吸管反复吹打的机械分离方法，吹打力度不易控制，极易损伤心肌细胞，组织碎块及细胞碎片较多，成活细胞率较低；高浓度、短时间胰蛋白酶消化时，心肌组织中细胞和间质均受到影响，极易使消化组织成为透明粘稠状液体，细胞消化过度。本文采用低浓度胰蛋白酶、恒温低速磁力搅拌及短时间反复多次消化方法分离新生大鼠心肌细胞，结果显示心肌细胞收获率高，细胞状态良好，成活细胞数在95%以上，且心肌细胞同步搏动出现早。
体外培养心肌细胞的成长状态与细胞接种的密度也有很大的关系。有学者报道心肌细胞的种植密度不仅影响细胞的肥大反应和分离细胞的分化表型特征，而且影响心肌细胞的生存时间[1]。心肌细胞之间的联系可促进细胞自发活动的形成。如心肌细胞接种密度太低，细胞间难形成细胞间的联系，细胞生长不良，细胞难于生存，但细胞密度太大，细胞成簇聚集，许多细胞难于贴壁生长，大量的细胞在更换培养液时被丢失。本实验的心肌细胞接种密度为4x105～3×106ml，细胞生长良好、同簇细胞同步搏动时间早，搏动频率为70～150次/min。
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心脏中，75%以上的细胞为成纤维细胞，如培养时间较长(1周后)，成纤维细胞迅速增殖，占据心肌细胞之间的空间，限制心肌细胞的活动，甚至分泌生物活性物质影响心肌细胞的形态结构和生理功能[2～4]，从而难于解释实验结果，因此本实验加入Brdu以抑制成纤维细胞的增殖。且同时强调心肌细胞应于培养72h内加以实验处理。
本实验采用心肌细胞特异性a-actin抗体进行免疫组化染色心肌细胞和成纤维细胞，结果显示心肌细胞和成纤维细胞相对较纯，能应用于实验研究。
作者简介：龚素珍，女(1965-)，助理研究员，硕士学位。研究方向：心血管生理
参考文献
[1]Clark WA,Decker ML,Behnke-Barclay M,et al.Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocyte hypertrophy and survival in long-term primary culture[J].J Mol Cell Cardiol,1998;30:139～42
, http://www.100md.com
[2]Harada M,Itoh H,Nakagawa O,et al.Significance of ventricular myocytes and nonmyocytes interaction during cardiocyte hypertrophy[J].Circulation,1997;96:3737～39
[3]Guo WN,Kamiya K,Kada KJ,et al.Regulation of cardiac kv1.5 K+ channel expression by cardiac fibroblasts and mechanical load in cultured newborn rat ventricular myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol,1998;30:157～59
[4]Suzuki T,Tsuruda A,Katoh SH,et al.Purification of endothelin from a conditioned medium of cardiac fibroblastic cells using beating rat assay of myocytes cultured in a serum-free medium[J].J Mol Cell cardiol,1997;29:2087～91
(收稿：1999-11-05), 百拇医药
单位：龚素珍(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；潘敬运(中山医科大学生理教研室，广州 510089)
关键词：心肌细胞；原代培养；收获率；免疫组化
广州医学院学报000122 中图分类号 R331.36 文献标识码：A 文章编号:1008-1836(2000)01-0069-04
由于培养的心肌细胞去掉了在体内心肌细胞的各种影响限制因素，作为实验工具具有简便、精确、重复性好等优点，现已广泛用于电生理、受体、药理及毒理、分子生物学等研究领域中。我们在新生大鼠心肌细胞原代培养的实验中，改进了以往心肌细胞制备方法，大大提高了心肌细胞的获得率，有效地提高了实验的成功率。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物 出生后1～3天的SD大鼠，雌雄不限。
1.2 培养液、试剂
1.2.1 培养液 含高糖和丙酮酸钠的DMEM干粉(Sigma)，由双蒸去离子水配置液体，正压过滤除菌，pH7.2～7.4，4℃保存。临用前，加入10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
1.2.2 D-Hank′s液组成(mmol/L):NaCl 137,KCl 5.4,NaH2PO4 0.37,KH2PO4 0.34,NaHCO3 4.2,用双蒸去离子水配制，pH7.2，高压蒸气灭菌，4℃保存。
1.2.3 D-Hank′s酶消化液 胰蛋白酶(Difco)，用D-Hank′s液配制成0.25%的液体，经正压过滤除菌，pH7.2。于-20℃保存。
, 百拇医药
1.2.4 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,Brdu)SERVA公司产品，用双蒸去离子水配制成10mmol/L储备液，过滤除菌，于-20℃保存。
1.3 心肌细胞分离和培养
取1～3天龄的SD大鼠，在无菌条件下开胸取出心脏，立即置入4℃ D-Hank′s液中剪取心室肌，充分洗净残血，剪成约1mm3大小的碎块，弃去D-Hank′s液，然而将碎块小心吸入25ml的三角烧瓶中，加入0.8%胰蛋白酶8ml左右，用盐水瓶胶塞盖紧瓶口，置37℃恒温干燥箱中，在磁力搅拌器上消化10min，再弃去首次的消化悬液(主要含血细胞)，加入胰蛋白酶消化液消化10min,如此重复，直至组织块消失。分别收集每次消化悬液，加等量含4%小牛血清DMEM培养液终止消化，离心(2000rpm/min，5min)，弃上清，再加入含4%小牛血清DMEM培养液，用吸管轻轻吹散沉淀细胞，同条件下再次离心，将每次离心后沉淀细胞合并，用含10%小牛血清DMEM培养液制成细胞悬液，以一定的心肌细胞密度分种于25ml玻璃培养瓶或24孔培养板中，置37℃、5%CO2培养箱内，根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁1h，分别获得心肌细胞和成纤维细胞。培养前48h，在心肌细胞的培养液中加入Brdu 0.1mmol/L,以抑制成纤维细胞的增殖。在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况并摄影记录。
, http://www.100md.com
1.4 心脏成纤维细胞培养
差速贴壁的成纤维细胞生长至融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，接种于50ml的玻璃培养瓶至亚融合状态。实验用第2～3代心脏成纤维细胞。
1.5 免疫细胞化学方法
将浓度适中的心肌细胞和成纤维细胞分别接种于玻璃培养皿中，内有事先用1‰gelatin处理过的盖玻片。待细胞生长48h，状态良好时使用。实验时先将培养液倒去，用PBS液反复冲洗贴附有细胞的盖玻片，继用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PBS，0.1M，pH7.4)固定15min。盖玻片经PBS液冲洗后，先入1%牛血清白蛋白孵育1h(室温)；再入鼠抗a-actin(Sigma,1∶600)，震荡孵育36h(4℃)；然后入生物素标记的抗鼠IgG(华美生物制品公司，1∶200)及ABC液(Vector,1∶100)中孵育1h及40min(室温)。每次孵育后均用PBS液充分冲洗，最后切片入0.05%DBA和0.01%H2O2的反应液中显色，然后脱水、透明和封片。
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2 实验结果
采用0.08%胰蛋白酶消化，37℃恒温低速磁力搅拌及短时间反复多次消化心室组织，实验显示心肌细胞的收获率显著提高，细胞分散，无明显的组织碎块或细胞碎片，且整个实验时间缩短。苔酚蓝染色显示，成活细胞数在95%以上。
在倒置相差显微镜下观察，新生SD大鼠心室细胞(心肌细胞和成纤维细胞)，初呈圆形(图1)；数h后心肌细胞贴壁生长，逐渐伸展为短柱状及棒状；24h少许心肌细胞搏动，细胞展平呈不规则形；48h后心肌细胞呈自聚集现象(图2)，且进行同步搏动，在含10%小牛血清(Gibco)DMEM培养液中，搏动频率为70～150次/min,且同一批细胞的搏动频率一致。
图1 刚分离的圆形心肌细胞和成纤维细胞(×150)
, 百拇医药
图2 培养3天的心肌细胞(×150)
传代培养的初始成纤维细胞境界清楚，里梭形，随着细胞增生，渐呈亚融合(图3)及融合状态(图4)。
图3 培养7天的亚融合状态的成纤维细胞(×200)
图4 培养9天的融合状态的成纤维细胞(×200) 培养72小时，a-actin免疫组化显示，培养的心肌细胞里阳性反应(图5)，而心室成纤维细胞呈阴性反应(图6)，表明这两种细胞未相互夹杂，达到实验要求的纯度。
图5 a-actin免疫组化阳性心肌细胞(×150)
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图6 a-actin免疫组化阴性成纤维细胞(×150)3 讨论
尽管培养条件可以为心肌细胞提供有利的环境，使其很快恢复在分离过程中所受到的损伤，但许多实验显示体外培养心肌细胞的状态与分离方法有重要的关系。用吸管反复吹打的机械分离方法，吹打力度不易控制，极易损伤心肌细胞，组织碎块及细胞碎片较多，成活细胞率较低；高浓度、短时间胰蛋白酶消化时，心肌组织中细胞和间质均受到影响，极易使消化组织成为透明粘稠状液体，细胞消化过度。本文采用低浓度胰蛋白酶、恒温低速磁力搅拌及短时间反复多次消化方法分离新生大鼠心肌细胞，结果显示心肌细胞收获率高，细胞状态良好，成活细胞数在95%以上，且心肌细胞同步搏动出现早。
体外培养心肌细胞的成长状态与细胞接种的密度也有很大的关系。有学者报道心肌细胞的种植密度不仅影响细胞的肥大反应和分离细胞的分化表型特征，而且影响心肌细胞的生存时间[1]。心肌细胞之间的联系可促进细胞自发活动的形成。如心肌细胞接种密度太低，细胞间难形成细胞间的联系，细胞生长不良，细胞难于生存，但细胞密度太大，细胞成簇聚集，许多细胞难于贴壁生长，大量的细胞在更换培养液时被丢失。本实验的心肌细胞接种密度为4x105～3×106ml，细胞生长良好、同簇细胞同步搏动时间早，搏动频率为70～150次/min。
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心脏中，75%以上的细胞为成纤维细胞，如培养时间较长(1周后)，成纤维细胞迅速增殖，占据心肌细胞之间的空间，限制心肌细胞的活动，甚至分泌生物活性物质影响心肌细胞的形态结构和生理功能[2～4]，从而难于解释实验结果，因此本实验加入Brdu以抑制成纤维细胞的增殖。且同时强调心肌细胞应于培养72h内加以实验处理。
本实验采用心肌细胞特异性a-actin抗体进行免疫组化染色心肌细胞和成纤维细胞，结果显示心肌细胞和成纤维细胞相对较纯，能应用于实验研究。
作者简介：龚素珍，女(1965-)，助理研究员，硕士学位。研究方向：心血管生理
参考文献
[1]Clark WA,Decker ML,Behnke-Barclay M,et al.Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocyte hypertrophy and survival in long-term primary culture[J].J Mol Cell Cardiol,1998;30:139～42
, http://www.100md.com
[2]Harada M,Itoh H,Nakagawa O,et al.Significance of ventricular myocytes and nonmyocytes interaction during cardiocyte hypertrophy[J].Circulation,1997;96:3737～39
[3]Guo WN,Kamiya K,Kada KJ,et al.Regulation of cardiac kv1.5 K+ channel expression by cardiac fibroblasts and mechanical load in cultured newborn rat ventricular myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol,1998;30:157～59
[4]Suzuki T,Tsuruda A,Katoh SH,et al.Purification of endothelin from a conditioned medium of cardiac fibroblastic cells using beating rat assay of myocytes cultured in a serum-free medium[J].J Mol Cell cardiol,1997;29:2087～91
(收稿：1999-11-05), 百拇医药