整合素β1与胶质瘤侵袭性的相关性研究
作者：郭衍 章翔 费舟 吴景文 高大宽 荆俊杰 李侠 屈延
单位：郭衍 章翔 费舟 吴景文 高大宽 荆俊杰 李侠 屈延(第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西西安71 0032)
关键词：整合素；胶质瘤细胞；胶原蛋白
细胞与分子免疫学杂志000216
摘要：目的 探讨整合素β1在人脑胶质瘤细胞粘附和侵袭过程中的作用。方法 用免疫组化SABC法，检测整合素β1在人脑胶质瘤细胞SHG44中的表达；用细胞粘附实验检测其在SHG44细胞粘附中的作用。结果 整合素β1可在人脑胶质瘤细胞SHG44中表达，抗整合素β1抗体可明显抑制人脑胶质瘤细胞SHG44对胶原蛋白I和胶原蛋白IV细胞外基质蛋白的粘附。结论 整合素β1在人脑胶质瘤细胞的粘附和侵袭过程中必不可少，抑制其在人脑胶质瘤细胞中的表达,有助于阻止胶质瘤细胞的侵袭性 生长。
, 百拇医药
中图号：R73.264 文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0139-03
Correlationship between the integrinβ 1 subunit and invasion of human gliomas
GUO Yan ZHANG Xiang FEI Zhou WU Jing- wen GAO Da- kuan JIN Jun- jie LI Xia,QU Yan
(Institute of Neurosurgery of PLA, Fourth Millitery Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China)
Abstract: Aim To explore the effects of integrin β 1 on the mechanism of adhesion and invasion of glioma cell line.Methods The integrin β-1 subunit expression in glioma cell line SHG44 was examined with SABC immunohistochemical staining. The role of integrin β 1 in the adhesion of glioma cell SHG44 to collagen I and IV was
, 百拇医药
observed with cell adhesion test. Results There was the integrin expression in glioma cell line SHG44; Anti- integrin β-1 antibody could inhibit the adhesion of glioma cell SHG44 to collagens I and IV. Conclusion Integrinβ 1 subunit plays an important role in the adhesion and invasion of glioma cells. The inhibition of integrin β 1 subunit expression in glioma cells may help to prevent the invasive growth of glioma cells.
Keywords: integrin β-1 subunit; glioma cell; collagen
, http://www.100md.com
脑胶质瘤细胞的侵袭性生长和复发是临床治疗胶质瘤失败的主要原因。随着对肿瘤侵袭性研究的深入，近年来发现，粘附分子家族中的整合素参与了脑胶质瘤细胞的粘附和迁移等多个环节，通过介导与细胞外基质蛋白、细胞之间的粘附和信号转导等作用，直接和间接地影响肿瘤细胞的侵袭性[1]。我们检测了整合素β1在人脑胶质瘤细胞SHG44中的表达,探讨了其在该细胞粘附和侵袭过程中的作用及临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料 人脑胶质瘤细胞系SHG-44细胞引自苏州医学院第二附属医院脑肿瘤研究室，培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640中，置于50mL/LCO2、37℃孵箱，每隔48h换液1次，待细胞生长成单层时用于试验。一抗为羊抗人整合素β1mAb购于SantaCrux公司，二抗为生物素标记的兔抗羊抗体，SABC试剂盒购于博士德 公司。
1.2 方法
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1.2.1 整合素的表达 取对数生长期人脑胶质瘤细胞SHG44,以2.5g/L胰酶消化传代后，加至6孔板中，经酸和乙醇处理的盖玻片上。待SHG44细胞在盖玻片表面贴附并展开时，置37℃CO2孵箱孵育8h后，加40mL/L多聚甲醛4℃固定30min。以PBS洗后，加3mL/L过氧化氢处理10min；再以PBS洗后，依次滴加正常兔血清(1∶10)(室温30min)、羊抗人整合素β1mAb(1∶100)(4℃湿盒过夜、PBS洗)、生物素标记的兔抗羊抗体(1∶200)(37℃孵育30min，PBS洗)和ABC复合物。PBS洗后，以DAB显色、苏木素衬染，然后常规脱水、透明、封片，镜检观察结果，呈棕黄色者判为阳性。
1.2.2 粘附分析 ①基质包埋：96孔板中包埋用NaHCO3(pH8.3)稀释的20mg/L基质蛋白(胶原蛋白I和胶原蛋白IV)100μL/孔；标准孔中包埋10g/LBSA-PBS。②包埋条件：4℃过夜、倾去，加入10g/LBSA-PBS液(100μL/孔)，置37℃50mL/LCO2孵箱中30min，以封闭非特异性位点。用PBS200μL冲洗两遍。将对照组及H2O2处理组的细胞消化，以RPMI1640洗两遍，再用10g/LBSA-RPMI1640(无血清)重悬，调整细胞密度为1×108/L，加入包埋板中(10 0μL/孔)，观察细胞贴壁情况。
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1.2.3 粘附抑制试验 取1×108/LSHG44细胞1mL，加抗整合素β1mAb10μL(2mg/L)(对照组加山羊血清IgG)室温作用30min，加入包埋板中(100μL/孔)。置37℃50mL/LCO2孵箱中120min。以PBS(200μL/孔)冲洗3遍(冲去未粘附的细胞)后，贴壁细胞用MTT法测定，检测胶质瘤细胞的粘附情况及抗整合素β1mAb抑制粘附的能力， 每组重复4次。
2 结果
2.1 整合素β1的表达 免疫组化染色法检查的结果表明，人胶质瘤细胞SHG44表面有成簇分布的棕黄色颗粒，少数位于胞浆中；阴性对照未见细胞膜和胞浆着色(图1)。
图1 整合素β1在人胶质瘤细胞SHG44中的表达
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Fig1 Intergrin β1 expression in the human glioma cell SHG44(SABC×400)
A:Positive dyeing;B:No dyeing(control).
2.2 细胞-基质粘附分析及粘附抑制试验 与BSA包埋孔相比较，SHG44细胞在胶原蛋白I和胶原蛋白IV包埋孔中的粘附能力明显提高。抗体阻断试验的结果显示，SHG44细胞被抗整合素β1
mAb作用后，其与基质胶原蛋白I，IV的粘附力显著降低(图2)。
图2 胶质瘤细胞-基质粘附的分析
Fig2 The adehesion between glioma cells and extracelluar matrix
, http://www.100md.com
The anti-integrin β1 antibody inhibits adhesion
of glioma cell SHG44 to collagens I and IV.
Glioma cells attachto collagens I(A)and IV( B).
图3 粘附于胶原蛋白I,IV的胶质瘤细胞SHG44的形态
Fig3 Morphological properties of the glioma cell SHG44
adhering to collagens I and IV(×250)
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3 讨论
整合素是近年发现的一个膜受体家族。该家族中的粘附分子为由α，β两个亚基以非共价键结合的跨膜糖蛋白，主要介导细胞与基质、细胞与细胞之间的粘附。整合素与胶质瘤细胞侵袭性生长的关系，主要指胶质瘤对周围组织的浸润性生长。目前，已知胶质瘤的浸润性生长与整合素分子的表达及其在细胞表面分布的改变有关。整合素分子在胶质瘤细胞上表达的变化可为表达数量的减少或缺失，也可为表达升高的不一致性，可能与整合素分子的不同作用有关，如同一种整合素分子可以在粘附和迁移两个不同的过程中发挥作用[2]。
整合素β1包括：胞膜外区、胞浆区和穿膜区3部分，与α1，α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8，α9和αv组合构成整合素分子。其配体为多种细胞外基质成分，包括I，IV型胶原
蛋白(CA)、纤维粘连素(FN)和层粘连蛋白(LN)等。Paulus等[3]对整合素的α和β亚基在正常脑组织和脑肿瘤组织中的表达进行了研究，发现α2，α3，α6和β1在正常脑组织中表达，β4亚基在大部分的间质组织的临界处表达；而α4，α5，αV，αL，αM，αX，β2和β3亚基在正常脑组织中不表达。α3和β1在恶性胶质瘤细胞中的表达增高，β4表达缺失，整合素α2β1，α3β1，α5β1和α6β1等在胶质瘤组织中表达，通过与细胞外基质相互作用，而参与胶质瘤细胞的侵袭过程[4,5]。整合素α3β1能与LN相结合，促进U251，A172和T98G胶质瘤细胞的侵袭，但给予一定剂量的抗β1抗体可使胶质瘤细胞在LN基质中的侵袭力下降[6]。在U-251/lacZ和ANI/lacZ胶质瘤细胞的粘附实验中发现，抗整合素β1抗体可明显抑制胶质瘤细胞对胶原蛋白IV的粘附，表明整合素β1与胶质瘤细胞的侵袭性相关[7]。
, 百拇医药
有关整合素β1与胶质瘤细胞侵袭性的研究国内尚未见报道，我们通过细胞爬片和免疫组化SABC法，对人脑胶质瘤细胞SHG44进行了检测。发现SHG44细胞膜表面表达整合素β1，抗整合素β1抗体可明显抑制SHG44胶质瘤细胞对胶原蛋白I，IV的粘附。胶原蛋白I，IV是细胞外基质的重要组成部分，胶质瘤细胞的浸润性生长，首先需要通过对细胞外基质的粘附来实现。本实验表明，抗整合素β1抗体可明显抑制SHG44胶质瘤细胞对胶原蛋白I，IV的粘附，提示整合素β1在胶质瘤细胞与细胞外基质的粘附过程中是必不可少的，即参与了胶质瘤细胞的浸润性生长。通过抑制整合素β1在胶质瘤细胞的表达或阻断其与细胞外基质蛋白的结合，可抑制胶质瘤细胞的浸润性生长，而有 助于胶质瘤的治疗。
参考文献：
[1] Hynes RO. Integrins: versatility, modulation and signaling in cell adhesion[J]. Cell, 1992;69(1):11- 25.
, http://www.100md.com
[2] Uhm JH, Gladson CL, Rao JS, et al. The role of integrins in the malignant phenotype of gliomas[J]. Front Biosci,1999;4:D188- 199.
[3] Paulus W, Baur I, Schuppan D, et al. Characterization of integrin receptors in normal and neoplastic human brain[J]. Am J Pathol, 1993;143(1):154- 163.
[4] Tonn JC, Wunderlich S, Kerkau S, et al. Invasive behaviour of human gliomas is mediated by interindividually different integrin patterns[J]. Anticancer Res, 1998; 18(4A):2599- 2605.
, 百拇医药
[5] Goldbrunner RH, Haugland HK, Klein CE, et al. ECM dependent and integrin mediated tumor cell migration of human glioma and melanoma cell lines under serum- free conditions[J]. Anticancer Res， 1996; 16(6B):3679-
3687.
[6] Fukushima Y, Ohnishi T, Arita N, et al. Integrin alpha 3 beta1- mediated interaction with laminin- 5 stimulates adhesion, migration and invasion of malignant glioma cells[J]. Int J Cancer, 1998;76(1):63- 72.
[7] Tysnes BB, Larsen LF, Ness GO, et al. Stimulation of glioma cell migration by laminin and inhibition by anti-alpha 3 and anti- beta1 integrin antibodies[J]. Int J Cancer, 1996; 67(6):777- 784., 百拇医药
单位：郭衍 章翔 费舟 吴景文 高大宽 荆俊杰 李侠 屈延(第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西西安71 0032)
关键词：整合素；胶质瘤细胞；胶原蛋白
细胞与分子免疫学杂志000216
摘要：目的 探讨整合素β1在人脑胶质瘤细胞粘附和侵袭过程中的作用。方法 用免疫组化SABC法，检测整合素β1在人脑胶质瘤细胞SHG44中的表达；用细胞粘附实验检测其在SHG44细胞粘附中的作用。结果 整合素β1可在人脑胶质瘤细胞SHG44中表达，抗整合素β1抗体可明显抑制人脑胶质瘤细胞SHG44对胶原蛋白I和胶原蛋白IV细胞外基质蛋白的粘附。结论 整合素β1在人脑胶质瘤细胞的粘附和侵袭过程中必不可少，抑制其在人脑胶质瘤细胞中的表达,有助于阻止胶质瘤细胞的侵袭性 生长。
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中图号：R73.264 文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0139-03
Correlationship between the integrinβ 1 subunit and invasion of human gliomas
GUO Yan ZHANG Xiang FEI Zhou WU Jing- wen GAO Da- kuan JIN Jun- jie LI Xia,QU Yan
(Institute of Neurosurgery of PLA, Fourth Millitery Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China)
Abstract: Aim To explore the effects of integrin β 1 on the mechanism of adhesion and invasion of glioma cell line.Methods The integrin β-1 subunit expression in glioma cell line SHG44 was examined with SABC immunohistochemical staining. The role of integrin β 1 in the adhesion of glioma cell SHG44 to collagen I and IV was
, 百拇医药
observed with cell adhesion test. Results There was the integrin expression in glioma cell line SHG44; Anti- integrin β-1 antibody could inhibit the adhesion of glioma cell SHG44 to collagens I and IV. Conclusion Integrinβ 1 subunit plays an important role in the adhesion and invasion of glioma cells. The inhibition of integrin β 1 subunit expression in glioma cells may help to prevent the invasive growth of glioma cells.
Keywords: integrin β-1 subunit; glioma cell; collagen
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脑胶质瘤细胞的侵袭性生长和复发是临床治疗胶质瘤失败的主要原因。随着对肿瘤侵袭性研究的深入，近年来发现，粘附分子家族中的整合素参与了脑胶质瘤细胞的粘附和迁移等多个环节，通过介导与细胞外基质蛋白、细胞之间的粘附和信号转导等作用，直接和间接地影响肿瘤细胞的侵袭性[1]。我们检测了整合素β1在人脑胶质瘤细胞SHG44中的表达,探讨了其在该细胞粘附和侵袭过程中的作用及临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料 人脑胶质瘤细胞系SHG-44细胞引自苏州医学院第二附属医院脑肿瘤研究室，培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640中，置于50mL/LCO2、37℃孵箱，每隔48h换液1次，待细胞生长成单层时用于试验。一抗为羊抗人整合素β1mAb购于SantaCrux公司，二抗为生物素标记的兔抗羊抗体，SABC试剂盒购于博士德 公司。
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 整合素的表达 取对数生长期人脑胶质瘤细胞SHG44,以2.5g/L胰酶消化传代后，加至6孔板中，经酸和乙醇处理的盖玻片上。待SHG44细胞在盖玻片表面贴附并展开时，置37℃CO2孵箱孵育8h后，加40mL/L多聚甲醛4℃固定30min。以PBS洗后，加3mL/L过氧化氢处理10min；再以PBS洗后，依次滴加正常兔血清(1∶10)(室温30min)、羊抗人整合素β1mAb(1∶100)(4℃湿盒过夜、PBS洗)、生物素标记的兔抗羊抗体(1∶200)(37℃孵育30min，PBS洗)和ABC复合物。PBS洗后，以DAB显色、苏木素衬染，然后常规脱水、透明、封片，镜检观察结果，呈棕黄色者判为阳性。
1.2.2 粘附分析 ①基质包埋：96孔板中包埋用NaHCO3(pH8.3)稀释的20mg/L基质蛋白(胶原蛋白I和胶原蛋白IV)100μL/孔；标准孔中包埋10g/LBSA-PBS。②包埋条件：4℃过夜、倾去，加入10g/LBSA-PBS液(100μL/孔)，置37℃50mL/LCO2孵箱中30min，以封闭非特异性位点。用PBS200μL冲洗两遍。将对照组及H2O2处理组的细胞消化，以RPMI1640洗两遍，再用10g/LBSA-RPMI1640(无血清)重悬，调整细胞密度为1×108/L，加入包埋板中(10 0μL/孔)，观察细胞贴壁情况。
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1.2.3 粘附抑制试验 取1×108/LSHG44细胞1mL，加抗整合素β1mAb10μL(2mg/L)(对照组加山羊血清IgG)室温作用30min，加入包埋板中(100μL/孔)。置37℃50mL/LCO2孵箱中120min。以PBS(200μL/孔)冲洗3遍(冲去未粘附的细胞)后，贴壁细胞用MTT法测定，检测胶质瘤细胞的粘附情况及抗整合素β1mAb抑制粘附的能力， 每组重复4次。
2 结果
2.1 整合素β1的表达 免疫组化染色法检查的结果表明，人胶质瘤细胞SHG44表面有成簇分布的棕黄色颗粒，少数位于胞浆中；阴性对照未见细胞膜和胞浆着色(图1)。
图1 整合素β1在人胶质瘤细胞SHG44中的表达
, http://www.100md.com
Fig1 Intergrin β1 expression in the human glioma cell SHG44(SABC×400)
A:Positive dyeing;B:No dyeing(control).
2.2 细胞-基质粘附分析及粘附抑制试验 与BSA包埋孔相比较，SHG44细胞在胶原蛋白I和胶原蛋白IV包埋孔中的粘附能力明显提高。抗体阻断试验的结果显示，SHG44细胞被抗整合素β1
mAb作用后，其与基质胶原蛋白I，IV的粘附力显著降低(图2)。
图2 胶质瘤细胞-基质粘附的分析
Fig2 The adehesion between glioma cells and extracelluar matrix
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The anti-integrin β1 antibody inhibits adhesion
of glioma cell SHG44 to collagens I and IV.
Glioma cells attachto collagens I(A)and IV( B).
图3 粘附于胶原蛋白I,IV的胶质瘤细胞SHG44的形态
Fig3 Morphological properties of the glioma cell SHG44
adhering to collagens I and IV(×250)
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3 讨论
整合素是近年发现的一个膜受体家族。该家族中的粘附分子为由α，β两个亚基以非共价键结合的跨膜糖蛋白，主要介导细胞与基质、细胞与细胞之间的粘附。整合素与胶质瘤细胞侵袭性生长的关系，主要指胶质瘤对周围组织的浸润性生长。目前，已知胶质瘤的浸润性生长与整合素分子的表达及其在细胞表面分布的改变有关。整合素分子在胶质瘤细胞上表达的变化可为表达数量的减少或缺失，也可为表达升高的不一致性，可能与整合素分子的不同作用有关，如同一种整合素分子可以在粘附和迁移两个不同的过程中发挥作用[2]。
整合素β1包括：胞膜外区、胞浆区和穿膜区3部分，与α1，α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8，α9和αv组合构成整合素分子。其配体为多种细胞外基质成分，包括I，IV型胶原
蛋白(CA)、纤维粘连素(FN)和层粘连蛋白(LN)等。Paulus等[3]对整合素的α和β亚基在正常脑组织和脑肿瘤组织中的表达进行了研究，发现α2，α3，α6和β1在正常脑组织中表达，β4亚基在大部分的间质组织的临界处表达；而α4，α5，αV，αL，αM，αX，β2和β3亚基在正常脑组织中不表达。α3和β1在恶性胶质瘤细胞中的表达增高，β4表达缺失，整合素α2β1，α3β1，α5β1和α6β1等在胶质瘤组织中表达，通过与细胞外基质相互作用，而参与胶质瘤细胞的侵袭过程[4,5]。整合素α3β1能与LN相结合，促进U251，A172和T98G胶质瘤细胞的侵袭，但给予一定剂量的抗β1抗体可使胶质瘤细胞在LN基质中的侵袭力下降[6]。在U-251/lacZ和ANI/lacZ胶质瘤细胞的粘附实验中发现，抗整合素β1抗体可明显抑制胶质瘤细胞对胶原蛋白IV的粘附，表明整合素β1与胶质瘤细胞的侵袭性相关[7]。
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有关整合素β1与胶质瘤细胞侵袭性的研究国内尚未见报道，我们通过细胞爬片和免疫组化SABC法，对人脑胶质瘤细胞SHG44进行了检测。发现SHG44细胞膜表面表达整合素β1，抗整合素β1抗体可明显抑制SHG44胶质瘤细胞对胶原蛋白I，IV的粘附。胶原蛋白I，IV是细胞外基质的重要组成部分，胶质瘤细胞的浸润性生长，首先需要通过对细胞外基质的粘附来实现。本实验表明，抗整合素β1抗体可明显抑制SHG44胶质瘤细胞对胶原蛋白I，IV的粘附，提示整合素β1在胶质瘤细胞与细胞外基质的粘附过程中是必不可少的，即参与了胶质瘤细胞的浸润性生长。通过抑制整合素β1在胶质瘤细胞的表达或阻断其与细胞外基质蛋白的结合，可抑制胶质瘤细胞的浸润性生长，而有 助于胶质瘤的治疗。
参考文献：
[1] Hynes RO. Integrins: versatility, modulation and signaling in cell adhesion[J]. Cell, 1992;69(1):11- 25.
, http://www.100md.com
[2] Uhm JH, Gladson CL, Rao JS, et al. The role of integrins in the malignant phenotype of gliomas[J]. Front Biosci,1999;4:D188- 199.
[3] Paulus W, Baur I, Schuppan D, et al. Characterization of integrin receptors in normal and neoplastic human brain[J]. Am J Pathol, 1993;143(1):154- 163.
[4] Tonn JC, Wunderlich S, Kerkau S, et al. Invasive behaviour of human gliomas is mediated by interindividually different integrin patterns[J]. Anticancer Res, 1998; 18(4A):2599- 2605.
, 百拇医药
[5] Goldbrunner RH, Haugland HK, Klein CE, et al. ECM dependent and integrin mediated tumor cell migration of human glioma and melanoma cell lines under serum- free conditions[J]. Anticancer Res， 1996; 16(6B):3679-
3687.
[6] Fukushima Y, Ohnishi T, Arita N, et al. Integrin alpha 3 beta1- mediated interaction with laminin- 5 stimulates adhesion, migration and invasion of malignant glioma cells[J]. Int J Cancer, 1998;76(1):63- 72.
[7] Tysnes BB, Larsen LF, Ness GO, et al. Stimulation of glioma cell migration by laminin and inhibition by anti-alpha 3 and anti- beta1 integrin antibodies[J]. Int J Cancer, 1996; 67(6):777- 784., 百拇医药