汉滩病毒PS-6株的分离及其生物学性状研究
作者：姚树元 杭长寿 邱建明 霍子威 石晓宏 张全福 李川 宋干
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所 北京，100052
关键词：汉滩病毒；生物学性状；RT-PCR分型；核苷酸序列分析
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY ND IMMUNOLOGY 2000 Vol 【 摘要 】 目的 从病人血清分离汉坦病毒Ⅰ型毒株，为双价疫苗的配伍提供更好的候选株。 方法 从陕西HFRS患者血清，按常规法分离汉坦病毒。用系列单克隆抗体、空斑减少中和试验、RT-PCR及部分核苷酸序列分析等检定，确证所分离毒株的血清(或基因)型别。 结果 从17份HFRS患者血清中成功地分离到1株汉坦病毒，定名为PS-6株。经上述方法全面鉴定确定其为汉滩病毒(即Ⅰ型病毒)。该毒株有较强的繁殖力(毒力)及较好的抗原性，其免疫血清对来源于不同地区的Ⅰ型病毒有较好的中和活性。 结论 PS-6毒株有可能成为Ⅰ型病毒疫苗候选株，为双价或多价疫苗配伍。
, 百拇医药
Isolation and characterization of Hantaan-serotype virus PS-6 strain
YAO Shuyuan, HANG Changshou, QIU Jianming, et al.
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective Isolation of Hantaan-serotype virus strain that could be provided as a better candidate strain for bivalent inactivated vaccine. Methods One strain was isolated from the sera of HFRS patients of Xi′an. The serotype of the virus was then examined by serial McAbs, PRNT, RT-PCR and sequencing analysis of part M segment. Results One strain of the virus, designated as PS-6, was successfully isolated from 17 sera of HFRS patients, and was identified as Hantaan-serotype virus by the methods mentioned above. Conclusions PS-6 was one with high multiplicity and good antigenicity and its immunoserum had better neutralizing activity to Hantaan-serotype viruses isolated from epidemic areas. PS-6 is a potential candidate strain for bivalent or multivalent inactivated vaccine.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Hantaan virus; Biocharacteristics; RT-PCR; Nucleotides sequencing
肾综合征出血热(HFRS)用疫苗预防接种是控制和减少其发病率的关键之举。我国先后有3种单价灭活疫苗投放市场，取得明显的防病效果。然而，由于我国HFRS疫源地的变迁，即由原来单纯的姬鼠型或家鼠型疫区演变成姬鼠型、家鼠型和混合型疫区〔1〕，且混合型疫区占全国大多数；加之我国汉滩病毒(姬鼠型)又有多个亚型〔2〕，故上述单价(Ⅰ型或Ⅱ型)疫苗或仅一个汉滩病毒亚型的双价疫苗不能完全适应全国所有疫区之需，必须研制新的双价或多价疫苗。从人源分离病毒，尤其是汉滩病毒，作为Ⅰ型疫苗候选株，是研究双价或多价疫苗的第一步。此外，随时了解自然流行的病毒种群的变化(特别是分子结构上的变化)，为疫苗的研制和防治策略的制定，提供必要的基础材料。近几年来，我们从HFRS疫区病人中先后分离到多株病毒，有些病毒有可能成为组成双价或多价疫苗的候选株，PS-6株就是其中之一，现将初步研究结果报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
病毒与细胞：汉滩病毒76-118、A9、HB114、A3、Chen、A537、84FLi、C4株及汉城病毒L99、R22、SEO-8039株；传代细胞Vero-E6由本室提供，其传代及保存按常规操作。
病毒的分离
标本采集及运送：由陕西省西安医科大学附属第一医院刘正稳大夫提供，1992年临床急性期的病人，无菌采血后立即分离血清，血清冻存于-70℃冰箱，用冰瓶1天内送到实验室。
细胞培养分离：参照文献〔3〕。
乳鼠鼠脑分离：昆明(KM)小白鼠乳鼠、孕鼠购于中国医学科学院实验动物研究所繁育场，乳小白鼠为2～4日龄。实验方法参照文献〔3〕。
病毒免疫血清制备及获得：健康金黄地鼠(非纯系)，由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所动物房提供，6周龄左右，每只约50克。以(0.5～1)×107 PFU病毒腹腔接种金黄地鼠，雄雌分开喂养，留出2只作正常对照，21 d后心脏无菌采血，4℃过夜后，3 000r/min离心10 min，分离血清，分装后-30℃冻存。兔抗Chen、A3、HB54、A9、C4、76-118、JR及NE株的兔免疫血清均为本室提供。
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动物毒力实验：病毒以脑内1.2×104 PFU/只或腹腔2.4×104 PFU/只接种乳鼠，观察死亡的时间和数量。
病毒繁殖动态：取长成单层的Vero-E6细胞1瓶，以2.4×104 PFU 接种后，每天刮片，或收2ml上清，观察荧光及空斑滴度动态。
空斑试验及空斑减少中和试验：参照文献〔4〕进行。
微量细胞病变中和试验(MCPENT)：参照文献〔5〕。
RT-PCR及序列测定：引物序列及位置〔6〕：如表1所示。
表1 汉坦病毒cDNA合成及分型引物
Table 1. Primers for cDNA synthesis and type identification
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Primer
Sequence (5′→3′)
Location
Speciality
P1
CCGGATCCTAGTAGTA
GACACCGC(24)
1-16bp(+)
HTN & SEO
Pi
ATACCCAAGTAAGTTG
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GAGAGG(22)
270-291bp(+)
HTN
Pj
AAAGGATTTCTTAACC
TGTT(20)
730-711bp(-)
HTN
Pk
TAACCAAGGTCGTATG
GCGGAA(22)
270-291bp(+)
, 百拇医药
SEO
Pl
CATTGCTGATGTGATG
GCAG(20)
730-711bp(-)
SEO
方法：用RNAgentR全细胞RNA提取试剂盒提取RNA，用P1作为引物进行反转录。用Pi-Pj或Pl-Pk作为引物，72℃ 1 min，以下按95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min进行35个循环扩增。使用MagicTM PCR产物纯化系统纯化PCR产物。用pGEM-T载体克隆，采用双脱氧核苷酸终止法测定序列。在IBM-AST兼容计算机上，DOS 3.30环境下运行DNAsis和PROsis软件，Copyright(c) HITACHI software engineering co. LTD. 1984, 1990进行分析。 结果
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1.病毒的分离
Vero-E6细胞培养分离病毒：17份病人血清接种Vero-E6后，盲传3代后，检测发现4份有可疑的阳性荧光反应，再传时其中1份即达到荧光++++，冻融后离心收作原始毒种。
昆明种乳鼠鼠脑分离病毒：上述第6份血清，接种乳小白鼠鼠脑，共8只，第10天观察有5只发病，其中1只死亡。取鼠脑压血片和冰冻切片后查荧光发现有特异性荧光颗粒。传第2代时采用腹腔及脑内联合接种，10 d后发病率比第1代有所增加(8/9), 切片得到与第1代相似的荧光结果。共传3代。取鼠脑作鼠脑毒种。原始毒种和鼠脑毒种均定名为PS-6株。
2.空斑的形成及形态：PS-6株在Vero-E6上第6～7天可成斑，斑较大且清晰。图略。
3.PS-6与系列汉坦病毒单克隆抗体反应：PS-6病毒抗原与系列不同特性的单克隆抗体反应(谱)表明与Ⅰ型病毒76～118株十分一致，而与Ⅱ型病毒L99存在明显的差别，主要表现为对Ⅱ型病毒单抗不反应。用我室分型单克隆抗体Type-A(针对Ⅰ型病毒的混合单克隆抗体)与Type-R(针对Ⅱ型病毒的混合单克隆抗体)，其只与Type-A反应，而与Type-R不反应。这清楚表明PS-6病毒为Ⅰ型病毒，即汉滩型病毒。
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4.用空斑减少中和试验(PRNT法)对PS-6株进行抗血清分型：利用不同病毒株的免疫血清对PS-6株进行空斑减少中和实验。表2结果表明，PS-6和A9株对Ⅰ型病毒(汉滩型)免疫血清有相同的中和效价；而对Ⅱ型病毒(汉城型)免疫血清则表现较低的中和效价。对NEV(为Puumala型，即Ⅲ型)免疫血清无中和作用。再次表明PS-6毒株为Ⅰ型(汉滩型)病毒。
表2 PRNT法对PS-6进行分型
Table 2. Type identificafion of PS-6 by PRNT
Antisera
Type
PRNT titer
L99
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PS-6
A9
Chen
Ⅰ
<10
40
40
A9
Ⅰ
10
40
80
C4
Ⅰ
, http://www.100md.com
10
80
160
76-118
Ⅰ
<10
40
40
JR
Ⅰ
<10
80
80
A3
, 百拇医药
Ⅰ
40
80
40
HB
Ⅱ
20
20
20
L99
Ⅱ
40
10
20
, http://www.100md.com
R22
Ⅱ
80
10
10
SR-11
Ⅱ
40
<10
10
NEV
Ⅱ
<10
<10
, 百拇医药
<10
5.抗PS-6株血清对其它病毒的中和反应：用PS-6免疫金黄地鼠制备的抗血清，与不同地区来源的毒株进行Hepes致病变减少中和实验(McPENT)，结果如表3。 表3 抗PS-6株血清对于不同病毒的中和作用
Table 3. Neutralization activity of PS-6′s anti-serum
Strain
Location
Type
NT titer
A9
Jiangsu
, 百拇医药
HTN(Ⅰ)
160
76-118
Korea
HTN(Ⅰ)
320
Chen
Anhui
HTN(Ⅰ)
160
A537
Fujian
HTN(Ⅰ)
, 百拇医药
80
A3
Zhejiang
HTN(Ⅰ)
80
84FLi
Xi′an
HTN(Ⅰ)
160
HB144
Hubei
HTN(Ⅰ)
80
, http://www.100md.com
L99
Jiangxi
SEO(Ⅱ)
<20
R22
Henan
SEO(Ⅱ)
<20
Seo8039
Korea Seoul
SEO(Ⅱ)
<20
PS-6
, 百拇医药
/
/
320
从表3可以看出，PS-6株免疫血清对国内外汉滩病毒(Ⅰ型)流行株有较好的中和活性，但对汉城病毒(Ⅱ型)未能测到活性。
6.PS-6与A9株的繁殖动态比较：PS-6与A9株以同样的PFU数感染Vero-E6细胞，PS-6株第1天即可查到个别荧光，第3天可达++++，持续至第8天不减。A9株则在第3天才可以查到荧光，第7天达++++。细胞培养上清中病毒用空斑法滴定，结果如图1所示，在上清中PS-6株的滴度在第3天即可达到高峰(2.0×107 PFU/ml)，持续至第10天只是略有降低，而A9株在第6天才达到高峰(2.3×106 PFU/ml)。
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图1 A9及PS-6株在Vero-E6细胞上的繁殖动态
Fig 1. Growth kinetics of A9 and PS-6 on Vero-E6 cell
7.PS-6株针对乳鼠的毒力：以同样的PFU分别在乳鼠腹腔或脑内接种A9和PS-6病毒。存活率与时间之间的关系如图2所示。PS-6株在脑内接种第10天即全部死亡，腹腔接种第12～14天全部死亡，明显快于A9，表明对乳鼠的毒力较强。
图2 A9及PS-6株接种乳鼠的死亡率
Fig 2. The mortality of suckling mice inoculated with A9 and PS-6 viruses
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8.PCR分型及序列分析
(1)Ⅰ型引物可以扩出一条0.46kb大小的带，而Ⅱ型则不能，证明PS-6为Ⅰ型病毒。
(2)由PCR产物进行核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性与其它病毒HTN(Ⅰ型)、SEO(Ⅱ型)、PUU(Ⅲ型)及PH(Ⅳ型)相比较分别为：80.1%～82.0%，88.9%～92.8%；65.2%～68.0%，58.4%～63.0%；53.8%，43.5%及48.0%，42.6%。证明PS-6株具Ⅰ型特征。
讨论
李盈盈等〔6〕认为Pi-Pj和Pl-Pk分别是Ⅰ型、Ⅱ型特异性引物。对PS-6株的cDNA用上述两对引物扩增的结果表明，只能由Pi-Pj扩增出约0.46kb的产 物；对扩增产物进行序列分析，并与已经发表的汉坦病毒株的序列作同源性比较，结果表明，虽然PS-6株与其它Ⅰ型病毒在分子水平上有较大变异，但与Ⅰ型的同源性不论是在DNA水平还是氨基酸水平均比其它型病毒高得多(DNA水平80%～82%，氨基酸水平89.4%～92.8%)。说明PS-6株在基因水平上具有Ⅰ型病毒的特性。
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M.Wang等〔7〕用2D5单抗作为选择压力选择了1株对2D5不反应的毒株(2D5逃避株)，测序的结果表明只在糖蛋白G1第217位氨基酸发生了G→R的变化。有意思的是，在PS-6 株中也出现了相同的氨基酸变化(尽管利用的密码子不同，PS-6株中为AGA，2D5逃避株中为AGG)，也表现对2D5单抗的不反应。这种在自然状态下(人体感染)与在人为选择压力状态下(试验环境)发生了一样的突变的现象提示，出血热病毒在自然感染过程中似乎受到了免疫系统的选择压力作用。曾经有人指出，在单抗选择压力下可以找到弱毒株，上述的结果表明，单个中和位点的消失并不一定能影响毒力，相反，由于能够逃避一定的免疫选择压力，其繁殖力反而可能提高。现在还不能确定PS-6株的强毒力是否与免疫逃避有关。
比较PS-6 株与其它Ⅰ型病毒核苷酸序列(包括76-118株)的变异时，发现PS-6株的核苷酸突变方式与其它的不同：在其它的Ⅰ型病毒与76-118株比较时，变异大多为单个核苷酸的替换，而PS-6株中多次发生“缺失造成移码→再缺失再移码→恢复”的突变规律，且多发生在编码亮氨酸的密码子(7/10)；另一点是这种变化过后编码的氨基酸仍为亮氨酸，甚至连附近的氨基酸都不发生变化。其结果就是只有编码亮氨酸的密码子发生了变化，而且这种变化并非密码子第三位的摇摆，而是CTN→TTN，或TTN→CTN的变化，共发生了5处。蛋白质二级结构分析表明，亮氨酸往往处于各种二级结构(α-螺旋，β-片层折叠、β-转角及自由团曲)的交界处，而这样的部位对于整个蛋白质的构象形成是至关重要的，所以要求要比较保守。但值得注意的是，为什么要发生这些似乎毫无意义的突变，而且数量又这么多？一般认为密码子利用情况的变化与经历的宿主有关，而突变是为了更好地适应宿主以求得生存。PS-6株是否也是这种适应的结果呢？值得探讨。
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参考文献
1，陈化新.中国肾综合征出血热疫情.中国公共卫生，1996，12(10)：435-436.
2，Liang Mifang, Li Dexin, Yao Shuyuan，et al. Antigenic and molecular characterization of Hantavirus isolates from China. Virus Research, 1994, 31:219-233.
3，杭长寿.流行性出血热实验诊断.见宋干主编.流行性出血热防治手册.第二版，北京：人民卫生出版社, 1998.
4，Lee HW，Dalrymple JM. Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome, with collaborating center for virus reference and search. April,1992.
, http://www.100md.com
5，聂子林, 俞永新，刘文雪.EHFV微量细胞病变中和试验法的建立及其在中和抗体检测中的应用.中华微生物学和免疫学杂志, 1991，11(4)：263-266.
6，李盈盈，杭长寿，刘旭，等.聚合酶链式反应技术在肾综合征出血热病毒基因分型中的应用.中华实验和临床病毒学杂志, 1994，8(1)：20-25.
7，Wang M, Rossi C, Schmaljohn CS, et al. Epitope mapping studies with neutralizing and non-neutralizing monoclonal antibodies to the G1 and G2 envelope glycoproteins of Hantaan virus. Virology, 1993,197:757-766.
(收稿日期：2000-01-06), 百拇医药
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所 北京，100052
关键词：汉滩病毒；生物学性状；RT-PCR分型；核苷酸序列分析
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY ND IMMUNOLOGY 2000 Vol 【 摘要 】 目的 从病人血清分离汉坦病毒Ⅰ型毒株，为双价疫苗的配伍提供更好的候选株。 方法 从陕西HFRS患者血清，按常规法分离汉坦病毒。用系列单克隆抗体、空斑减少中和试验、RT-PCR及部分核苷酸序列分析等检定，确证所分离毒株的血清(或基因)型别。 结果 从17份HFRS患者血清中成功地分离到1株汉坦病毒，定名为PS-6株。经上述方法全面鉴定确定其为汉滩病毒(即Ⅰ型病毒)。该毒株有较强的繁殖力(毒力)及较好的抗原性，其免疫血清对来源于不同地区的Ⅰ型病毒有较好的中和活性。 结论 PS-6毒株有可能成为Ⅰ型病毒疫苗候选株，为双价或多价疫苗配伍。
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Isolation and characterization of Hantaan-serotype virus PS-6 strain
YAO Shuyuan, HANG Changshou, QIU Jianming, et al.
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective Isolation of Hantaan-serotype virus strain that could be provided as a better candidate strain for bivalent inactivated vaccine. Methods One strain was isolated from the sera of HFRS patients of Xi′an. The serotype of the virus was then examined by serial McAbs, PRNT, RT-PCR and sequencing analysis of part M segment. Results One strain of the virus, designated as PS-6, was successfully isolated from 17 sera of HFRS patients, and was identified as Hantaan-serotype virus by the methods mentioned above. Conclusions PS-6 was one with high multiplicity and good antigenicity and its immunoserum had better neutralizing activity to Hantaan-serotype viruses isolated from epidemic areas. PS-6 is a potential candidate strain for bivalent or multivalent inactivated vaccine.
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【 Subject words 】 Hantaan virus; Biocharacteristics; RT-PCR; Nucleotides sequencing
肾综合征出血热(HFRS)用疫苗预防接种是控制和减少其发病率的关键之举。我国先后有3种单价灭活疫苗投放市场，取得明显的防病效果。然而，由于我国HFRS疫源地的变迁，即由原来单纯的姬鼠型或家鼠型疫区演变成姬鼠型、家鼠型和混合型疫区〔1〕，且混合型疫区占全国大多数；加之我国汉滩病毒(姬鼠型)又有多个亚型〔2〕，故上述单价(Ⅰ型或Ⅱ型)疫苗或仅一个汉滩病毒亚型的双价疫苗不能完全适应全国所有疫区之需，必须研制新的双价或多价疫苗。从人源分离病毒，尤其是汉滩病毒，作为Ⅰ型疫苗候选株，是研究双价或多价疫苗的第一步。此外，随时了解自然流行的病毒种群的变化(特别是分子结构上的变化)，为疫苗的研制和防治策略的制定，提供必要的基础材料。近几年来，我们从HFRS疫区病人中先后分离到多株病毒，有些病毒有可能成为组成双价或多价疫苗的候选株，PS-6株就是其中之一，现将初步研究结果报告如下。
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材料与方法
病毒与细胞：汉滩病毒76-118、A9、HB114、A3、Chen、A537、84FLi、C4株及汉城病毒L99、R22、SEO-8039株；传代细胞Vero-E6由本室提供，其传代及保存按常规操作。
病毒的分离
标本采集及运送：由陕西省西安医科大学附属第一医院刘正稳大夫提供，1992年临床急性期的病人，无菌采血后立即分离血清，血清冻存于-70℃冰箱，用冰瓶1天内送到实验室。
细胞培养分离：参照文献〔3〕。
乳鼠鼠脑分离：昆明(KM)小白鼠乳鼠、孕鼠购于中国医学科学院实验动物研究所繁育场，乳小白鼠为2～4日龄。实验方法参照文献〔3〕。
病毒免疫血清制备及获得：健康金黄地鼠(非纯系)，由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所动物房提供，6周龄左右，每只约50克。以(0.5～1)×107 PFU病毒腹腔接种金黄地鼠，雄雌分开喂养，留出2只作正常对照，21 d后心脏无菌采血，4℃过夜后，3 000r/min离心10 min，分离血清，分装后-30℃冻存。兔抗Chen、A3、HB54、A9、C4、76-118、JR及NE株的兔免疫血清均为本室提供。
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动物毒力实验：病毒以脑内1.2×104 PFU/只或腹腔2.4×104 PFU/只接种乳鼠，观察死亡的时间和数量。
病毒繁殖动态：取长成单层的Vero-E6细胞1瓶，以2.4×104 PFU 接种后，每天刮片，或收2ml上清，观察荧光及空斑滴度动态。
空斑试验及空斑减少中和试验：参照文献〔4〕进行。
微量细胞病变中和试验(MCPENT)：参照文献〔5〕。
RT-PCR及序列测定：引物序列及位置〔6〕：如表1所示。
表1 汉坦病毒cDNA合成及分型引物
Table 1. Primers for cDNA synthesis and type identification
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Primer
Sequence (5′→3′)
Location
Speciality
P1
CCGGATCCTAGTAGTA
GACACCGC(24)
1-16bp(+)
HTN & SEO
Pi
ATACCCAAGTAAGTTG
, http://www.100md.com
GAGAGG(22)
270-291bp(+)
HTN
Pj
AAAGGATTTCTTAACC
TGTT(20)
730-711bp(-)
HTN
Pk
TAACCAAGGTCGTATG
GCGGAA(22)
270-291bp(+)
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SEO
Pl
CATTGCTGATGTGATG
GCAG(20)
730-711bp(-)
SEO
方法：用RNAgentR全细胞RNA提取试剂盒提取RNA，用P1作为引物进行反转录。用Pi-Pj或Pl-Pk作为引物，72℃ 1 min，以下按95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min进行35个循环扩增。使用MagicTM PCR产物纯化系统纯化PCR产物。用pGEM-T载体克隆，采用双脱氧核苷酸终止法测定序列。在IBM-AST兼容计算机上，DOS 3.30环境下运行DNAsis和PROsis软件，Copyright(c) HITACHI software engineering co. LTD. 1984, 1990进行分析。 结果
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1.病毒的分离
Vero-E6细胞培养分离病毒：17份病人血清接种Vero-E6后，盲传3代后，检测发现4份有可疑的阳性荧光反应，再传时其中1份即达到荧光++++，冻融后离心收作原始毒种。
昆明种乳鼠鼠脑分离病毒：上述第6份血清，接种乳小白鼠鼠脑，共8只，第10天观察有5只发病，其中1只死亡。取鼠脑压血片和冰冻切片后查荧光发现有特异性荧光颗粒。传第2代时采用腹腔及脑内联合接种，10 d后发病率比第1代有所增加(8/9), 切片得到与第1代相似的荧光结果。共传3代。取鼠脑作鼠脑毒种。原始毒种和鼠脑毒种均定名为PS-6株。
2.空斑的形成及形态：PS-6株在Vero-E6上第6～7天可成斑，斑较大且清晰。图略。
3.PS-6与系列汉坦病毒单克隆抗体反应：PS-6病毒抗原与系列不同特性的单克隆抗体反应(谱)表明与Ⅰ型病毒76～118株十分一致，而与Ⅱ型病毒L99存在明显的差别，主要表现为对Ⅱ型病毒单抗不反应。用我室分型单克隆抗体Type-A(针对Ⅰ型病毒的混合单克隆抗体)与Type-R(针对Ⅱ型病毒的混合单克隆抗体)，其只与Type-A反应，而与Type-R不反应。这清楚表明PS-6病毒为Ⅰ型病毒，即汉滩型病毒。
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4.用空斑减少中和试验(PRNT法)对PS-6株进行抗血清分型：利用不同病毒株的免疫血清对PS-6株进行空斑减少中和实验。表2结果表明，PS-6和A9株对Ⅰ型病毒(汉滩型)免疫血清有相同的中和效价；而对Ⅱ型病毒(汉城型)免疫血清则表现较低的中和效价。对NEV(为Puumala型，即Ⅲ型)免疫血清无中和作用。再次表明PS-6毒株为Ⅰ型(汉滩型)病毒。
表2 PRNT法对PS-6进行分型
Table 2. Type identificafion of PS-6 by PRNT
Antisera
Type
PRNT titer
L99
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PS-6
A9
Chen
Ⅰ
<10
40
40
A9
Ⅰ
10
40
80
C4
Ⅰ
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10
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160
76-118
Ⅰ
<10
40
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JR
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<10
80
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Ⅰ
40
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Ⅱ
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20
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L99
Ⅱ
40
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20
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R22
Ⅱ
80
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SR-11
Ⅱ
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NEV
Ⅱ
<10
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5.抗PS-6株血清对其它病毒的中和反应：用PS-6免疫金黄地鼠制备的抗血清，与不同地区来源的毒株进行Hepes致病变减少中和实验(McPENT)，结果如表3。 表3 抗PS-6株血清对于不同病毒的中和作用
Table 3. Neutralization activity of PS-6′s anti-serum
Strain
Location
Type
NT titer
A9
Jiangsu
, 百拇医药
HTN(Ⅰ)
160
76-118
Korea
HTN(Ⅰ)
320
Chen
Anhui
HTN(Ⅰ)
160
A537
Fujian
HTN(Ⅰ)
, 百拇医药
80
A3
Zhejiang
HTN(Ⅰ)
80
84FLi
Xi′an
HTN(Ⅰ)
160
HB144
Hubei
HTN(Ⅰ)
80
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L99
Jiangxi
SEO(Ⅱ)
<20
R22
Henan
SEO(Ⅱ)
<20
Seo8039
Korea Seoul
SEO(Ⅱ)
<20
PS-6
, 百拇医药
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从表3可以看出，PS-6株免疫血清对国内外汉滩病毒(Ⅰ型)流行株有较好的中和活性，但对汉城病毒(Ⅱ型)未能测到活性。
6.PS-6与A9株的繁殖动态比较：PS-6与A9株以同样的PFU数感染Vero-E6细胞，PS-6株第1天即可查到个别荧光，第3天可达++++，持续至第8天不减。A9株则在第3天才可以查到荧光，第7天达++++。细胞培养上清中病毒用空斑法滴定，结果如图1所示，在上清中PS-6株的滴度在第3天即可达到高峰(2.0×107 PFU/ml)，持续至第10天只是略有降低，而A9株在第6天才达到高峰(2.3×106 PFU/ml)。
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图1 A9及PS-6株在Vero-E6细胞上的繁殖动态
Fig 1. Growth kinetics of A9 and PS-6 on Vero-E6 cell
7.PS-6株针对乳鼠的毒力：以同样的PFU分别在乳鼠腹腔或脑内接种A9和PS-6病毒。存活率与时间之间的关系如图2所示。PS-6株在脑内接种第10天即全部死亡，腹腔接种第12～14天全部死亡，明显快于A9，表明对乳鼠的毒力较强。
图2 A9及PS-6株接种乳鼠的死亡率
Fig 2. The mortality of suckling mice inoculated with A9 and PS-6 viruses
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8.PCR分型及序列分析
(1)Ⅰ型引物可以扩出一条0.46kb大小的带，而Ⅱ型则不能，证明PS-6为Ⅰ型病毒。
(2)由PCR产物进行核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性与其它病毒HTN(Ⅰ型)、SEO(Ⅱ型)、PUU(Ⅲ型)及PH(Ⅳ型)相比较分别为：80.1%～82.0%，88.9%～92.8%；65.2%～68.0%，58.4%～63.0%；53.8%，43.5%及48.0%，42.6%。证明PS-6株具Ⅰ型特征。
讨论
李盈盈等〔6〕认为Pi-Pj和Pl-Pk分别是Ⅰ型、Ⅱ型特异性引物。对PS-6株的cDNA用上述两对引物扩增的结果表明，只能由Pi-Pj扩增出约0.46kb的产 物；对扩增产物进行序列分析，并与已经发表的汉坦病毒株的序列作同源性比较，结果表明，虽然PS-6株与其它Ⅰ型病毒在分子水平上有较大变异，但与Ⅰ型的同源性不论是在DNA水平还是氨基酸水平均比其它型病毒高得多(DNA水平80%～82%，氨基酸水平89.4%～92.8%)。说明PS-6株在基因水平上具有Ⅰ型病毒的特性。
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M.Wang等〔7〕用2D5单抗作为选择压力选择了1株对2D5不反应的毒株(2D5逃避株)，测序的结果表明只在糖蛋白G1第217位氨基酸发生了G→R的变化。有意思的是，在PS-6 株中也出现了相同的氨基酸变化(尽管利用的密码子不同，PS-6株中为AGA，2D5逃避株中为AGG)，也表现对2D5单抗的不反应。这种在自然状态下(人体感染)与在人为选择压力状态下(试验环境)发生了一样的突变的现象提示，出血热病毒在自然感染过程中似乎受到了免疫系统的选择压力作用。曾经有人指出，在单抗选择压力下可以找到弱毒株，上述的结果表明，单个中和位点的消失并不一定能影响毒力，相反，由于能够逃避一定的免疫选择压力，其繁殖力反而可能提高。现在还不能确定PS-6株的强毒力是否与免疫逃避有关。
比较PS-6 株与其它Ⅰ型病毒核苷酸序列(包括76-118株)的变异时，发现PS-6株的核苷酸突变方式与其它的不同：在其它的Ⅰ型病毒与76-118株比较时，变异大多为单个核苷酸的替换，而PS-6株中多次发生“缺失造成移码→再缺失再移码→恢复”的突变规律，且多发生在编码亮氨酸的密码子(7/10)；另一点是这种变化过后编码的氨基酸仍为亮氨酸，甚至连附近的氨基酸都不发生变化。其结果就是只有编码亮氨酸的密码子发生了变化，而且这种变化并非密码子第三位的摇摆，而是CTN→TTN，或TTN→CTN的变化，共发生了5处。蛋白质二级结构分析表明，亮氨酸往往处于各种二级结构(α-螺旋，β-片层折叠、β-转角及自由团曲)的交界处，而这样的部位对于整个蛋白质的构象形成是至关重要的，所以要求要比较保守。但值得注意的是，为什么要发生这些似乎毫无意义的突变，而且数量又这么多？一般认为密码子利用情况的变化与经历的宿主有关，而突变是为了更好地适应宿主以求得生存。PS-6株是否也是这种适应的结果呢？值得探讨。
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(收稿日期：2000-01-06), 百拇医药