三种逆转剂对人膀胱癌多药耐受相关蛋白介导的多药耐受逆转的研究
作者：章小平 鲁功成 杨红枚
单位：章小平 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科 武汉，430022)；杨红枚(同济医科大学附属协和医院检验科)
关键词：抗肿瘤药；药物耐受性；多药耐受相关蛋白；膀胱肿瘤
临床泌尿外科杂志001213 摘要 目的：观察环孢霉素A(CsA)、维拉帕米(Ver)、黄体酮(Prog)对膀胱癌多药耐受相关蛋白(MRP)介导的多药耐受(MDR)的逆转作用。方法：分别采用MTT方法和流式细胞仪检测观察CsA、Ver和Prog逆转化疗药物VCR对MRP高表达的膀胱癌细胞的细胞毒性作用的逆转效果，以及对细胞内柔红霉素(DNR)聚集、外排的影响。结果：CsA和Ver作为多药耐受糖蛋白(P-gp)的良好剂同样可以显著逆转VCR对MRP高表达的EJ/MRP细胞毒性作用，具有增加EJ/MRP细胞内DNR的聚集和减少外排的作用，剂量越大作用越强；而Prog则无类似作用。结论：CsA和Ver对人膀胱癌MRP介导的MDR具有良好的逆转作用，可通过增加细胞内的药物聚集和减少外排已进入细胞内的药物起作用，这种作用存在剂量依从关系。
, 百拇医药
The reversal effect of CsA, verapamil and progesterone on MRP-
mediated MDR in human bladder carcinoma cells
ZHANG Xiao-ping LU Gong-cheng
(Department of Urology,Xiehe Hosoital,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
YANG Hong-mei
(Department of Clinical Laboratory,Xiehe Hospital,Tongji Medical University)
, 百拇医药
Abstract Purpose:To investigate the reversal effects of Cyclosporine (CsA),Verapamil (Ver) and Progesterone (Prog) on multidrug resistant associated protein (MRP) mediated MDR in bladder carcinoma.Methods:The reversal effects of three modulators on cytotoxicity of VCR to MRP-overexpressed bladder carcinoma cells and the influence on intracellular drug accumulation and efflux were observed by using drug sensitivity testing (MTT method) and flow cytometry detection respectively.Results:CsA and Ver, which are good modulators of P-gp, could significantly improve the sensitivity of MRP-overexpressed bladder to VCR, and increase intracellular DNRaccumulation and decrease intracellular DNR efflux. The higher the dose, the more significant the effects. Prog has no similar effects.Conclusions:Our studies revealed that CsA and Ver had significant reversal effects on MRP mediated MDR in human bladder carcinoma probably by decreasing drug accumulation and increasing intracellular drug efflux, and these effects were dose dependent.
, 百拇医药
Key words Antineoplastic agents Drug tolerance Multidrug-rcsistant associatcd protein Bladder neoplasms
自多药耐受糖蛋白(P-gp)介导的多药耐受(Multidrng resistance,MDR)现象发现以来，如何克服MDR，提高临床化疗的效果，一直是基础研究者和临床医生致力研究的一个重要课题。日本的Tsuruo等首次报道了体外应用维拉帕米(Ver)抑制P388白血病细胞株对长春新碱的耐受，此后发现了数十种可以程度不等地逆转MDR的药物，这类药物统称为化疗增敏剂或逆转剂。这些逆转剂绝大多数是针对P-gp介导的MDR，但至今仍未发现针对多药耐受相关蛋白(MRP)介导的MDR的理想逆转剂。为此，我们观察了环孢素A(CsA)、Ver黄体酮(Prog)对膀胱癌MRP介导的MDR逆转的作用，现将结果报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验对象的建立及鉴定
我们利用脂质体方法将MRP基因转入膀胱癌EJ细胞，经G418筛选获取稳定表达MRP的亚克隆EJ/MRP。用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学等方法从mRNA、蛋白质水平证实，与转染空载体的细胞EJ/Vect相比，EJ/MRP高表达MRP，无P-gp表达。药物敏感试验表明EJ/MRP呈典型的MDR。流式细胞仪功能检测发现EJ/MRP细胞内柔红霉素(DNR)的聚集减少，外排增快〔1，2〕。
1.2 检测观察方法
三种逆转剂对化疗药物细胞毒性逆转的检测：细胞毒试验采用改良的MTT方法。观察Ver、CsA和Prog三种逆转剂逆转化疗药物长春新碱(VCR)对EJ/MRP、EJ/Vect的细胞毒性作用。每种逆转剂分别采用以下三种终浓度，Ver为5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L，CsA为2 μmol/L、4 μmol/L和10 μmol/L，Prog为2 μmol/L、4 μmol/L和6 μmol/L。每一种逆转剂各4组观察，即VCR组和VCR分别加三种不同终浓度的逆转剂组。化疗药物VCR临用前用培养基等比稀释成100、10、1、0.1、0.01、0.001 mg/L六种浓度。在96孔板上每孔分别加入各浓度药液90 μl和EJ/MRP细胞或对照EJ/Vect细胞各90 μl(细胞浓度为5×104个/ml)。同时设置加等体积PBS的无细胞孔为零对照，不加药物孔为阳性对照。在5%二氧化碳培养箱37℃中培养48～56 h，加入10 g/L的MTT(10 μl/孔)继续孵育4 h，稍离心后轻轻吸去上清液，加入二甲基亚砜、无水乙醇等体积混合液100 μl/孔，振荡30 s，在Bio-Kinetics Reader (Bio-TEK产品)上测定吸光度A值。实验波长595 nm，参考波长630 nm。以上实验至少平行重复3次。按以下公式求取细胞存活率：
, 百拇医药
细胞成活率=(实验组(或对照组)每孔A值)/(实验组(或对照组)阳性对照孔A值)×100%
再以细胞存活率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标绘图求取半数抑制浓度(IC50)，并计算每种药物至少3次IC50的平均值(
)(将mg/L转换成nmol/L)、标准差(s)和逆转倍数(RT)。为观察逆转剂本身对细胞的毒性作用，各逆转剂采用以下终浓度：Ver为40 μmol/L，CsA为20 μmol/L，Prog为16 μmol/L。在不加药物情况下同条件培养并处理细胞。
RT=IC50(单用VCR)/IC50(VCR+逆转剂)
三种逆转剂对细胞内药物聚集及滞留的检测：取EJ/MRP和EJ/Vect细胞各4瓶，使培养基的DNR终浓度为2 μmol/L，同时分别加入逆转剂CsA(终浓度为4 μmol/L)、Ver(终浓度为10 μmol/L)和Prog(终浓度为2 μmol/L)，各自设不加逆转剂者为对照，置37℃孵育180 min后分别收获细胞。用冷PBS(0℃)吹洗，离心3次后用500 μl冷PBS吹散细胞，在流式细胞仪(FAC Sort,Becton Dickinon)上进行检测(激发光源波长488 nm，滤过光源波长575 nm)，观察三种逆转剂对细胞内DNR聚集的影响。另取上述细胞各4瓶，单独用DNR(终浓度为2 μmol/L)作用180 min后，换无药培养基并同时各加入上述浓度逆转剂CsA、Ver和Prog，各以不加逆转剂者为对照，作用90 min后，同样条件处理并检测逆转剂对细胞内DNR滞留量的影响。以上所有实验均重复3次，求取相应的和s，并进行统计学分析，每次测量至少取6 000个细胞。
, 百拇医药
2 结果
Ver、CsA和Prog在超过实验最高终浓度2倍的浓度下对两种细胞均无明显的毒性作用，细胞存活率在90%以上，可以排除三种逆转剂细胞毒性对结果的影响。
不同浓度逆转剂的逆转结果见表1。从表1中可见三种逆转剂对EJ/Vect细胞没有明显逆转作用，Ver和CsA对EJ/MRP有一定的逆转作用，20 μmol/L的Ver和10 μmol/L的CsA的逆转倍数分别达4.5倍和5.6倍，差异有显著性意义(P<0.05)，后者的作用稍强，而且Ver和CsA的逆转作用在我们设计的浓度范围内随浓度升高而增强。Prog作为P-gp功能的阻滞剂，对两种细胞均无逆转作用。我们由此推测：由于EJ/MRP细胞和EJ/Vect细胞相比存在MRP高表达，Ver和CsA是通过高表达的MRP起作用，这种作用存在剂量依从关系。
表1 不同浓度逆转剂的逆转效果 组别
, 百拇医药
EJ/MRP细胞
IC50(nmol/L)
RT
EJ/Vect细胞
IC50(nmol/L)
RT
单纯VCR组
137.1
1.0
10.2
1.0
VCR加Ver5 μmol/L组
, 百拇医药
103.1
1.3
8.3
1.2
VCR加Ver
10 μmol/L组
54.0
2.5
9.0
1.1
VCR加Ver
20 μmol/L组
30.3
, http://www.100md.com
4.5
7.4
1.4
VCR加CsA
2 μmol/L组
99.3
1.4
8.3
1.2
VCR加CsA
4 μmol/L组
42.6
3.2
, 百拇医药
7.4
1.4
VCR加CsA
10 μmol/L组
24.5
5.6
6.8
1.5
VCR加Prog
2 μmol/L组
136.5
1.0
11.3
, 百拇医药
0.9
VCR加Prog
4 μmol/L组
124.3
1.1
9.7
1.1
VCR加Prog
6 μmol/L组
103.4
1.3
9.4
1.1
, 百拇医药
EJ/Vect细胞加入逆转剂Ver、Prog和CsA后，细胞内的DNR浓度没有明显变化，而Ver、CsA可以分别使EJ/MRP细胞内的DNR浓度提高36%和45%，差异有显著性意义(P<0.05)。Prog只使EJ/MRP细胞内DNR浓度轻微提高。当两种细胞的DNR浓度达到稳定状态后(约180 min)，再加入不含DNR但含相应逆转剂的培养液，作用90 min后可见EJ/Vect细胞的药物外排基本不受影响；而Ver和CsA却可以减慢EJ/MRP细胞内药物的外排速度，Prog对此没有影响。
3 讨论
大量实验表明，MDR的一个显著特点是其表型可以经过不同途径得到一定程度的逆转。运用各种逆转剂是逆转MDR的一个重要途径。针对P-gp的常用逆转剂有钙离子通道阻滞剂，如维拉帕米及类似物、钙调蛋白阻滞剂、CsA、激素、抗P-gp单抗以及其他奎尼丁类、脂质体等。目前，维拉帕米及其衍生物、CsA及其类似物SDZ PSC833、奎宁等已进入临床Ⅱ、Ⅲ期试验，有望在不久的将来推广应用。我们已经知道一种肿瘤的MDR常有多种机制共同参与，而有些肿瘤细胞的MDR根本没有P-gp参与，因此，这些逆转剂纵然能较好地逆转P-gp介导的MDR，但若对其他机制介导的MDR没有逆转作用，则会大大限制它们的潜在临床应用价值。
, 百拇医药
MRP参与介导了多种肿瘤诸如膀胱癌〔3〕、肺癌〔4〕、多种白血病〔5〕、前列腺癌〔6〕、乳腺癌〔7〕、卵巢癌等的MDR。关于P-gp逆转剂CsA、Ver等能否逆转MRP介导的MDR存有不同的意见。Versomtvoo等认为Ver、CsA和PSC-833对MRP介导的MDR无作用。Cole等〔8〕发现Ver、CsA可以增强MRP介导的MDR的Hela细胞对化疗药物敏感性，但对不同药物的增敏作用不同。而Zaman等〔9〕的研究则显示CsA对MRP介导的非小细胞性肺癌的MDR无明显作用。这些不一致的结论可能和方法不同有关，也可能和研究对象的组织来源不同有关。本实验中所用MRP转染的膀胱癌细胞经鉴定有MRP高表达但无P-gp表达，并呈典型的MDR表型。CsA、Ver可以使耐药细胞对VCR的敏感性提高，提高程度具有剂量依从关系。流式细胞仪检测显示CsA、Ver分别使胞内聚集的DNR浓度提高近45%和36%，而且可以使MRP细胞外排DNR速度降低。CsA和Ver对相对敏感的EJ/Vect细胞则没有类似作用，故我们推测CsA和Ver是通过EJ/MRP细胞高表达的MRP起逆转作用，具体机制是使进入细胞内的药物聚集减少和外排增加。Prog与CsA和Vcr不同，它不是P-gp的作用底物而是P-gp功能阻滞剂〔10〕，Prog不能改变EJ/MRP细胞对VCR敏感性，也不影响细胞内DNR聚集及外排速度，说明对MRP无逆转作用。
, 百拇医药
以前，我们在体外用阿霉素诱导建立的人膀胱癌MDR细胞BIU-87/ADM中的研究发现Ver和CsA可以逆转MDR〔11〕，并且对9例患者应用噻替哌和Ver行膀胱灌注局部化疗，随访18.3个月，复发率低于单用化疗药物腔内灌注。现在又证实Ver和CsA对参与膀胱癌MDR的另一种机制MRP也有一定的逆转作用，为将来开发它们临床逆转膀胱癌MDR提供了实验依据。尽管由于Ver的心血管副作用和CsA的免疫抑制作用限制了它们全身应用的剂量范围，但Ver衍生物如deverapamil、CsA的类似物SDZ PSC833等的开发，尤其是SDZ PSC833具有CsA相似的逆转效果，为临床克服膀胱癌MDR展现了诱人的前景。
国家自然科学基金资助项目(编号 39670723)
参考文献
1，章小平，杨红枚，鲁功成.膀胱癌MRP亚克隆的建立及其MDR表型.中华肿瘤杂志，2000，22：8～10
, http://www.100md.com
2，章小平，杨红枚，鲁功成.膀胱癌稳定表达多药耐受相关蛋白亚克隆的生物学特征.中华实验外科杂志，2000，17：255～256
3，Giaccone G,Ark-Otte JV,Rubio G J,et al.MRP is frequently expressed in human lung-cancer cell lines,in non-small-cell lung cancer and in normal lung.Int J Cancer,1996,66:760～767
4，Burger H,Notter K,Zaman G J R,et al.Expression of the multidrug resistance-associated protein(MRP) in acute and chronic leukemias.Leukemia,1994,8:990～997
, http://www.100md.com 5，Bucci B,Pansadoro V,De Paula F,et al.Biologic characteristics of T1 papillary bladder cancer.Flow cytometric study of paraffinembedded material.Anal Quant Cytol Histol,1995,71:738～743
6，Filipits M,Suchomel R W,Dekan G,et al.MRP and MDR1 gene expression in primary breast carcinomas.Clin Cancer Res,1996,2:1231～1237
7，Izquicrdo M A,van dcr Zee A G J,Vcrmorkn J B,et al.Drug resistance-associated marker Lrp for predication of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma.J Natl Cancer Inst,1995,87:1230～1237
, http://www.100md.com
8，Cole S P C,Sparks K E,Fraser K,et al.Pharmacological characterization of multidrug resistance MRP-transfected human tumor cells.Cancer Res,1994,54:5902～5910
9，Zaman G J R,Flens M J,Van Leusden M R,et al.The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8822～8826
10，Barnes K M,Dickstein B,Cutler G B,et al.Steroid tranaport,acumulation,and antagonism of P-Glycoprotein in multidrug-resistant cells.Biochemistry,1996,35:4820～4827
11，Heqing G,Gongcheng L,Xulin X,et al.Establishment of doxorubicin-resistant human bladder cancer cell line and its mechanism of multidrug resistance.Chin Med J,1997,110:167～172
(收稿 2000-09-13), 百拇医药
单位：章小平 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科 武汉，430022)；杨红枚(同济医科大学附属协和医院检验科)
关键词：抗肿瘤药；药物耐受性；多药耐受相关蛋白；膀胱肿瘤
临床泌尿外科杂志001213 摘要 目的：观察环孢霉素A(CsA)、维拉帕米(Ver)、黄体酮(Prog)对膀胱癌多药耐受相关蛋白(MRP)介导的多药耐受(MDR)的逆转作用。方法：分别采用MTT方法和流式细胞仪检测观察CsA、Ver和Prog逆转化疗药物VCR对MRP高表达的膀胱癌细胞的细胞毒性作用的逆转效果，以及对细胞内柔红霉素(DNR)聚集、外排的影响。结果：CsA和Ver作为多药耐受糖蛋白(P-gp)的良好剂同样可以显著逆转VCR对MRP高表达的EJ/MRP细胞毒性作用，具有增加EJ/MRP细胞内DNR的聚集和减少外排的作用，剂量越大作用越强；而Prog则无类似作用。结论：CsA和Ver对人膀胱癌MRP介导的MDR具有良好的逆转作用，可通过增加细胞内的药物聚集和减少外排已进入细胞内的药物起作用，这种作用存在剂量依从关系。
, 百拇医药
The reversal effect of CsA, verapamil and progesterone on MRP-
mediated MDR in human bladder carcinoma cells
ZHANG Xiao-ping LU Gong-cheng
(Department of Urology,Xiehe Hosoital,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
YANG Hong-mei
(Department of Clinical Laboratory,Xiehe Hospital,Tongji Medical University)
, 百拇医药
Abstract Purpose:To investigate the reversal effects of Cyclosporine (CsA),Verapamil (Ver) and Progesterone (Prog) on multidrug resistant associated protein (MRP) mediated MDR in bladder carcinoma.Methods:The reversal effects of three modulators on cytotoxicity of VCR to MRP-overexpressed bladder carcinoma cells and the influence on intracellular drug accumulation and efflux were observed by using drug sensitivity testing (MTT method) and flow cytometry detection respectively.Results:CsA and Ver, which are good modulators of P-gp, could significantly improve the sensitivity of MRP-overexpressed bladder to VCR, and increase intracellular DNRaccumulation and decrease intracellular DNR efflux. The higher the dose, the more significant the effects. Prog has no similar effects.Conclusions:Our studies revealed that CsA and Ver had significant reversal effects on MRP mediated MDR in human bladder carcinoma probably by decreasing drug accumulation and increasing intracellular drug efflux, and these effects were dose dependent.
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Key words Antineoplastic agents Drug tolerance Multidrug-rcsistant associatcd protein Bladder neoplasms
自多药耐受糖蛋白(P-gp)介导的多药耐受(Multidrng resistance,MDR)现象发现以来，如何克服MDR，提高临床化疗的效果，一直是基础研究者和临床医生致力研究的一个重要课题。日本的Tsuruo等首次报道了体外应用维拉帕米(Ver)抑制P388白血病细胞株对长春新碱的耐受，此后发现了数十种可以程度不等地逆转MDR的药物，这类药物统称为化疗增敏剂或逆转剂。这些逆转剂绝大多数是针对P-gp介导的MDR，但至今仍未发现针对多药耐受相关蛋白(MRP)介导的MDR的理想逆转剂。为此，我们观察了环孢素A(CsA)、Ver黄体酮(Prog)对膀胱癌MRP介导的MDR逆转的作用，现将结果报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验对象的建立及鉴定
我们利用脂质体方法将MRP基因转入膀胱癌EJ细胞，经G418筛选获取稳定表达MRP的亚克隆EJ/MRP。用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学等方法从mRNA、蛋白质水平证实，与转染空载体的细胞EJ/Vect相比，EJ/MRP高表达MRP，无P-gp表达。药物敏感试验表明EJ/MRP呈典型的MDR。流式细胞仪功能检测发现EJ/MRP细胞内柔红霉素(DNR)的聚集减少，外排增快〔1，2〕。
1.2 检测观察方法
三种逆转剂对化疗药物细胞毒性逆转的检测：细胞毒试验采用改良的MTT方法。观察Ver、CsA和Prog三种逆转剂逆转化疗药物长春新碱(VCR)对EJ/MRP、EJ/Vect的细胞毒性作用。每种逆转剂分别采用以下三种终浓度，Ver为5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L，CsA为2 μmol/L、4 μmol/L和10 μmol/L，Prog为2 μmol/L、4 μmol/L和6 μmol/L。每一种逆转剂各4组观察，即VCR组和VCR分别加三种不同终浓度的逆转剂组。化疗药物VCR临用前用培养基等比稀释成100、10、1、0.1、0.01、0.001 mg/L六种浓度。在96孔板上每孔分别加入各浓度药液90 μl和EJ/MRP细胞或对照EJ/Vect细胞各90 μl(细胞浓度为5×104个/ml)。同时设置加等体积PBS的无细胞孔为零对照，不加药物孔为阳性对照。在5%二氧化碳培养箱37℃中培养48～56 h，加入10 g/L的MTT(10 μl/孔)继续孵育4 h，稍离心后轻轻吸去上清液，加入二甲基亚砜、无水乙醇等体积混合液100 μl/孔，振荡30 s，在Bio-Kinetics Reader (Bio-TEK产品)上测定吸光度A值。实验波长595 nm，参考波长630 nm。以上实验至少平行重复3次。按以下公式求取细胞存活率：
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细胞成活率=(实验组(或对照组)每孔A值)/(实验组(或对照组)阳性对照孔A值)×100%
再以细胞存活率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标绘图求取半数抑制浓度(IC50)，并计算每种药物至少3次IC50的平均值(
)(将mg/L转换成nmol/L)、标准差(s)和逆转倍数(RT)。为观察逆转剂本身对细胞的毒性作用，各逆转剂采用以下终浓度：Ver为40 μmol/L，CsA为20 μmol/L，Prog为16 μmol/L。在不加药物情况下同条件培养并处理细胞。RT=IC50(单用VCR)/IC50(VCR+逆转剂)
三种逆转剂对细胞内药物聚集及滞留的检测：取EJ/MRP和EJ/Vect细胞各4瓶，使培养基的DNR终浓度为2 μmol/L，同时分别加入逆转剂CsA(终浓度为4 μmol/L)、Ver(终浓度为10 μmol/L)和Prog(终浓度为2 μmol/L)，各自设不加逆转剂者为对照，置37℃孵育180 min后分别收获细胞。用冷PBS(0℃)吹洗，离心3次后用500 μl冷PBS吹散细胞，在流式细胞仪(FAC Sort,Becton Dickinon)上进行检测(激发光源波长488 nm，滤过光源波长575 nm)，观察三种逆转剂对细胞内DNR聚集的影响。另取上述细胞各4瓶，单独用DNR(终浓度为2 μmol/L)作用180 min后，换无药培养基并同时各加入上述浓度逆转剂CsA、Ver和Prog，各以不加逆转剂者为对照，作用90 min后，同样条件处理并检测逆转剂对细胞内DNR滞留量的影响。以上所有实验均重复3次，求取相应的
和s，并进行统计学分析，每次测量至少取6 000个细胞。, 百拇医药
2 结果
Ver、CsA和Prog在超过实验最高终浓度2倍的浓度下对两种细胞均无明显的毒性作用，细胞存活率在90%以上，可以排除三种逆转剂细胞毒性对结果的影响。
不同浓度逆转剂的逆转结果见表1。从表1中可见三种逆转剂对EJ/Vect细胞没有明显逆转作用，Ver和CsA对EJ/MRP有一定的逆转作用，20 μmol/L的Ver和10 μmol/L的CsA的逆转倍数分别达4.5倍和5.6倍，差异有显著性意义(P<0.05)，后者的作用稍强，而且Ver和CsA的逆转作用在我们设计的浓度范围内随浓度升高而增强。Prog作为P-gp功能的阻滞剂，对两种细胞均无逆转作用。我们由此推测：由于EJ/MRP细胞和EJ/Vect细胞相比存在MRP高表达，Ver和CsA是通过高表达的MRP起作用，这种作用存在剂量依从关系。
表1 不同浓度逆转剂的逆转效果 组别
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EJ/MRP细胞
IC50(nmol/L)
RT
EJ/Vect细胞
IC50(nmol/L)
RT
单纯VCR组
137.1
1.0
10.2
1.0
VCR加Ver5 μmol/L组
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103.1
1.3
8.3
1.2
VCR加Ver
10 μmol/L组
54.0
2.5
9.0
1.1
VCR加Ver
20 μmol/L组
30.3
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4.5
7.4
1.4
VCR加CsA
2 μmol/L组
99.3
1.4
8.3
1.2
VCR加CsA
4 μmol/L组
42.6
3.2
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7.4
1.4
VCR加CsA
10 μmol/L组
24.5
5.6
6.8
1.5
VCR加Prog
2 μmol/L组
136.5
1.0
11.3
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0.9
VCR加Prog
4 μmol/L组
124.3
1.1
9.7
1.1
VCR加Prog
6 μmol/L组
103.4
1.3
9.4
1.1
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EJ/Vect细胞加入逆转剂Ver、Prog和CsA后，细胞内的DNR浓度没有明显变化，而Ver、CsA可以分别使EJ/MRP细胞内的DNR浓度提高36%和45%，差异有显著性意义(P<0.05)。Prog只使EJ/MRP细胞内DNR浓度轻微提高。当两种细胞的DNR浓度达到稳定状态后(约180 min)，再加入不含DNR但含相应逆转剂的培养液，作用90 min后可见EJ/Vect细胞的药物外排基本不受影响；而Ver和CsA却可以减慢EJ/MRP细胞内药物的外排速度，Prog对此没有影响。
3 讨论
大量实验表明，MDR的一个显著特点是其表型可以经过不同途径得到一定程度的逆转。运用各种逆转剂是逆转MDR的一个重要途径。针对P-gp的常用逆转剂有钙离子通道阻滞剂，如维拉帕米及类似物、钙调蛋白阻滞剂、CsA、激素、抗P-gp单抗以及其他奎尼丁类、脂质体等。目前，维拉帕米及其衍生物、CsA及其类似物SDZ PSC833、奎宁等已进入临床Ⅱ、Ⅲ期试验，有望在不久的将来推广应用。我们已经知道一种肿瘤的MDR常有多种机制共同参与，而有些肿瘤细胞的MDR根本没有P-gp参与，因此，这些逆转剂纵然能较好地逆转P-gp介导的MDR，但若对其他机制介导的MDR没有逆转作用，则会大大限制它们的潜在临床应用价值。
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MRP参与介导了多种肿瘤诸如膀胱癌〔3〕、肺癌〔4〕、多种白血病〔5〕、前列腺癌〔6〕、乳腺癌〔7〕、卵巢癌等的MDR。关于P-gp逆转剂CsA、Ver等能否逆转MRP介导的MDR存有不同的意见。Versomtvoo等认为Ver、CsA和PSC-833对MRP介导的MDR无作用。Cole等〔8〕发现Ver、CsA可以增强MRP介导的MDR的Hela细胞对化疗药物敏感性，但对不同药物的增敏作用不同。而Zaman等〔9〕的研究则显示CsA对MRP介导的非小细胞性肺癌的MDR无明显作用。这些不一致的结论可能和方法不同有关，也可能和研究对象的组织来源不同有关。本实验中所用MRP转染的膀胱癌细胞经鉴定有MRP高表达但无P-gp表达，并呈典型的MDR表型。CsA、Ver可以使耐药细胞对VCR的敏感性提高，提高程度具有剂量依从关系。流式细胞仪检测显示CsA、Ver分别使胞内聚集的DNR浓度提高近45%和36%，而且可以使MRP细胞外排DNR速度降低。CsA和Ver对相对敏感的EJ/Vect细胞则没有类似作用，故我们推测CsA和Ver是通过EJ/MRP细胞高表达的MRP起逆转作用，具体机制是使进入细胞内的药物聚集减少和外排增加。Prog与CsA和Vcr不同，它不是P-gp的作用底物而是P-gp功能阻滞剂〔10〕，Prog不能改变EJ/MRP细胞对VCR敏感性，也不影响细胞内DNR聚集及外排速度，说明对MRP无逆转作用。
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以前，我们在体外用阿霉素诱导建立的人膀胱癌MDR细胞BIU-87/ADM中的研究发现Ver和CsA可以逆转MDR〔11〕，并且对9例患者应用噻替哌和Ver行膀胱灌注局部化疗，随访18.3个月，复发率低于单用化疗药物腔内灌注。现在又证实Ver和CsA对参与膀胱癌MDR的另一种机制MRP也有一定的逆转作用，为将来开发它们临床逆转膀胱癌MDR提供了实验依据。尽管由于Ver的心血管副作用和CsA的免疫抑制作用限制了它们全身应用的剂量范围，但Ver衍生物如deverapamil、CsA的类似物SDZ PSC833等的开发，尤其是SDZ PSC833具有CsA相似的逆转效果，为临床克服膀胱癌MDR展现了诱人的前景。
国家自然科学基金资助项目(编号 39670723)
参考文献
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(收稿 2000-09-13), 百拇医药