冷冻同种异体肌腱小鼠移植的细胞毒、IL－2水平及组织学观察
作者：鲁晓波 杨志明 张郁馨
单位：鲁晓波 646000 泸州医学院附属医院骨科，张郁馨 细胞学检查室；杨志明 华西医科大学附属第一医院骨科
关键词：移植，同种；移植免疫学；腱；细胞毒性，免疫；白细胞介素-2；组织学
中华创伤杂志990411 【摘要】 目的 了解冷冻同种异体肌腱移植术后宿主的免疫排斥反应。方法 采用BALB/C小鼠肌袋模型，植入冷冻C57小鼠跟腱，观察术后各期宿主血清微量细胞毒性、局部组织浆IL-2水平和局部组织学变化。结果 (1)经冷冻/冻干处理组淋巴细胞毒性、IL-2活性显著低于未处理组(P<0.01)，但仍高于自体组(P<0.01)。(2)处理各组间细胞毒性无差异(P>0.05)，而IL-2活性-196℃组高于其他组(P<0.01)。(3)各组局部组织淋巴细胞浸润程度与细胞毒反应相符。结论 经冷冻/冻干处理后，同种异体肌腱移植免疫排斥反应显著降低，但未消失。
, 百拇医药
An Investigation of Cytotoxicity, IL-2 and Histology Following Frozen Allografts Tendons in Mice
LU Xiaobo*, YANG Zhiming, ZHANG Yuxin.
* Dept. of Orthopedic Surgery, Luzhou Medical College, Luzhou 646000
【Abstract】 Objective In order to investigate the immune rejection response of host to the implanted achilles tendon allografts of C57 mice in BALB/C mice model. Methods The dryly frozen, deeply frozen (-196℃) and frozen (-80℃) achilles tendons of C57 mice were respectively treated as Group A,B,C while fresh tendons allografts served as positive control (Group D) and autografts as negative control (Group E). Immunologic and histologic characters were observed at 2, 7, 14, 28, 42 days, separately. Results (1) The contents of lymphocytotoxicity and IL-2 showed markedly lower in Group A,B,C than in Group D (P<0.01), but were still higher than in Group E. (2) The IL-2 level was significant difference (P<0.01) between Group B and A or C. (3) The histologic immuneresponse in Group A,B,C abated more greatly than in Group D, but the local tissue was still infiltrated by monocytes and lymphocytes. Conclusions The immune rejection response is abated markedly but does not disappear in the treated achilles tendons of allografts.
, 百拇医药
【Key words】 Transplantation, homologous Transplantation Immunology Tendon Cytotoxicity, immunologic Interleukin-2 Histology
同种异体肌腱移植的临床应用日益受到重视，但对其植入后的免疫反应报道不一。笔者进行了如下实验，以观察经冷冻/冻干处理的同种异体小鼠跟腱在宿主体内的免疫排斥反应。
材料与方法
一、主要仪器
自动恒温CO2培养箱，可控温深低温冰箱(德国),真空冷冻干燥机(日本)，倒置相差显微镜，微量反应盒(Terasaki板,96孔,美国Corning公司)，液氮储存容器,显微手术器械,全自动酶免分析仪(美国Auraflex公司)。
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二、溶液
1.试剂：Hanks液，体积分数为10%的新生小牛血清(FCS)，RPMI1640培养液,PHA溶液,淋巴细胞分离液,兔补体,医用液体石蜡，质量浓度为83 g/L的Tris-NH4Cl液，酸化异丙醇，质量浓度为50 g/L的伊红水溶液，MTT染色液。
2.CTIL-2细胞株(华西医科大学免疫教研室赠)。
3.淋巴细胞悬液制备：取C57小鼠的脾脏,用100目不锈钢筛研磨制成单个细胞悬液，用质量浓度为83 g/L的Tris-NH4Cl除去红细胞。提取细胞悬液5 ml,加入1/2的淋巴细胞分离液,离心2 000 r/min 15分钟,再用体积分数为10%的FCS-RPMI1640将细胞浓度调至2×106/ml，置4℃冰箱备用。
, http://www.100md.com 4.局部组织匀浆上清制备：无菌条件下取植入局部组织块50mg左右，加入不完全RPMI1640培养液,用100目不锈钢筛研磨，离心，体积分数为10%的FCS-RPMI1640培养液调至细胞浓度2×106/ml，加PHA，37.5℃、体积分数为5%的CO2培养48小时，收集上清，-20℃冻存。
三、供体肌腱的处理
取C57近交系雄性小鼠(华西医科大学实验动物中心提供)50只，体重20g左右,断颈处死，在严格无菌条件下，切取双侧跟腱共100根，Hanks液(加庆大霉素100U/ml)反复冲洗后,低温保护剂DMSO及体积分数为10%的FCS浸泡10分钟，放入消毒玻瓶中待处理。
1.冷冻组：放入可控低温冰箱(下降1℃/h)降温至-80℃10天后，或再移至液氮储存器保存-196℃待用，分别制成-80℃和-196℃组，术前15分钟解冻。
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2.冻干组：放入可控低温冰箱10天后，再置入真空冷冻干燥机处理至残余湿度1%左右，密封，术前3小时解冻。
四、动物模型及分组
取6～8周雄性BALB/C近交系小鼠90只，体重20g左右，随机分为5组，戊巴比妥钠腹腔麻醉，在小鼠双侧股后肌间隙分别植入冻干组(A)、深冷冻组(B)、冷冻组(C)、未经处理组(D)、自体移植腱组(E),术后2，7，14，28，42天无菌条件下取血清、局部组织块及组织匀浆上清液待用。
五、检测方法及步骤
1.微量细胞毒测定：采用Terasaki改良法[1] 。在微量反应盒每孔加入5～10μl医用石蜡油，以防反应物蒸发，加入待检各组的受检血清1μl；加入细胞浓度为2×106 /ml的淋巴细胞悬液1 μl，轻轻振动，使血清与细胞充分混匀，另设阴性与阳性对照孔；置室温(22±2)℃30分钟；加入兔补体5 μl，置室温(22±2)℃60分钟；加入质量浓度为50 g/L的伊红溶液3 μl染色；加入体积分数为3%的甲醛8μl固定；静置2小时，轻轻吸去上清液，倒置相差显微镜下计数。死细胞(伊红染色)百分数按高于对照孔计算。
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2.IL-2活性测定：采用细胞增殖MTT比色法[1]。将处于对数生长IL-2依赖细胞株CTIL-2用体积分数为10%的FCS-RPMI1640洗涤3次,离心，用体积分数为5%的FCS-RPMI1640调整细胞浓度为1×105 /ml,加入96孔反应板中,每孔100 μl;加入局部组织匀浆上清100 μl/孔；每份样品作复孔,另外作阳性(rIL-2标准)及阴性(培养液)对照；37.5℃、体积分数为5%的CO2培养24小时；加质量浓度为50 μg/L MTT溶液10 μl/孔；继续培养24～36小时；加酸化异丙醇100 μl/孔；充分振荡吹打后，静置20分钟，用检测波长570 nm参考波长630 nm比色分析。
3.局部组织块大体形态观察：HE染色，光镜下组织学细胞分析。
六、统计方法
两样本均数差异显著性用t检验。
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结 果
一、 各移植组细胞毒反应结果(图1)
由图1可见，未处理组在整个观察期中，其细胞毒活性明显高于其余各组(P<0.01)；处理各组与自体组比,其活性亦高于自体组(P<0.05)，而在各处理组之间无显著性差异(P>0.05)。
图1 术后观察时段细胞毒结果
二、 各移植组局部组织匀浆IL-2活性水平(表1)
表1 各移植组局部组织匀浆IL-2 活性水平(
±s,U/ng) 组别
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鼠数
术后时间(天)
2
7
14
28
42
冷冻干燥组
6
0.55±0.02**△△
0.27±0.05**△△
0.21±0.06
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0.15±0.02
0.14±0.03
深冷冻组
6
0.65±0.12**△△
0.48±0.04**△△▲▲
0.19±0.03
0.14±0.04
0.11±0.01
冷冻组
6
, 百拇医药 0.59±0.04**△△
0.29±0.06**△△
0.24±0.01
0.14±0.01
0.13±0.01
未处理组
6
0.92±0.04
0.69±0.08
0.17±0.02
0.19±0.06
, 百拇医药
0.15±0.08
自体组
6
0.20±0.04
0.20±0.02
0.11±0.01
0.12±0.01
0.13±0.02
各处理组与未处理组比较：**P<0.01 各处理组与自体组比较：△△ P<0.01 深冷冻组与冻干、冷冻组比较：▲▲P<0.01 由表1可见，术后2天各组的IL-2活性水平达到高峰；术后2，7天各处理组与未处理组均有显著性差异(P<0.01)，各处理组与自体组之间也有显著性差异(P<0.01)；术后7天各处理组之间还见到深冷冻组(-196℃)与冻干、冷冻组有显著性差异(P<0.01)；14天后IL-2活性水平显著下降。
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三、组织形态学观察结果
未处理组切口局部隆起，腱周组织高度水肿，镜下观察以大量淋巴细胞浸润为主，另有少量Mφ及中性粒细胞，淋巴细胞浸润持续整个实验观察时段。处理各组局部肿胀较未处理组显著减轻，镜下有较多的淋巴细胞及单核细胞浸润，亦持续整个观察时段。自体组术后腱周水肿不明显，镜下早期以中性粒细胞浸润为主，随后有单核细胞浸润，于14天后同正常结构。
讨 论
1.Graham等[3]报告，组织经过冷冻及解冻过程能使其表面的组织相容性抗原破坏、变性，降低其抗原性。冷冻法有冻干法、深冷冻法(-196℃)和冷冻法(-80℃)。笔者将此法成功地应用于BALB/L小鼠肌袋模型，植入C57小鼠跟腱，观察宿主体内的免疫排斥反应。
2.许多研究证明，淋巴细胞毒与排斥反应的发生、移植物的预后密切相关，排斥前、中即可测到淋巴细胞杀伤率增高[4]。从本实验看，未处理组淋巴细胞杀伤率在整个观察时段明显高于处理各组；各处理组淋巴细胞杀伤率虽明显低于未处理组，但仍高于自体组。可见经冷冻或干燥处理后同种异体腱移植使宿主体内产生免疫排斥反应显著降低，而不是消失。这种现象亦被局部组织学表现所证实。
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3.免疫排斥反应是多细胞及其因子参与的复杂过程，对血清和组织IL-2生物活性水平的测定，可反映排斥反应的大小[5]。本实验异体腱植入后第2天，组织匀浆中各组IL 活性水平达到高峰，这可能与手术创伤所引起的应激反应有关。术后2，7天未处理组IL-2水平明显高于各组，各处理组与自体组之间亦有显著性差异，提示经冷冻/冻干处理后免疫反应减弱而仍存在，这与细胞毒实验及组织学观察相符。术后7天，各处理组之间B组(-196℃)IL-2水平明显高于A、C组，提示B组的排斥反应较强。分析原因，可能与-196℃在较好保存组织活性的同时，也相对地保存了其抗原性有关。提示我们在维持其原有生物学活性的同时，还应采用更为有力的灭活细胞抗原性的措施[6，7]，这种现象在细胞毒试验中未反应出来。术后14天各组IL-2活性均明显下降，已不能用于判别有无排斥反应。由此笔者得出以下结论：⑴冷冻和冷冻干燥处理可降低异体腱组织的抗原性，使免疫排斥反应显著降低，但未能消失；⑵深冷冻良好保存异体肌腱细胞活性的同时，亦相对地保存了抗原性；⑶各组局部组织学改变与微量细胞毒反应有更显著的相关性。
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参考文献
1 杨廷彬,尹学念,主编.实用免疫学.第1版.长春：长春出版社,1994. 604.
2 杨廷彬,尹学念,主编.实用免疫学.第1版.长春：长春出版社,1994. 592.
3 Graham WC,Smith DA. The use of frozen stored tendons for grafting: an experimental study.J Bone Joint Surg(Am)， 1959, 37:624
4 夏穗生，主编.器官移植学.第1版.上海：上海科技出版社,1995. 43.
5 Theze J, Alzari PM, Bertoglio J. Interleukin-2 and its receptors： recent advances and new immunological functions. Immunol Today， 1996, 17∶481-486
6 鄂征,主编.组织培养技术. 第1版. 北京：人民卫生出版社,1982. 114.
7 Pinkowski JL,Rodrigo JJ,Sharkey NA,et al.Immune response to nonspecific and altered tissue antigen in soft tissue allografts.Clin Orthop Rel Res,1996,323:80-85
收稿日期：1998-09-24
修稿日期：1999-04-18, http://www.100md.com
单位：鲁晓波 646000 泸州医学院附属医院骨科，张郁馨 细胞学检查室；杨志明 华西医科大学附属第一医院骨科
关键词：移植，同种；移植免疫学；腱；细胞毒性，免疫；白细胞介素-2；组织学
中华创伤杂志990411 【摘要】 目的 了解冷冻同种异体肌腱移植术后宿主的免疫排斥反应。方法 采用BALB/C小鼠肌袋模型，植入冷冻C57小鼠跟腱，观察术后各期宿主血清微量细胞毒性、局部组织浆IL-2水平和局部组织学变化。结果 (1)经冷冻/冻干处理组淋巴细胞毒性、IL-2活性显著低于未处理组(P<0.01)，但仍高于自体组(P<0.01)。(2)处理各组间细胞毒性无差异(P>0.05)，而IL-2活性-196℃组高于其他组(P<0.01)。(3)各组局部组织淋巴细胞浸润程度与细胞毒反应相符。结论 经冷冻/冻干处理后，同种异体肌腱移植免疫排斥反应显著降低，但未消失。
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An Investigation of Cytotoxicity, IL-2 and Histology Following Frozen Allografts Tendons in Mice
LU Xiaobo*, YANG Zhiming, ZHANG Yuxin.
* Dept. of Orthopedic Surgery, Luzhou Medical College, Luzhou 646000
【Abstract】 Objective In order to investigate the immune rejection response of host to the implanted achilles tendon allografts of C57 mice in BALB/C mice model. Methods The dryly frozen, deeply frozen (-196℃) and frozen (-80℃) achilles tendons of C57 mice were respectively treated as Group A,B,C while fresh tendons allografts served as positive control (Group D) and autografts as negative control (Group E). Immunologic and histologic characters were observed at 2, 7, 14, 28, 42 days, separately. Results (1) The contents of lymphocytotoxicity and IL-2 showed markedly lower in Group A,B,C than in Group D (P<0.01), but were still higher than in Group E. (2) The IL-2 level was significant difference (P<0.01) between Group B and A or C. (3) The histologic immuneresponse in Group A,B,C abated more greatly than in Group D, but the local tissue was still infiltrated by monocytes and lymphocytes. Conclusions The immune rejection response is abated markedly but does not disappear in the treated achilles tendons of allografts.
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【Key words】 Transplantation, homologous Transplantation Immunology Tendon Cytotoxicity, immunologic Interleukin-2 Histology
同种异体肌腱移植的临床应用日益受到重视，但对其植入后的免疫反应报道不一。笔者进行了如下实验，以观察经冷冻/冻干处理的同种异体小鼠跟腱在宿主体内的免疫排斥反应。
材料与方法
一、主要仪器
自动恒温CO2培养箱，可控温深低温冰箱(德国),真空冷冻干燥机(日本)，倒置相差显微镜，微量反应盒(Terasaki板,96孔,美国Corning公司)，液氮储存容器,显微手术器械,全自动酶免分析仪(美国Auraflex公司)。
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二、溶液
1.试剂：Hanks液，体积分数为10%的新生小牛血清(FCS)，RPMI1640培养液,PHA溶液,淋巴细胞分离液,兔补体,医用液体石蜡，质量浓度为83 g/L的Tris-NH4Cl液，酸化异丙醇，质量浓度为50 g/L的伊红水溶液，MTT染色液。
2.CTIL-2细胞株(华西医科大学免疫教研室赠)。
3.淋巴细胞悬液制备：取C57小鼠的脾脏,用100目不锈钢筛研磨制成单个细胞悬液，用质量浓度为83 g/L的Tris-NH4Cl除去红细胞。提取细胞悬液5 ml,加入1/2的淋巴细胞分离液,离心2 000 r/min 15分钟,再用体积分数为10%的FCS-RPMI1640将细胞浓度调至2×106/ml，置4℃冰箱备用。
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三、供体肌腱的处理
取C57近交系雄性小鼠(华西医科大学实验动物中心提供)50只，体重20g左右,断颈处死，在严格无菌条件下，切取双侧跟腱共100根，Hanks液(加庆大霉素100U/ml)反复冲洗后,低温保护剂DMSO及体积分数为10%的FCS浸泡10分钟，放入消毒玻瓶中待处理。
1.冷冻组：放入可控低温冰箱(下降1℃/h)降温至-80℃10天后，或再移至液氮储存器保存-196℃待用，分别制成-80℃和-196℃组，术前15分钟解冻。
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2.冻干组：放入可控低温冰箱10天后，再置入真空冷冻干燥机处理至残余湿度1%左右，密封，术前3小时解冻。
四、动物模型及分组
取6～8周雄性BALB/C近交系小鼠90只，体重20g左右，随机分为5组，戊巴比妥钠腹腔麻醉，在小鼠双侧股后肌间隙分别植入冻干组(A)、深冷冻组(B)、冷冻组(C)、未经处理组(D)、自体移植腱组(E),术后2，7，14，28，42天无菌条件下取血清、局部组织块及组织匀浆上清液待用。
五、检测方法及步骤
1.微量细胞毒测定：采用Terasaki改良法[1] 。在微量反应盒每孔加入5～10μl医用石蜡油，以防反应物蒸发，加入待检各组的受检血清1μl；加入细胞浓度为2×106 /ml的淋巴细胞悬液1 μl，轻轻振动，使血清与细胞充分混匀，另设阴性与阳性对照孔；置室温(22±2)℃30分钟；加入兔补体5 μl，置室温(22±2)℃60分钟；加入质量浓度为50 g/L的伊红溶液3 μl染色；加入体积分数为3%的甲醛8μl固定；静置2小时，轻轻吸去上清液，倒置相差显微镜下计数。死细胞(伊红染色)百分数按高于对照孔计算。
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2.IL-2活性测定：采用细胞增殖MTT比色法[1]。将处于对数生长IL-2依赖细胞株CTIL-2用体积分数为10%的FCS-RPMI1640洗涤3次,离心，用体积分数为5%的FCS-RPMI1640调整细胞浓度为1×105 /ml,加入96孔反应板中,每孔100 μl;加入局部组织匀浆上清100 μl/孔；每份样品作复孔,另外作阳性(rIL-2标准)及阴性(培养液)对照；37.5℃、体积分数为5%的CO2培养24小时；加质量浓度为50 μg/L MTT溶液10 μl/孔；继续培养24～36小时；加酸化异丙醇100 μl/孔；充分振荡吹打后，静置20分钟，用检测波长570 nm参考波长630 nm比色分析。
3.局部组织块大体形态观察：HE染色，光镜下组织学细胞分析。
六、统计方法
两样本均数差异显著性用t检验。
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结 果
一、 各移植组细胞毒反应结果(图1)
由图1可见，未处理组在整个观察期中，其细胞毒活性明显高于其余各组(P<0.01)；处理各组与自体组比,其活性亦高于自体组(P<0.05)，而在各处理组之间无显著性差异(P>0.05)。
图1 术后观察时段细胞毒结果
二、 各移植组局部组织匀浆IL-2活性水平(表1)
表1 各移植组局部组织匀浆IL-2 活性水平(
±s,U/ng) 组别, http://www.100md.com
鼠数
术后时间(天)
2
7
14
28
42
冷冻干燥组
6
0.55±0.02**△△
0.27±0.05**△△
0.21±0.06
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0.15±0.02
0.14±0.03
深冷冻组
6
0.65±0.12**△△
0.48±0.04**△△▲▲
0.19±0.03
0.14±0.04
0.11±0.01
冷冻组
6
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0.29±0.06**△△
0.24±0.01
0.14±0.01
0.13±0.01
未处理组
6
0.92±0.04
0.69±0.08
0.17±0.02
0.19±0.06
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0.15±0.08
自体组
6
0.20±0.04
0.20±0.02
0.11±0.01
0.12±0.01
0.13±0.02
各处理组与未处理组比较：**P<0.01 各处理组与自体组比较：△△ P<0.01 深冷冻组与冻干、冷冻组比较：▲▲P<0.01 由表1可见，术后2天各组的IL-2活性水平达到高峰；术后2，7天各处理组与未处理组均有显著性差异(P<0.01)，各处理组与自体组之间也有显著性差异(P<0.01)；术后7天各处理组之间还见到深冷冻组(-196℃)与冻干、冷冻组有显著性差异(P<0.01)；14天后IL-2活性水平显著下降。
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三、组织形态学观察结果
未处理组切口局部隆起，腱周组织高度水肿，镜下观察以大量淋巴细胞浸润为主，另有少量Mφ及中性粒细胞，淋巴细胞浸润持续整个实验观察时段。处理各组局部肿胀较未处理组显著减轻，镜下有较多的淋巴细胞及单核细胞浸润，亦持续整个观察时段。自体组术后腱周水肿不明显，镜下早期以中性粒细胞浸润为主，随后有单核细胞浸润，于14天后同正常结构。
讨 论
1.Graham等[3]报告，组织经过冷冻及解冻过程能使其表面的组织相容性抗原破坏、变性，降低其抗原性。冷冻法有冻干法、深冷冻法(-196℃)和冷冻法(-80℃)。笔者将此法成功地应用于BALB/L小鼠肌袋模型，植入C57小鼠跟腱，观察宿主体内的免疫排斥反应。
2.许多研究证明，淋巴细胞毒与排斥反应的发生、移植物的预后密切相关，排斥前、中即可测到淋巴细胞杀伤率增高[4]。从本实验看，未处理组淋巴细胞杀伤率在整个观察时段明显高于处理各组；各处理组淋巴细胞杀伤率虽明显低于未处理组，但仍高于自体组。可见经冷冻或干燥处理后同种异体腱移植使宿主体内产生免疫排斥反应显著降低，而不是消失。这种现象亦被局部组织学表现所证实。
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3.免疫排斥反应是多细胞及其因子参与的复杂过程，对血清和组织IL-2生物活性水平的测定，可反映排斥反应的大小[5]。本实验异体腱植入后第2天，组织匀浆中各组IL 活性水平达到高峰，这可能与手术创伤所引起的应激反应有关。术后2，7天未处理组IL-2水平明显高于各组，各处理组与自体组之间亦有显著性差异，提示经冷冻/冻干处理后免疫反应减弱而仍存在，这与细胞毒实验及组织学观察相符。术后7天，各处理组之间B组(-196℃)IL-2水平明显高于A、C组，提示B组的排斥反应较强。分析原因，可能与-196℃在较好保存组织活性的同时，也相对地保存了其抗原性有关。提示我们在维持其原有生物学活性的同时，还应采用更为有力的灭活细胞抗原性的措施[6，7]，这种现象在细胞毒试验中未反应出来。术后14天各组IL-2活性均明显下降，已不能用于判别有无排斥反应。由此笔者得出以下结论：⑴冷冻和冷冻干燥处理可降低异体腱组织的抗原性，使免疫排斥反应显著降低，但未能消失；⑵深冷冻良好保存异体肌腱细胞活性的同时，亦相对地保存了抗原性；⑶各组局部组织学改变与微量细胞毒反应有更显著的相关性。
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参考文献
1 杨廷彬,尹学念,主编.实用免疫学.第1版.长春：长春出版社,1994. 604.
2 杨廷彬,尹学念,主编.实用免疫学.第1版.长春：长春出版社,1994. 592.
3 Graham WC,Smith DA. The use of frozen stored tendons for grafting: an experimental study.J Bone Joint Surg(Am)， 1959, 37:624
4 夏穗生，主编.器官移植学.第1版.上海：上海科技出版社,1995. 43.
5 Theze J, Alzari PM, Bertoglio J. Interleukin-2 and its receptors： recent advances and new immunological functions. Immunol Today， 1996, 17∶481-486
6 鄂征,主编.组织培养技术. 第1版. 北京：人民卫生出版社,1982. 114.
7 Pinkowski JL,Rodrigo JJ,Sharkey NA,et al.Immune response to nonspecific and altered tissue antigen in soft tissue allografts.Clin Orthop Rel Res,1996,323:80-85
收稿日期：1998-09-24
修稿日期：1999-04-18, http://www.100md.com