冷冻保存神经后自体和异体移植的实验研究
作者：王秋根 崔 义 应 明 鲁树荣 徐卫东 年申生
单位：第二军医大学长海医院骨科，上海，200433；崔 义：第二军医大学长海医院电生理室
关键词：神经移植；移植免疫学
第二军医大学学报991025 摘要 目的:探讨冷冻保存神经自体和异体移植对神经再生的影响。方法：40只SD大鼠用反复冷冻、复温的神经和未经任何处理的坐骨神经移植体，进行自体和异体移植。A组为冷冻神经移植于自体原位中；B组为冷冻神经移植于异体中；C组为未冷冻神经移植于异体中；D组为未冷冻神经移植于自体原位中。术后6，12周光镜、电镜下行组织学观察，检测各项电生理指标。结果：A组可见到较多的再生轴突通过移植体；B组可以看到炎性细胞侵润，但仍可见再生轴突通过移植体；C组可见到大量炎性细胞侵润，有极少量再生轴突通过移植体；D组可见到大量再生轴突通过移植体。电生理指标和伸趾长肌恢复率A，D两组明显好于B，C两组。结论：神经冷冻处理可以降低抗原性，本实验为同种异体神经移植提供理论依据。
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中图分类号 R 622.3 文献标识码：A
Regeneration of allogenic nerve graft following cryopreservation: an experimental observation in rats
Wang Qiugen, Cui Yi, Ying Ming, Lu Shurong, Xu Weidong, Nian Shengsheng
(Department of Orthopedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the regeneration of allogenic and autogenous nerve graft following cryopreservation. Methods: Forty SD rats were used. Allogenic and autogenous were performed using the sciatic nerve root with or without cryopreservation. In group A, a segment of the transected nerve was transplanted into the sciatic nerve of the same rat after freezing and thawing. In group B, a segment of the transected nerve treated with the same procedure was transplanted into the sciatic nerve of another rat. The grafts without cryotreatment in group C,D were transplanted in the same manner with A,B respectively. Six and 12 weeks after grafting, the graft and host nerve were examined with light and electron microscopy and eletro-physiological. Results: In group A, many regenerative axons grow into the graft. Inflammatory cells infiltration was observed in group B and regenerative axons were observed too. In group C, large amount of inflammatory cells were observed with a few axon regeneration. A lot of axons grew into the graft in group D. Electro-physiological study showed that the results of group A,D were much betters. The statistical difference was significant. Conclusion: Cryotreatment of graft can decrease its immunogenecity, which is beneficial in allograft.
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KEY WORDS nerve transfer; transplantation immunology
同种神经的移植已做了大量的临床和实验研究[1～4]，至今仍没有在临床广泛使用，主要原因在于移植后免疫排斥反应。由于自体神经移植的局限性，同种异体移植引起了临床医师的重视。实验证明神经反复冷冻、复温可杀灭神经膜细胞的活性[1]。本研究观察了冷冻保存神经自体和异体移植后对神经再生的影响，以探讨冷冻保存神经移植后对鼠轴突再生的影响。
1 材料和方法
1.1 动物及神经准备 采用SD雄性大鼠40只，体质量(250±20) g。随机分为4组，每组10只。A组：经反复冷冻、复温的神经移植于自体原位中。B组：经反复冷冻、复温的神经移植于异体鼠中。C组：未经冷冻的神经移植于异体鼠中。D组：未经冷冻的神经移植于自体原位中。冷冻温度为-196℃，时间为20 min，然后放置室温(25℃)中复温20 min，反复5次，此作为冷冻后移植体。非冷冻移植体，不经任何处理。
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1.2 实验方法 用0.25%硫喷妥钠10 mg/kg注入大鼠腹腔麻醉，以俯卧位固定于手术板上。在手术显微镜下，自股二头肌与半腱肌和半膜肌肌间隙剪开结缔组织，钝性分离股二头肌与半腱肌，显露坐骨神经。从犁状肌孔下0.5 cm处，整齐切断并切除神经干1.0 cm。然后选择粗细相等的已冷冻过的移植体1.0 cm，移植于自体原位和异体中。非冷冻移植体1.0 cm，不经任何处理，同样移植于自体原位和异体中，用11-0尼龙线缝合神经外膜4～6针。术后不用任何药物，所有大鼠实验条件完全一致。
1.3 观察项目 各组分别于术后6及12周各取5只进行评价。取下受体鼠坐骨神经的近端、远端及移植体，全部切成长约3 mm的神经段作切片，厚度分别为8和24 μm，进行染色，并对其免疫细胞的分布、移植体中再生的轴突数进行比较。同时切取双侧伸趾长肌，称量，并进行对比判定。
1.3.1 组织学观察 (1) 光镜观察：将标本置于3%戊二醛中固定24 h，温度为4℃。后用1% OsO4固定1.5 h，逐级乙醇脱水，用EPON812定向包埋，用超薄切片机切片，厚度约0.5 μm，以1%甲苯胺蓝染色。(2)电镜观察：取B组术后12周异体神经中部，用超薄切片机切片，脱水后行醋酸钠染色。
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1.3.2 轴突计数 术后12周每组取5只大鼠，在移植体中段随机取视野，在光镜400倍下计算1.0 cm中轴突数。
1.3.3 电生理学观察 各组分别于术后6及12周各取5只大鼠行电生理测定。电生理测定仪器用丹麦生产Conterpoint肌电描记仪，频率为1 s-1，强度6 mA测定运动神经传导速度、波幅、潜伏期等。室温21～25℃。刺激电极置于移植神经近端，两刺激电极距离为2.0 cm。记录电极斜行45°插入胫前肌肌腹中部。
1.3.4 伸趾长肌恢复率 每组术后12周取5只大鼠，取下双侧伸趾长肌并称量，计算恢复率。
1.4 统计学处理 数据以
表示，采用t检验。
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2 结 果
2.1 组织学观察 A组：6周时可见较多的再生轴突通过移植体，水肿较轻，再生的轴突长入移植体近侧端，12周时许多轴突通过移植体全长，并长入远侧端的神经中。轴突发育良好，近似于正常，轴索间水肿较轻。B组：6周时可以看到少量的单核细胞浸润，水肿较明显，但仍可见再生轴突通过移植体，12周时再生轴突已通过移植体的全长，轴突密度较高，神经膜细胞增生明显，轴索间水肿减轻，但较A组略差。在电镜中可见新生的血管在移植体中形成，神经纤维近似于正常，但数量明显减少，仍可见少量异物巨细胞及淋巴细胞浸润。C组：移植物的不同地方，出现广泛的单核细胞浸润，以6周时最为明显，整个移植体均被单核细胞浸润，表明排斥反应严重，在移植体中，有极少量的轴突再生。12周时移植体变细，大量瘢痕组织增生，水肿明显。可见极少量的神经膜细胞和再生轴突，较其他各组均差。D组：6周时，有大量神经膜细胞柱状排列，并围以神经纤维束。12周时，整个神经移植体均被再生轴突充满，有髓纤维排列整齐，很多轴突已穿过移植物体，进入远侧神经。轴突发育良好，比上述各组明显好。
, 百拇医药
2.2 轴突计数 A，B，C，D组分别为90.00±2.33，89.60±4.15，13.60±2.35，94.40±5.22。
2.3 电生理观察 以振幅面积(ms.mV)为主进行比较，D组最高(16.65±1.54)，其次为A组(15.02±1.51)和B组(12.44±0.75)，最差为C组(4.84±0.78)。A，B，D组与C组比较有显著性差异(P<0.01)。
2.4 伸趾长肌的恢复率 A组为(65.07±6.03)%;B组为 (56.25±5.76)%;C组为(34.95±6.12)%;D组为(74.68±2.17)%。
3 讨 论
关于降低异体神经移植抗原性的研究[1～4]结果均不理想。通过本实验的组织学观察，测定移植体中再生的轴突数、伸趾长肌恢复率，发现冷冻和非冷冻神经移植其组织学改变不同。非冷冻移植(C组)也可再生轴突，但其数量极少，移植神经内被大量的淋巴细胞和巨噬细胞占据，并浸润损害了神经细胞内膜组织，包括基底膜管，因此阻碍了移植神经中轴突的通过。B组经反复冷冻、复温处理后的供者神经膜细胞和髓鞘已被损害， 所以在早期即可被移植神经中的巨噬细胞清除，神经膜细胞基底膜在细胞清除后仍保持完整，未显示严重的免疫排斥反应，并作为同种神经移植再生轴突的通道。反复冷冻、复温可明显降低神经抗原性，且不破坏基底膜管，为神经再生提供良好的通道。A和D组均属自体原位移植，不存在排斥反应，因此轴突再生率高，电生理检查和伸趾长肌的恢复率接近正常。由于A组经过反复冷冻、复温，一些组织遭到破坏，移植体内血管建立较D组慢，故再生率稍差。提倡正常神经自体移植应尽量不破坏神经组织，避免深低温冷冻处理。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0786-03
参考文献
1 王秋根，应 明，鲁树荣. 不同温度时间保存异体神经移植后病理变化[J]. 中华骨科杂志，1995，15(11)：736
2 Tajima K, Ide C. Regeneration through nerve allografts in the cynomolus monkey (macaca fascicularis)[J]. J Bone Joint Surg (Am), 1991, 93(2):172
3 Ide C, Osama T, Tohyaa K. Nerve regeneration through allogeneic nerve grafts, with special reference to the role of the schwann cell basal lamina[J]. Prog Neurobiol, 1990, 34(4):1
4 Gulatic AK, Cole GP. Nerve graft immunogenicity as a factor determining axonal in the rat[J]. J Neurosurg, 1990, 72(1): 138
(1999-03-17收稿，1999-07-11修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院骨科，上海，200433；崔 义：第二军医大学长海医院电生理室
关键词：神经移植；移植免疫学
第二军医大学学报991025 摘要 目的:探讨冷冻保存神经自体和异体移植对神经再生的影响。方法：40只SD大鼠用反复冷冻、复温的神经和未经任何处理的坐骨神经移植体，进行自体和异体移植。A组为冷冻神经移植于自体原位中；B组为冷冻神经移植于异体中；C组为未冷冻神经移植于异体中；D组为未冷冻神经移植于自体原位中。术后6，12周光镜、电镜下行组织学观察，检测各项电生理指标。结果：A组可见到较多的再生轴突通过移植体；B组可以看到炎性细胞侵润，但仍可见再生轴突通过移植体；C组可见到大量炎性细胞侵润，有极少量再生轴突通过移植体；D组可见到大量再生轴突通过移植体。电生理指标和伸趾长肌恢复率A，D两组明显好于B，C两组。结论：神经冷冻处理可以降低抗原性，本实验为同种异体神经移植提供理论依据。
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中图分类号 R 622.3 文献标识码：A
Regeneration of allogenic nerve graft following cryopreservation: an experimental observation in rats
Wang Qiugen, Cui Yi, Ying Ming, Lu Shurong, Xu Weidong, Nian Shengsheng
(Department of Orthopedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the regeneration of allogenic and autogenous nerve graft following cryopreservation. Methods: Forty SD rats were used. Allogenic and autogenous were performed using the sciatic nerve root with or without cryopreservation. In group A, a segment of the transected nerve was transplanted into the sciatic nerve of the same rat after freezing and thawing. In group B, a segment of the transected nerve treated with the same procedure was transplanted into the sciatic nerve of another rat. The grafts without cryotreatment in group C,D were transplanted in the same manner with A,B respectively. Six and 12 weeks after grafting, the graft and host nerve were examined with light and electron microscopy and eletro-physiological. Results: In group A, many regenerative axons grow into the graft. Inflammatory cells infiltration was observed in group B and regenerative axons were observed too. In group C, large amount of inflammatory cells were observed with a few axon regeneration. A lot of axons grew into the graft in group D. Electro-physiological study showed that the results of group A,D were much betters. The statistical difference was significant. Conclusion: Cryotreatment of graft can decrease its immunogenecity, which is beneficial in allograft.
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KEY WORDS nerve transfer; transplantation immunology
同种神经的移植已做了大量的临床和实验研究[1～4]，至今仍没有在临床广泛使用，主要原因在于移植后免疫排斥反应。由于自体神经移植的局限性，同种异体移植引起了临床医师的重视。实验证明神经反复冷冻、复温可杀灭神经膜细胞的活性[1]。本研究观察了冷冻保存神经自体和异体移植后对神经再生的影响，以探讨冷冻保存神经移植后对鼠轴突再生的影响。
1 材料和方法
1.1 动物及神经准备 采用SD雄性大鼠40只，体质量(250±20) g。随机分为4组，每组10只。A组：经反复冷冻、复温的神经移植于自体原位中。B组：经反复冷冻、复温的神经移植于异体鼠中。C组：未经冷冻的神经移植于异体鼠中。D组：未经冷冻的神经移植于自体原位中。冷冻温度为-196℃，时间为20 min，然后放置室温(25℃)中复温20 min，反复5次，此作为冷冻后移植体。非冷冻移植体，不经任何处理。
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1.2 实验方法 用0.25%硫喷妥钠10 mg/kg注入大鼠腹腔麻醉，以俯卧位固定于手术板上。在手术显微镜下，自股二头肌与半腱肌和半膜肌肌间隙剪开结缔组织，钝性分离股二头肌与半腱肌，显露坐骨神经。从犁状肌孔下0.5 cm处，整齐切断并切除神经干1.0 cm。然后选择粗细相等的已冷冻过的移植体1.0 cm，移植于自体原位和异体中。非冷冻移植体1.0 cm，不经任何处理，同样移植于自体原位和异体中，用11-0尼龙线缝合神经外膜4～6针。术后不用任何药物，所有大鼠实验条件完全一致。
1.3 观察项目 各组分别于术后6及12周各取5只进行评价。取下受体鼠坐骨神经的近端、远端及移植体，全部切成长约3 mm的神经段作切片，厚度分别为8和24 μm，进行染色，并对其免疫细胞的分布、移植体中再生的轴突数进行比较。同时切取双侧伸趾长肌，称量，并进行对比判定。
1.3.1 组织学观察 (1) 光镜观察：将标本置于3%戊二醛中固定24 h，温度为4℃。后用1% OsO4固定1.5 h，逐级乙醇脱水，用EPON812定向包埋，用超薄切片机切片，厚度约0.5 μm，以1%甲苯胺蓝染色。(2)电镜观察：取B组术后12周异体神经中部，用超薄切片机切片，脱水后行醋酸钠染色。
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1.3.2 轴突计数 术后12周每组取5只大鼠，在移植体中段随机取视野，在光镜400倍下计算1.0 cm中轴突数。
1.3.3 电生理学观察 各组分别于术后6及12周各取5只大鼠行电生理测定。电生理测定仪器用丹麦生产Conterpoint肌电描记仪，频率为1 s-1，强度6 mA测定运动神经传导速度、波幅、潜伏期等。室温21～25℃。刺激电极置于移植神经近端，两刺激电极距离为2.0 cm。记录电极斜行45°插入胫前肌肌腹中部。
1.3.4 伸趾长肌恢复率 每组术后12周取5只大鼠，取下双侧伸趾长肌并称量，计算恢复率。
1.4 统计学处理 数据以
表示，采用t检验。, 百拇医药
2 结 果
2.1 组织学观察 A组：6周时可见较多的再生轴突通过移植体，水肿较轻，再生的轴突长入移植体近侧端，12周时许多轴突通过移植体全长，并长入远侧端的神经中。轴突发育良好，近似于正常，轴索间水肿较轻。B组：6周时可以看到少量的单核细胞浸润，水肿较明显，但仍可见再生轴突通过移植体，12周时再生轴突已通过移植体的全长，轴突密度较高，神经膜细胞增生明显，轴索间水肿减轻，但较A组略差。在电镜中可见新生的血管在移植体中形成，神经纤维近似于正常，但数量明显减少，仍可见少量异物巨细胞及淋巴细胞浸润。C组：移植物的不同地方，出现广泛的单核细胞浸润，以6周时最为明显，整个移植体均被单核细胞浸润，表明排斥反应严重，在移植体中，有极少量的轴突再生。12周时移植体变细，大量瘢痕组织增生，水肿明显。可见极少量的神经膜细胞和再生轴突，较其他各组均差。D组：6周时，有大量神经膜细胞柱状排列，并围以神经纤维束。12周时，整个神经移植体均被再生轴突充满，有髓纤维排列整齐，很多轴突已穿过移植物体，进入远侧神经。轴突发育良好，比上述各组明显好。
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2.2 轴突计数 A，B，C，D组分别为90.00±2.33，89.60±4.15，13.60±2.35，94.40±5.22。
2.3 电生理观察 以振幅面积(ms.mV)为主进行比较，D组最高(16.65±1.54)，其次为A组(15.02±1.51)和B组(12.44±0.75)，最差为C组(4.84±0.78)。A，B，D组与C组比较有显著性差异(P<0.01)。
2.4 伸趾长肌的恢复率 A组为(65.07±6.03)%;B组为 (56.25±5.76)%;C组为(34.95±6.12)%;D组为(74.68±2.17)%。
3 讨 论
关于降低异体神经移植抗原性的研究[1～4]结果均不理想。通过本实验的组织学观察，测定移植体中再生的轴突数、伸趾长肌恢复率，发现冷冻和非冷冻神经移植其组织学改变不同。非冷冻移植(C组)也可再生轴突，但其数量极少，移植神经内被大量的淋巴细胞和巨噬细胞占据，并浸润损害了神经细胞内膜组织，包括基底膜管，因此阻碍了移植神经中轴突的通过。B组经反复冷冻、复温处理后的供者神经膜细胞和髓鞘已被损害， 所以在早期即可被移植神经中的巨噬细胞清除，神经膜细胞基底膜在细胞清除后仍保持完整，未显示严重的免疫排斥反应，并作为同种神经移植再生轴突的通道。反复冷冻、复温可明显降低神经抗原性，且不破坏基底膜管，为神经再生提供良好的通道。A和D组均属自体原位移植，不存在排斥反应，因此轴突再生率高，电生理检查和伸趾长肌的恢复率接近正常。由于A组经过反复冷冻、复温，一些组织遭到破坏，移植体内血管建立较D组慢，故再生率稍差。提倡正常神经自体移植应尽量不破坏神经组织，避免深低温冷冻处理。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0786-03
参考文献
1 王秋根，应 明，鲁树荣. 不同温度时间保存异体神经移植后病理变化[J]. 中华骨科杂志，1995，15(11)：736
2 Tajima K, Ide C. Regeneration through nerve allografts in the cynomolus monkey (macaca fascicularis)[J]. J Bone Joint Surg (Am), 1991, 93(2):172
3 Ide C, Osama T, Tohyaa K. Nerve regeneration through allogeneic nerve grafts, with special reference to the role of the schwann cell basal lamina[J]. Prog Neurobiol, 1990, 34(4):1
4 Gulatic AK, Cole GP. Nerve graft immunogenicity as a factor determining axonal in the rat[J]. J Neurosurg, 1990, 72(1): 138
(1999-03-17收稿，1999-07-11修回), 百拇医药