大块冷冻同种异体骨移植后免疫学改变
作者：屠重棋 龚全 裴福兴 杨天府 胡云洲
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院骨科
关键词：骨肿瘤；移植，同种；骨移植；冷冻；组织保存；移植免疫学
中华骨科杂志000708
【摘要】目的 探讨大块冷冻同种异体骨移植后免疫功能改变。方法 本组21例，男9例，女12例；年龄19～59岁，平均30.5岁。15例分别于术前4d及术后14、28d检测其空腹外周血各项免疫学指标，其中7例及另外3例分别于术后3、6、9、12、24、36、48个月进行同位素骨扫描检查，结合3例组织学检查综合观察21例大块冷冻同种异体骨移植后的免疫反应。结果 (1)外周血T淋巴细胞亚群(OKT3+,OKT4+,OKT8+)及血清补体(C3,C4)和循环免疫复合物(CiC)手术前后比较，差异无显著性意义(P>0.05)。(2)同位素骨扫描显示:术后3～6个月移植的异体骨两端及髓腔内同位素浓集明显低于正常骨，而异体骨两端所对应的自体骨端同位素浓集明显于高于正常骨，此过程于植入后9个月开始减弱，可达数年。以宿主受区大量T淋巴细胞为主的炎性细胞浸润为其组织学特征。结论 (1)大段冷冻异体骨移植后宿主全身免疫机能改变不明显，其反应是以局部炎症为主的细胞免疫过程。(2)异体骨可作为修复大块骨缺损的良好材料。
, 百拇医药
Immuno-functional changes following massive frozen allograft
TU Chongqi， GONG Quan， PEI Fuxing， et al .
(Department of Orthopaedics, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
【 Abstract】 Objective To study immunoreativity of massive frozen allograft following operation. Methods Immunoreaction of frozen allograft was studied in 21 cases of bone tumors by detection of T- lymphocytes, complements and circulating immune complex(CiC) at 4 days preoperatively and 14,28 days postoperatively in 15 cases, bone scans of 99mTe SPECT at 3,6,9， 12,24,26,48 mouths in 7 of aforementioned 15 and another 3, and biomicroscopy in 3 cases. Results 1)There was no significant difference in OKT3+ OKT4+, OKT8+, C 3, C 4 and CiC of peripheral blood between pre-and post-operation samples. 2) Bone scans using 99mTe SPECT showed high concentration of isotope at host bone against frozen allograft, lasting for years. Chronic cellular immunoreaction being the main feature around the allograft region was verified by biomicroscopy. Conclusion Host-versus-graft reactions following operation were not evident; no hyper-acute or acute rejection was seen. Allograft as a satisfactory repair material is worth applying in reconstruction of massive bony defect.
, 百拇医药
【 Key words】 Bone neoplasms; Transplantation, homologous; Bone transplantation; Freezing; Tissue preservation; Transplantation immunology
自1908年Eric[1]首次报告同种异体骨移植的临床经验至今，大量的研究证实深低温冷冻异体骨具有良好的自然结构、形态、强度及骨诱导能力，异体骨移植的基础和临床应用研究越来越受到重视。我院自1992～1999年采用冷冻异体骨移植修复股骨肿瘤切除后大块骨缺损21例，现就其移植后的免疫学改变予以分析。
资料与方法
本组21例，男9例，女12例；年龄19～59岁，平均30.5岁。股骨近段骨巨细胞瘤4例，纤维肉瘤2例，恶性纤维组织细胞瘤2例，纤维结构不良复发2例，骨膜骨肉瘤1例，软骨肉瘤1例，巨大骨溶解症1例；股骨远段骨巨细胞瘤3例，骨肉瘤3例，皮质旁骨肉瘤2例。按Enneking分期:良性3期4例；恶性ⅠB期7例,ⅡA期2例，ⅡB期8例。肿瘤骨段切除后骨缺损范围9～21cm，平均15.6cm。
, 百拇医药
一、同种异体骨的处理
按美国组织库协会(AATB)制定的基本标准，在严格无菌条件下进行异体骨的采集，彻底去除表面的软组织、骨膜及髓腔内组织，保留主要肌肉附丽点和关节软骨。生理盐水反复冲洗后置于质量浓度为1‰的新洁尔灭液浸泡2h，取三小块不同部位组织做需氧和厌氧菌培养，阳性者弃用，阴性者用三层无菌巾包裹置于-80℃深低温冰箱保存。
二、术中及术后处理
股骨近段选用改良Smith-Pertersen或Watson-Jones切口显露髋关节、股骨上段和(或)髂骨前部外板。股骨远段选用前正中切口显露股骨远段及膝关节。肿瘤段骨切除后，采用两种修复方法：(1)髋或膝关节加压融合术。异体松质骨段移植，鹅颈形钢板或带锁髓内钉固定，同时行带肌蒂骨瓣转移，共9例。(2)股骨近段或远段半关节移植成形术。选用大小合适的异体股骨近段或远段，髓腔内植入自体红骨髓及自体髂骨，采用AO135°钢板、DHS或DCS内固定，重建臀中肌、臀大肌和髂腰肌止点或前后交叉韧带和侧副韧带起点，共12例。除1例髋关节加压融合内固定欠牢，术后采用髋“人”字石膏固定外，其余均未外固定，术后2周即开始CPM，3个月后扶拐下地活动。
, http://www.100md.com
图1股骨远段恶性骨巨细胞瘤a术前b术后4年图2股骨近段恶性纤维组织细胞瘤a术前b术后3个月c术后3个月同位素骨扫描像
三、免疫学检测
15例分别于术前4d及术后14、28d抽取外周空腹血，检测血T淋巴细胞亚群(OKT3+、OKT4+、OKT8+)(按APAAP桥联酶标法)、血清补体(C3、C4)及循环免疫复合物(CiC)(按速率散射比浊法)。
四、同位素骨扫描检查
术后3、6、9、12、24、36、48个月进行同位素骨扫描检查，1年者7例，2年者3例，3年者2例，4年者2例。
五、组织学检查
2例分别于术后2.2年和4年发生病理性骨折(图1)；1例于术后2年因髋关节骨性关节炎行人工全髋置换而取材进行组织学检查。
, 百拇医药
结果
一、免疫学改变
外周血T淋巴细胞亚群、血清补体及循环免疫复合物结果见表1、2，经统计学处理差异无显著性意义(P>0.05)。
二、同位素骨扫描
术后3～6个月，移植的异体骨两端及髓腔内同位素浓集明显低于正常骨，而异体骨两端所对应的自体骨端同位素浓集明显高于正常骨(图2)。术后9～12个月，自体骨浓集区逐渐减弱，但仍高于正常骨，而异体骨段显影较前清晰，以两端明显，但仍低于正常骨。
三、组织学检查
3例分别于术后2～4年因病理性骨折或骨关节炎而行组织学检查，结果显示移植骨浅层有区域性纤维血管组织长入，浅层骨组织血管化，而深层仍为死骨；以宿主受区大量的T淋巴细胞和巨噬细胞浸润的炎性反应为特征。
, http://www.100md.com
四、移植后的关节功能
本组病例随访1～6年。在9例行髋或膝关节融合术的患者中，1例因肿瘤复发行髋解脱术，其余患侧膝或髋关节活动正常。7例股骨近段半关节移植者的髋关节活动度为63°～98°，平均72°。5例股骨远段半关节移植者，1例因感染行股骨上1/3截肢术，4例患膝关节活动度为33°～75°，平均46°。按Harris髋关节功能评分标准:髋融合者82.40分,髋成形者71.70分。按Hss膝关节功能评分标准:膝融合者72.50分,膝成形者58.50分。
表1异体骨移植手术前后外周血T淋巴细胞亚群比较(
±s)
时间 OKT3(%) OKT4(%) OKT8(%) OKT4/OKT8 术前 53.17±11.28 36.27±7.55 28.32±5.12 1.28±0.03 术后14d 53.36±10.67 37.78±9.15 29.44±7.03 1.29±0.06 术后28d 53.45±11.37 38.17±8.64 28.87±6.25 1.32±0.08 注:表示与移植前相比较P>0.05
, http://www.100md.com
表2异体骨移植手术前后血清补体和循环免疫复合物比较(±s)
时间 C3(g/L) C4(g/L) CiC(OD) 术前 1.08±0.43 0.26±0.02 0.16±0.09 术后14d 1.12±0.23 0.26±0.07 0.16±0.07 术后28d 1.07±0.67 0.25±0.11 0.14±0.03
注:表示与移植前相比较P>0.05
讨论
同种异体骨移植的抗原有两大类，即Ⅰ类抗原和Ⅱ类抗原。主要存在于骨髓的造血细胞、血管内皮细胞、树突细胞、巨噬细胞和骨细胞[2]。研究证实，Ⅰ类抗原分子主要为细胞毒性T细胞(即CD8+细胞)识别自我提供标记，可用OKT8单克隆抗体检测。Ⅱ类抗原分子主要用于激活免疫调节细胞(即CD4+细胞)，可用OKT4检测。CD3+代表外周血总T淋巴细胞，可用OKT3检测。OKT4细胞属于辅助T细胞，具有促进效应T细胞的作用，与抑制T细胞的OKT8细胞的免疫调节作用相反，两者共同维持免疫系统的平衡。OKT4/OKT8细胞之间比率是骨移植免疫的一个重要相关指标[3]。血清补体和免疫复合物能促进调整细胞和体液免疫反应，因此可作为骨移植免疫反应的另一相关指标。本组病例中，OKT4、OKT8及OKT3于手术前、后差异均无显著性意义(P>0.05)，反映移植的异体骨经冷冻处理后Ⅰ、Ⅱ类抗原性极弱，不易引起超、急排异反应。补体C3、C4及CiC手术前、后差异无显著性意义(P>0.05)，说明移植后宿主的体液免疫反应不明显。结合正常临床表现，我们推论:冷冻大块同种异体骨移植后机体的全身免疫反应不明显。其原因可能是:(1)深低温冷冻处理破坏了异体骨各种细胞表面的抗原结构，从而降低了其抗原性[4]；(2)在冻融前后，采用髓腔刷和高压脉冲，反复冲刷髓内组织，从而清除了产生排斥反应的重要免疫致敏原。同位素骨扫描显示移植的异体骨段所对应或相连的自体骨端同位素浓集明显高于正常对称部位，提示冷冻异体骨段植入人体后，宿主的反应是以局部炎症为主的免疫过程，此过程在植入9个月后逐渐开始减弱。组织学改变说明此过程2～4年仍存在，主要为细胞免疫反应，这可能与异体骨在成活替代或吸收过程中，缓慢释放具有极弱抗原性的有机物质有关[5]。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Eric Lexer. The classic joint transplantation. Clin Orthop, 1985, (197):4- 10.
2，Horowitz MC, Friedlaeder GE. Induction of specific T- cell responsiveness to allogeneic bone. J Bone Joint Surg (Am), 1991,73:1157- 1168.
3，Schandene L,Vanden Steen F,Romasco F,et al.Active T rosettes, human autologous T rosetts, OKT8 and OKT4 cells,con A-induced suppressive activity, and autoantibodies: clinical correlations.Clin Immunol Immunopathol, 1983，28:147-154.
4，Elves MW. Humoral immune response to allografts of bone. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1974, 47:708- 715.
5，Enneking WF, Mindell ER. Observations on massive retrieved human allografts. J Bone Joint Surg (Am), 1991, 73:1123- 1142.
(收稿日期:2000-03-14), 百拇医药
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院骨科
关键词：骨肿瘤；移植，同种；骨移植；冷冻；组织保存；移植免疫学
中华骨科杂志000708
【摘要】目的 探讨大块冷冻同种异体骨移植后免疫功能改变。方法 本组21例，男9例，女12例；年龄19～59岁，平均30.5岁。15例分别于术前4d及术后14、28d检测其空腹外周血各项免疫学指标，其中7例及另外3例分别于术后3、6、9、12、24、36、48个月进行同位素骨扫描检查，结合3例组织学检查综合观察21例大块冷冻同种异体骨移植后的免疫反应。结果 (1)外周血T淋巴细胞亚群(OKT3+,OKT4+,OKT8+)及血清补体(C3,C4)和循环免疫复合物(CiC)手术前后比较，差异无显著性意义(P>0.05)。(2)同位素骨扫描显示:术后3～6个月移植的异体骨两端及髓腔内同位素浓集明显低于正常骨，而异体骨两端所对应的自体骨端同位素浓集明显于高于正常骨，此过程于植入后9个月开始减弱，可达数年。以宿主受区大量T淋巴细胞为主的炎性细胞浸润为其组织学特征。结论 (1)大段冷冻异体骨移植后宿主全身免疫机能改变不明显，其反应是以局部炎症为主的细胞免疫过程。(2)异体骨可作为修复大块骨缺损的良好材料。
, 百拇医药
Immuno-functional changes following massive frozen allograft
TU Chongqi， GONG Quan， PEI Fuxing， et al .
(Department of Orthopaedics, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
【 Abstract】 Objective To study immunoreativity of massive frozen allograft following operation. Methods Immunoreaction of frozen allograft was studied in 21 cases of bone tumors by detection of T- lymphocytes, complements and circulating immune complex(CiC) at 4 days preoperatively and 14,28 days postoperatively in 15 cases, bone scans of 99mTe SPECT at 3,6,9， 12,24,26,48 mouths in 7 of aforementioned 15 and another 3, and biomicroscopy in 3 cases. Results 1)There was no significant difference in OKT3+ OKT4+, OKT8+, C 3, C 4 and CiC of peripheral blood between pre-and post-operation samples. 2) Bone scans using 99mTe SPECT showed high concentration of isotope at host bone against frozen allograft, lasting for years. Chronic cellular immunoreaction being the main feature around the allograft region was verified by biomicroscopy. Conclusion Host-versus-graft reactions following operation were not evident; no hyper-acute or acute rejection was seen. Allograft as a satisfactory repair material is worth applying in reconstruction of massive bony defect.
, 百拇医药
【 Key words】 Bone neoplasms; Transplantation, homologous; Bone transplantation; Freezing; Tissue preservation; Transplantation immunology
自1908年Eric[1]首次报告同种异体骨移植的临床经验至今，大量的研究证实深低温冷冻异体骨具有良好的自然结构、形态、强度及骨诱导能力，异体骨移植的基础和临床应用研究越来越受到重视。我院自1992～1999年采用冷冻异体骨移植修复股骨肿瘤切除后大块骨缺损21例，现就其移植后的免疫学改变予以分析。
资料与方法
本组21例，男9例，女12例；年龄19～59岁，平均30.5岁。股骨近段骨巨细胞瘤4例，纤维肉瘤2例，恶性纤维组织细胞瘤2例，纤维结构不良复发2例，骨膜骨肉瘤1例，软骨肉瘤1例，巨大骨溶解症1例；股骨远段骨巨细胞瘤3例，骨肉瘤3例，皮质旁骨肉瘤2例。按Enneking分期:良性3期4例；恶性ⅠB期7例,ⅡA期2例，ⅡB期8例。肿瘤骨段切除后骨缺损范围9～21cm，平均15.6cm。
, 百拇医药
一、同种异体骨的处理
按美国组织库协会(AATB)制定的基本标准，在严格无菌条件下进行异体骨的采集，彻底去除表面的软组织、骨膜及髓腔内组织，保留主要肌肉附丽点和关节软骨。生理盐水反复冲洗后置于质量浓度为1‰的新洁尔灭液浸泡2h，取三小块不同部位组织做需氧和厌氧菌培养，阳性者弃用，阴性者用三层无菌巾包裹置于-80℃深低温冰箱保存。
二、术中及术后处理
股骨近段选用改良Smith-Pertersen或Watson-Jones切口显露髋关节、股骨上段和(或)髂骨前部外板。股骨远段选用前正中切口显露股骨远段及膝关节。肿瘤段骨切除后，采用两种修复方法：(1)髋或膝关节加压融合术。异体松质骨段移植，鹅颈形钢板或带锁髓内钉固定，同时行带肌蒂骨瓣转移，共9例。(2)股骨近段或远段半关节移植成形术。选用大小合适的异体股骨近段或远段，髓腔内植入自体红骨髓及自体髂骨，采用AO135°钢板、DHS或DCS内固定，重建臀中肌、臀大肌和髂腰肌止点或前后交叉韧带和侧副韧带起点，共12例。除1例髋关节加压融合内固定欠牢，术后采用髋“人”字石膏固定外，其余均未外固定，术后2周即开始CPM，3个月后扶拐下地活动。
, http://www.100md.com
图1股骨远段恶性骨巨细胞瘤a术前b术后4年图2股骨近段恶性纤维组织细胞瘤a术前b术后3个月c术后3个月同位素骨扫描像
三、免疫学检测
15例分别于术前4d及术后14、28d抽取外周空腹血，检测血T淋巴细胞亚群(OKT3+、OKT4+、OKT8+)(按APAAP桥联酶标法)、血清补体(C3、C4)及循环免疫复合物(CiC)(按速率散射比浊法)。
四、同位素骨扫描检查
术后3、6、9、12、24、36、48个月进行同位素骨扫描检查，1年者7例，2年者3例，3年者2例，4年者2例。
五、组织学检查
2例分别于术后2.2年和4年发生病理性骨折(图1)；1例于术后2年因髋关节骨性关节炎行人工全髋置换而取材进行组织学检查。
, 百拇医药
结果
一、免疫学改变
外周血T淋巴细胞亚群、血清补体及循环免疫复合物结果见表1、2，经统计学处理差异无显著性意义(P>0.05)。
二、同位素骨扫描
术后3～6个月，移植的异体骨两端及髓腔内同位素浓集明显低于正常骨，而异体骨两端所对应的自体骨端同位素浓集明显高于正常骨(图2)。术后9～12个月，自体骨浓集区逐渐减弱，但仍高于正常骨，而异体骨段显影较前清晰，以两端明显，但仍低于正常骨。
三、组织学检查
3例分别于术后2～4年因病理性骨折或骨关节炎而行组织学检查，结果显示移植骨浅层有区域性纤维血管组织长入，浅层骨组织血管化，而深层仍为死骨；以宿主受区大量的T淋巴细胞和巨噬细胞浸润的炎性反应为特征。
, http://www.100md.com
四、移植后的关节功能
本组病例随访1～6年。在9例行髋或膝关节融合术的患者中，1例因肿瘤复发行髋解脱术，其余患侧膝或髋关节活动正常。7例股骨近段半关节移植者的髋关节活动度为63°～98°，平均72°。5例股骨远段半关节移植者，1例因感染行股骨上1/3截肢术，4例患膝关节活动度为33°～75°，平均46°。按Harris髋关节功能评分标准:髋融合者82.40分,髋成形者71.70分。按Hss膝关节功能评分标准:膝融合者72.50分,膝成形者58.50分。
表1异体骨移植手术前后外周血T淋巴细胞亚群比较(
±s)时间 OKT3(%) OKT4(%) OKT8(%) OKT4/OKT8 术前 53.17±11.28 36.27±7.55 28.32±5.12 1.28±0.03 术后14d 53.36±10.67 37.78±9.15 29.44±7.03 1.29±0.06 术后28d 53.45±11.37 38.17±8.64 28.87±6.25 1.32±0.08 注:表示与移植前相比较P>0.05
, http://www.100md.com
表2异体骨移植手术前后血清补体和循环免疫复合物比较(
±s)时间 C3(g/L) C4(g/L) CiC(OD) 术前 1.08±0.43 0.26±0.02 0.16±0.09 术后14d 1.12±0.23 0.26±0.07 0.16±0.07 术后28d 1.07±0.67 0.25±0.11 0.14±0.03
注:表示与移植前相比较P>0.05
讨论
同种异体骨移植的抗原有两大类，即Ⅰ类抗原和Ⅱ类抗原。主要存在于骨髓的造血细胞、血管内皮细胞、树突细胞、巨噬细胞和骨细胞[2]。研究证实，Ⅰ类抗原分子主要为细胞毒性T细胞(即CD8+细胞)识别自我提供标记，可用OKT8单克隆抗体检测。Ⅱ类抗原分子主要用于激活免疫调节细胞(即CD4+细胞)，可用OKT4检测。CD3+代表外周血总T淋巴细胞，可用OKT3检测。OKT4细胞属于辅助T细胞，具有促进效应T细胞的作用，与抑制T细胞的OKT8细胞的免疫调节作用相反，两者共同维持免疫系统的平衡。OKT4/OKT8细胞之间比率是骨移植免疫的一个重要相关指标[3]。血清补体和免疫复合物能促进调整细胞和体液免疫反应，因此可作为骨移植免疫反应的另一相关指标。本组病例中，OKT4、OKT8及OKT3于手术前、后差异均无显著性意义(P>0.05)，反映移植的异体骨经冷冻处理后Ⅰ、Ⅱ类抗原性极弱，不易引起超、急排异反应。补体C3、C4及CiC手术前、后差异无显著性意义(P>0.05)，说明移植后宿主的体液免疫反应不明显。结合正常临床表现，我们推论:冷冻大块同种异体骨移植后机体的全身免疫反应不明显。其原因可能是:(1)深低温冷冻处理破坏了异体骨各种细胞表面的抗原结构，从而降低了其抗原性[4]；(2)在冻融前后，采用髓腔刷和高压脉冲，反复冲刷髓内组织，从而清除了产生排斥反应的重要免疫致敏原。同位素骨扫描显示移植的异体骨段所对应或相连的自体骨端同位素浓集明显高于正常对称部位，提示冷冻异体骨段植入人体后，宿主的反应是以局部炎症为主的免疫过程，此过程在植入9个月后逐渐开始减弱。组织学改变说明此过程2～4年仍存在，主要为细胞免疫反应，这可能与异体骨在成活替代或吸收过程中，缓慢释放具有极弱抗原性的有机物质有关[5]。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Eric Lexer. The classic joint transplantation. Clin Orthop, 1985, (197):4- 10.
2，Horowitz MC, Friedlaeder GE. Induction of specific T- cell responsiveness to allogeneic bone. J Bone Joint Surg (Am), 1991,73:1157- 1168.
3，Schandene L,Vanden Steen F,Romasco F,et al.Active T rosettes, human autologous T rosetts, OKT8 and OKT4 cells,con A-induced suppressive activity, and autoantibodies: clinical correlations.Clin Immunol Immunopathol, 1983，28:147-154.
4，Elves MW. Humoral immune response to allografts of bone. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1974, 47:708- 715.
5，Enneking WF, Mindell ER. Observations on massive retrieved human allografts. J Bone Joint Surg (Am), 1991, 73:1123- 1142.
(收稿日期:2000-03-14), 百拇医药