人乳腺癌裸鼠异种移植的研究
作者：李志洪 黄信孚 李吉友 柯扬 阳兰桂 王永信 姚丽华 吕允威 王培林
单位：黄信孚 李志洪 阳兰桂 姚丽华 吕允威 王培林(北京医科大学临床肿瘤学院 北京市肿瘤防治研究所外科100036)；李吉友(病理科)；柯扬(细胞遗传室)；王永信(细胞遗传室)
关键词：乳腺肿瘤；异种移植；转移；微卫星DNA
中华医学杂志001120
【摘要】 目的 研究人乳腺癌异种移植的自发转移、遗传稳定性和微转移的检测方法。方法 将人乳腺癌新鲜完整组织移植于裸鼠并连续传代，移植瘤细胞体外培养、再移植裸鼠并在3个微卫星位点分析人乳腺癌、裸鼠移植瘤及其转移灶的微卫星DNA。结果 原位移植的成瘤率为88.6%(31/35)、转移率为41.9%(13/31)。移植瘤细胞体外培养成功，其再移植裸鼠成瘤率和转移率均达100%。裸鼠移植瘤及其转移灶在3个位点与人乳腺癌具有相同的微卫星DNA。结论 完整组织原位移植法可提高人乳腺癌异种移植的成功率和转移率。异种移植瘤及其传代肿瘤保持了遗传稳定性。
, 百拇医药
A study on human breast carcinoma xenografts in nude mice
LI Zhihong HUANG Xinfu LI Jiyou
(Department of Surgery,The Clinical School of Oncology, Beijing University, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100036, China)
【Abstract】 Objective To study the spontaneous metastasis and the genetic stability of human breast carcinoma xenografts in nude mice and its micrometastasis. Methods The intact tissue of surgical specimens from breast carcinoma were xenografted into nude mice and transplanted from generation to generation. Cells from the xenografts were cultured in vitro and retransplanted into nude mice. Microsatellite DNA in genome of human breast carcinoma, xenotransplanted tumors and metastases in nude mice were analysed at three microsatellite loci. Results The tumorigenicity of orthotopic xenotransplantation was 88.6%(31/35) with a metastasis rate of 41.9%(13/31). Cells from the xenografts were cultured in vitro successfully, both the take rate of retransplantation into nude mice and the spontaneous lung metastasis rate were 100%(10/10). Microsatellite DNA sequences in genome of the xenotransplanted tumors and metastases in nude mice were identical with that of the original human breast carcinoma at the three microsatellite loci. Conclusions The tumorigenicity and metastasis potential can be improved in human breast carcinoma xenograft using the intact fresh tumor tissue and orthotopic graft. The xenotransplanted tumors and their passaged tumors maintained the genetic stability.The detection of microsatellite DNA may discover micrometastasis in the nude mice model.
, 百拇医药
【Key words】 Human breast cancer； Xenograft； Micrometastasis, microsatellite DNA
人乳腺癌是动物移植瘤中最难成功的肿瘤之一，发生转移尤难成功[1]，迄今人乳腺癌自发性转移动物模型极为少见，国内尚少见报道。作者利用完整组织原位移植法建立国内首例人乳腺癌转移动物模型，利用此模型研究了提高异种移植成功率和转移率的方法，建立了一人乳腺癌高转移细胞系，鉴定了人乳腺癌异种移植的遗传稳定性，提出了一种检测微转移的方法，现报道如下。
材料和方法
一、材料
1.实验动物:BALB/C，nu/nu裸小鼠(中国人民解放军军事医学科学院提供)，鼠龄4～6周，体重13～20 g，雌性，无菌条件下饲养。
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2.标本来源：采自本院外科4例病理学诊断明确之新鲜乳腺癌手术标本。
3.主要试剂：甲基纤维素、秋水仙素、Rnase A、蛋白酶K、引物(表1)、TaqDNA聚合酶、dNTP、聚丙烯酰胺凝胶(Gibco)，小牛血清、琼脂(均由中山公司提供)。
表1 微卫星引物 染色体
位点
杂合度
(%)
染色体定位
重复
类型
产物大小
, 百拇医药
(bp)
14
D14S68
0.892
14q24.3-gter
DI*
148-172
18
D18S69
0.792
18q21.1-q21.3
DI
, 百拇医药
192-210
20
D20S199
0.670
20
DI
108-126
*DI Dinucleotide
二、方法
1.异种移植及鼠间传代：戊巴比妥钠裸鼠腹腔内注射麻醉，标本取出后切取直径6 mm瘤块剪成1 mm3组织块，种植于裸鼠乳腺脂肪垫(mfp，原位移植)或背部皮下(sc，皮下移植)。待裸鼠濒死时处死，取直径6 mm瘤块剪成1 mm3组织块，种植入下一代裸鼠原位移植或皮下移植s，依次连续传代。
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2.病理学检查：裸鼠濒死时处死，观察四肢根部淋巴结是否肿大，肝、肺有无转移结节，将移植瘤、肿大淋巴结、肝、肺部分置入液氮保存，部分制成病理切片，观察淋巴结、肝、肺转移情况。
3.细胞培养及移植：取病例1第三代裸鼠移植瘤0.5 g，用Hank's液冲洗两遍，剪碎，加适量RPMI1640培养基制成细胞悬液，过滤，1 000 r/min，离心10 min，去上清。用Hank's液再冲洗两遍，离心(1 000 r/min)10 min，去上清。涂片，计数。余下的细胞加含10%小牛血清的RPMI1640培养液6 ml，置入CO2孵育箱，37℃培养，依据细胞生长情况进行传代。取9×106细胞注射入裸鼠mfp。常规方法进行体外培养细胞染色体显示。
4.分子生物学实验：(1) 组织块DNA的提取：取病例1乳腺癌石蜡包埋标本、第1代、第8代裸鼠移植瘤、第6代体外培养细胞移植裸鼠所获肿瘤、病理组织学发现有转移的肺和淋巴结、正常裸鼠肺组织，常规方法提取组织块DNA。(2) PCR扩增微卫星序列、电泳、银染：10 μl反应体系中含有样本DNA约0.1 μg、引物各5 pmol/L、TaqDNA聚合酶0.3 μl。反应条件为94℃预变性10 min，而后94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s，共36个循环，最后56℃延伸5 min。取5 μl PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色。
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5.统计学方法：原位移植与皮下移植生存期和成瘤潜伏期的比较采用t检验，成瘤率和转移率的比较采用卡方检验。
结果
1.异种移植及鼠间传代情况：4例标本移植于8只裸鼠体内(每例标本分别种植于1只裸鼠原位和1只裸鼠皮下)，2例标本(第1、2病例)的4只裸鼠移植成功，移植成功率50%，其中2只种植于原位移植的裸鼠均发生肺转移。病例1标本共传8代，接种45只裸鼠，成瘤率88.9%(40/45)，移植成功的40只裸鼠的平均生存期为57.6 d，平均成瘤潜伏期16.4 d。其中原位移植组35只，成瘤率88.6%(31/35)，31只中13只发现转移，转移率41.9%。其中7只肺转移，1只淋巴结转移，5只兼有肺和淋巴结转移；皮下移植组10只，成瘤率90.0%(9/10)，无转移(表2)。原位移植组与皮下移植组相比，生存期短12.2 d，成瘤潜伏期短10.4 d，但两者差异均无统计学意义(P>0.05)。成瘤率相差1.4%，转移率差异有显著差别(P<0.05)。病例2标本共传7代，接种29只裸鼠，成瘤率69.0%(20/29)。其中原位移植组21只，成瘤率66.7%(14/21)，肺转移率14.3%(2/14)；皮下移植组8只，成瘤率75.0%(6/8)，无转移。
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表2 原位移植与皮下移植的比较 移植类型
鼠数
成瘤率
(%)
转移率
(%)
平均生存期
(d)
平均成瘤
潜伏期
(d)
原位移植
35
, http://www.100md.com
88.6
(31/35)
41.9
(13/31)
55.8
(24～116)
14.8
(5～44)
皮下移植
10
90.0
(9/10)
0
, 百拇医药
68.0
(41～100)
25.2
(14～40)
2.侵袭情况及病理学：肉眼观察：皮下移植瘤包膜完整，与周围界限清楚，无肿大淋巴结；原位移植瘤呈侵袭性生长，可见四肢根部淋巴结肿大，肉眼难以辨认肺脏、肝脏转移结节。光镜下：病例1原发瘤见图1，裸鼠肺转移灶见图2，淋巴结转移灶见图3。
3.细胞培养及移植情况：取病例1标本第6代裸鼠移植瘤于体外培养计数为3×105，第4天细胞贴壁，第7天进行1/3换液，第18天细胞已长满瓶底，进行原瓶传代，第29天传代分成两瓶，以后7～10 d传代一次，2个月后每3 d传代一次。现体外已传至第142代，用第11代、30代、86代、132代液氮冷冻的细胞多次复苏均能生长，此细胞系命名为BICR-H1。体外传至第106代时将9×106细胞种植入10只裸鼠原位移植，全部成瘤并有肺转移。
, 百拇医药
4.细胞学检查：分别计数100个原代及第50代病例1裸鼠移植瘤体外培养细胞的染色体(图4)，分别为58～68和56～70条，众数为62，占检测细胞的92.0%和88.5%。
5.7个标本基因组DNA经3个位点(D14S68、D18S69、D20S199)的微卫星引物扩增，第2至第6号标本分别获得与人乳腺癌相同片段的产物，而裸鼠正常组织在3个位点或未见扩增片段，或扩增出完全不同的带型，说明裸鼠移植瘤及其转移灶、体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤均来源于人乳腺癌，裸鼠肺和淋巴结确有人乳腺癌转移灶，提示人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移、体外培养过程中具有遗传稳定性(图5)。
, 百拇医药 图1 病例1原发瘤，髓样癌.HE法 ×250 图2 第一代裸鼠移植瘤肺转移.HE法 ×250 图3 第二代裸鼠移植瘤淋巴结转移.HE法 ×250
图4 病例1裸鼠移植瘤体外培养传代细胞
染色体核型，染色体数目为62.×1 000
讨论
与其他很多肿瘤30%以上的异种移植成功率比较[2]，人乳腺癌的异种移植成功率只有6%～15%，转移更是罕见[1]。多年来人们探索了很多途径试图提高乳腺癌的移植成功率和转移率，如改变裸鼠的健康状况、饲养条件、遗传背景、植入途径等[3]，稍有效果，但尚难满意。迄今仅Hurst等[4]于1993年报道了一可连续发生自发性肺转移的异种移植系GI-101，但Hurst采用的是皮下移植，这可能对原发瘤的生物学特性产生影响。同年Fu等[5]将一例原发性乳腺癌移植于8只裸鼠原位移植，6只发生转移，但未连续传代。1996年国内贺兰湘等[6]将46例乳腺癌移植于裸鼠皮下，仅1例成瘤，无转移。
, 百拇医药
本实验中我们采用完整组织原位移植法异种移植4例人乳腺癌新鲜标本，获得了50%的移植成功率、88.6%的鼠间传代成瘤率和41.9%的转移率，与文献报道的结果比较，相对较好，建立了国内首例可连续发生自发性肺转移的异种移植系和国内首例体外乳腺癌高转移细胞系BICR-H1，其再移植裸鼠的自发性肺转移率高达100%，这为研究乳腺癌生物学行为、基因改变、转移影响因素、微转移的发现等提供了手段。
1：人乳腺癌；2：第一代裸鼠移植瘤；3：第八代裸鼠移植瘤；4：第36代体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤；5：病理发现转移的裸鼠肺；6：病理发现转移的裸鼠淋巴结；7：正常裸鼠肺；M：Marker
图5 七个标本DNA在微卫星位点D14S68(图A)、D18S69(图B)、D20S199(图C)扩增、电泳结果
, 百拇医药
裸鼠模型因其提供了与人体类似的体内环境而受到重视。但由裸鼠模型得出的实验结果是否适用于人类？尚需证明人肿瘤与裸鼠移植瘤的同源性。以高变异DNA序列作为遗传标记为此问题的解决提供了良好的手段。据估算小卫星DNA探针33.15产生的两个随机个体的DNA指纹图谱相同的概率仅为3×10-11。微卫星DNA(MS)具有比小卫星DNA更高的个体特异性、体细胞稳定性和稳定遗传性，人群多态性更高，所以两个个体在三个位点上的微卫星序列均相同的概率非常小。因此理论上，随机选取三个微卫星位点即可充分说明人乳腺癌与裸鼠移植瘤的同源性。但一般选择微卫星标记主要根据其在染色体的位置、等位基因数目≥5和/或杂合率≥70%以及PCR扩增片段不超过400bp(保证PAGE能分辨相差1bp的片段)，进一步选择需根据PCR反应情况及凝胶电泳图形情况而定。我所细胞遗传室的前期工作表明在微卫星位点D14S68、D18S69、D20S199的PCR条件易于控制，结果稳定，带型清晰。所以我们选择了这三个位点。本实验中裸鼠移植瘤及转移灶在三个位点与人乳腺癌均具有完全相同的扩增产物，与裸鼠正常组织的扩增产物明显不同，证明裸鼠移植瘤及转移灶来源于人乳腺癌。亦可以说明人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移、体外培养过程中具有遗传稳定性。此点为利用本模型做进一步的实验提供了保障。
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人肿瘤裸鼠转移模型中微转移的早期发现一直是此研究中的难点。本实验中通过检测转移灶的微卫星DNA，在一个裸鼠淋巴结和长径约4 mm的裸鼠肺组织中发现了微转移灶，且从提取组织DNA至银染完毕，整个过程仅需2～3 d，不失为是一种简便、敏感、准确的发现和鉴定裸鼠移植瘤微转移的方法。而更为重要的是，本实验为直接在人体中发现微转移提供了线索。
应用本实验所采用的方法检测其血液中是否存在转移细胞，从而在很早期就可发现微转移。甚至可以设想提取尿液、胃液中脱落细胞的DNA进行检测，若发现MSI，则可以发现亚临床期肿瘤。如果实验证实此法可行，MSI将在癌症普查、早期诊断、微转移检测和疗效评估等方面具有一定意义。
基金项目：北京市自然科学基金资助项目(7972011)
参考文献
1，Mehta RR, Graves JM, Hart GD, et al. Growth and metastasis of human breast carcinomas with matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment, 1993, 25:65-71.
, 百拇医药
2，Manzotti C, Andisio RA, and Pratesi G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: reference to metastasis and invasion.Clin Exp Metastasis, 1993,11:5-14.
3，Price JE, Zhang RD . Studies of human breast cancer metastasis using nude mice. Cancer and Metastasis Reviews, 1989/1990,8:285-297.
4，Hurst J, Maniar N, Tombarkiewicz J,et al. A novel model of a metastatic human breast tumor xenograft line. Br J Cancer, 1993,68:274-276.
5，Fu X, Le P, Hoffman RM. A metastatic orthotopic-transplant nude mouse model of human patient breast cancer. Anticancer Res, 1993,13:901-904.
6，贺兰湘, Andersen JA. 原发性乳腺原位癌和侵润性癌裸鼠移植. 中华肿瘤杂志, 1996,18:321-323.
(收稿日期：2000-01-10), 百拇医药
单位：黄信孚 李志洪 阳兰桂 姚丽华 吕允威 王培林(北京医科大学临床肿瘤学院 北京市肿瘤防治研究所外科100036)；李吉友(病理科)；柯扬(细胞遗传室)；王永信(细胞遗传室)
关键词：乳腺肿瘤；异种移植；转移；微卫星DNA
中华医学杂志001120
【摘要】 目的 研究人乳腺癌异种移植的自发转移、遗传稳定性和微转移的检测方法。方法 将人乳腺癌新鲜完整组织移植于裸鼠并连续传代，移植瘤细胞体外培养、再移植裸鼠并在3个微卫星位点分析人乳腺癌、裸鼠移植瘤及其转移灶的微卫星DNA。结果 原位移植的成瘤率为88.6%(31/35)、转移率为41.9%(13/31)。移植瘤细胞体外培养成功，其再移植裸鼠成瘤率和转移率均达100%。裸鼠移植瘤及其转移灶在3个位点与人乳腺癌具有相同的微卫星DNA。结论 完整组织原位移植法可提高人乳腺癌异种移植的成功率和转移率。异种移植瘤及其传代肿瘤保持了遗传稳定性。
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A study on human breast carcinoma xenografts in nude mice
LI Zhihong HUANG Xinfu LI Jiyou
(Department of Surgery,The Clinical School of Oncology, Beijing University, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100036, China)
【Abstract】 Objective To study the spontaneous metastasis and the genetic stability of human breast carcinoma xenografts in nude mice and its micrometastasis. Methods The intact tissue of surgical specimens from breast carcinoma were xenografted into nude mice and transplanted from generation to generation. Cells from the xenografts were cultured in vitro and retransplanted into nude mice. Microsatellite DNA in genome of human breast carcinoma, xenotransplanted tumors and metastases in nude mice were analysed at three microsatellite loci. Results The tumorigenicity of orthotopic xenotransplantation was 88.6%(31/35) with a metastasis rate of 41.9%(13/31). Cells from the xenografts were cultured in vitro successfully, both the take rate of retransplantation into nude mice and the spontaneous lung metastasis rate were 100%(10/10). Microsatellite DNA sequences in genome of the xenotransplanted tumors and metastases in nude mice were identical with that of the original human breast carcinoma at the three microsatellite loci. Conclusions The tumorigenicity and metastasis potential can be improved in human breast carcinoma xenograft using the intact fresh tumor tissue and orthotopic graft. The xenotransplanted tumors and their passaged tumors maintained the genetic stability.The detection of microsatellite DNA may discover micrometastasis in the nude mice model.
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【Key words】 Human breast cancer； Xenograft； Micrometastasis, microsatellite DNA
人乳腺癌是动物移植瘤中最难成功的肿瘤之一，发生转移尤难成功[1]，迄今人乳腺癌自发性转移动物模型极为少见，国内尚少见报道。作者利用完整组织原位移植法建立国内首例人乳腺癌转移动物模型，利用此模型研究了提高异种移植成功率和转移率的方法，建立了一人乳腺癌高转移细胞系，鉴定了人乳腺癌异种移植的遗传稳定性，提出了一种检测微转移的方法，现报道如下。
材料和方法
一、材料
1.实验动物:BALB/C，nu/nu裸小鼠(中国人民解放军军事医学科学院提供)，鼠龄4～6周，体重13～20 g，雌性，无菌条件下饲养。
, http://www.100md.com
2.标本来源：采自本院外科4例病理学诊断明确之新鲜乳腺癌手术标本。
3.主要试剂：甲基纤维素、秋水仙素、Rnase A、蛋白酶K、引物(表1)、TaqDNA聚合酶、dNTP、聚丙烯酰胺凝胶(Gibco)，小牛血清、琼脂(均由中山公司提供)。
表1 微卫星引物 染色体
位点
杂合度
(%)
染色体定位
重复
类型
产物大小
, 百拇医药
(bp)
14
D14S68
0.892
14q24.3-gter
DI*
148-172
18
D18S69
0.792
18q21.1-q21.3
DI
, 百拇医药
192-210
20
D20S199
0.670
20
DI
108-126
*DI Dinucleotide
二、方法
1.异种移植及鼠间传代：戊巴比妥钠裸鼠腹腔内注射麻醉，标本取出后切取直径6 mm瘤块剪成1 mm3组织块，种植于裸鼠乳腺脂肪垫(mfp，原位移植)或背部皮下(sc，皮下移植)。待裸鼠濒死时处死，取直径6 mm瘤块剪成1 mm3组织块，种植入下一代裸鼠原位移植或皮下移植s，依次连续传代。
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2.病理学检查：裸鼠濒死时处死，观察四肢根部淋巴结是否肿大，肝、肺有无转移结节，将移植瘤、肿大淋巴结、肝、肺部分置入液氮保存，部分制成病理切片，观察淋巴结、肝、肺转移情况。
3.细胞培养及移植：取病例1第三代裸鼠移植瘤0.5 g，用Hank's液冲洗两遍，剪碎，加适量RPMI1640培养基制成细胞悬液，过滤，1 000 r/min，离心10 min，去上清。用Hank's液再冲洗两遍，离心(1 000 r/min)10 min，去上清。涂片，计数。余下的细胞加含10%小牛血清的RPMI1640培养液6 ml，置入CO2孵育箱，37℃培养，依据细胞生长情况进行传代。取9×106细胞注射入裸鼠mfp。常规方法进行体外培养细胞染色体显示。
4.分子生物学实验：(1) 组织块DNA的提取：取病例1乳腺癌石蜡包埋标本、第1代、第8代裸鼠移植瘤、第6代体外培养细胞移植裸鼠所获肿瘤、病理组织学发现有转移的肺和淋巴结、正常裸鼠肺组织，常规方法提取组织块DNA。(2) PCR扩增微卫星序列、电泳、银染：10 μl反应体系中含有样本DNA约0.1 μg、引物各5 pmol/L、TaqDNA聚合酶0.3 μl。反应条件为94℃预变性10 min，而后94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s，共36个循环，最后56℃延伸5 min。取5 μl PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色。
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5.统计学方法：原位移植与皮下移植生存期和成瘤潜伏期的比较采用t检验，成瘤率和转移率的比较采用卡方检验。
结果
1.异种移植及鼠间传代情况：4例标本移植于8只裸鼠体内(每例标本分别种植于1只裸鼠原位和1只裸鼠皮下)，2例标本(第1、2病例)的4只裸鼠移植成功，移植成功率50%，其中2只种植于原位移植的裸鼠均发生肺转移。病例1标本共传8代，接种45只裸鼠，成瘤率88.9%(40/45)，移植成功的40只裸鼠的平均生存期为57.6 d，平均成瘤潜伏期16.4 d。其中原位移植组35只，成瘤率88.6%(31/35)，31只中13只发现转移，转移率41.9%。其中7只肺转移，1只淋巴结转移，5只兼有肺和淋巴结转移；皮下移植组10只，成瘤率90.0%(9/10)，无转移(表2)。原位移植组与皮下移植组相比，生存期短12.2 d，成瘤潜伏期短10.4 d，但两者差异均无统计学意义(P>0.05)。成瘤率相差1.4%，转移率差异有显著差别(P<0.05)。病例2标本共传7代，接种29只裸鼠，成瘤率69.0%(20/29)。其中原位移植组21只，成瘤率66.7%(14/21)，肺转移率14.3%(2/14)；皮下移植组8只，成瘤率75.0%(6/8)，无转移。
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表2 原位移植与皮下移植的比较 移植类型
鼠数
成瘤率
(%)
转移率
(%)
平均生存期
(d)
平均成瘤
潜伏期
(d)
原位移植
35
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88.6
(31/35)
41.9
(13/31)
55.8
(24～116)
14.8
(5～44)
皮下移植
10
90.0
(9/10)
0
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68.0
(41～100)
25.2
(14～40)
2.侵袭情况及病理学：肉眼观察：皮下移植瘤包膜完整，与周围界限清楚，无肿大淋巴结；原位移植瘤呈侵袭性生长，可见四肢根部淋巴结肿大，肉眼难以辨认肺脏、肝脏转移结节。光镜下：病例1原发瘤见图1，裸鼠肺转移灶见图2，淋巴结转移灶见图3。
3.细胞培养及移植情况：取病例1标本第6代裸鼠移植瘤于体外培养计数为3×105，第4天细胞贴壁，第7天进行1/3换液，第18天细胞已长满瓶底，进行原瓶传代，第29天传代分成两瓶，以后7～10 d传代一次，2个月后每3 d传代一次。现体外已传至第142代，用第11代、30代、86代、132代液氮冷冻的细胞多次复苏均能生长，此细胞系命名为BICR-H1。体外传至第106代时将9×106细胞种植入10只裸鼠原位移植，全部成瘤并有肺转移。
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4.细胞学检查：分别计数100个原代及第50代病例1裸鼠移植瘤体外培养细胞的染色体(图4)，分别为58～68和56～70条，众数为62，占检测细胞的92.0%和88.5%。
5.7个标本基因组DNA经3个位点(D14S68、D18S69、D20S199)的微卫星引物扩增，第2至第6号标本分别获得与人乳腺癌相同片段的产物，而裸鼠正常组织在3个位点或未见扩增片段，或扩增出完全不同的带型，说明裸鼠移植瘤及其转移灶、体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤均来源于人乳腺癌，裸鼠肺和淋巴结确有人乳腺癌转移灶，提示人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移、体外培养过程中具有遗传稳定性(图5)。
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图4 病例1裸鼠移植瘤体外培养传代细胞
染色体核型，染色体数目为62.×1 000
讨论
与其他很多肿瘤30%以上的异种移植成功率比较[2]，人乳腺癌的异种移植成功率只有6%～15%，转移更是罕见[1]。多年来人们探索了很多途径试图提高乳腺癌的移植成功率和转移率，如改变裸鼠的健康状况、饲养条件、遗传背景、植入途径等[3]，稍有效果，但尚难满意。迄今仅Hurst等[4]于1993年报道了一可连续发生自发性肺转移的异种移植系GI-101，但Hurst采用的是皮下移植，这可能对原发瘤的生物学特性产生影响。同年Fu等[5]将一例原发性乳腺癌移植于8只裸鼠原位移植，6只发生转移，但未连续传代。1996年国内贺兰湘等[6]将46例乳腺癌移植于裸鼠皮下，仅1例成瘤，无转移。
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本实验中我们采用完整组织原位移植法异种移植4例人乳腺癌新鲜标本，获得了50%的移植成功率、88.6%的鼠间传代成瘤率和41.9%的转移率，与文献报道的结果比较，相对较好，建立了国内首例可连续发生自发性肺转移的异种移植系和国内首例体外乳腺癌高转移细胞系BICR-H1，其再移植裸鼠的自发性肺转移率高达100%，这为研究乳腺癌生物学行为、基因改变、转移影响因素、微转移的发现等提供了手段。
1：人乳腺癌；2：第一代裸鼠移植瘤；3：第八代裸鼠移植瘤；4：第36代体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤；5：病理发现转移的裸鼠肺；6：病理发现转移的裸鼠淋巴结；7：正常裸鼠肺；M：Marker
图5 七个标本DNA在微卫星位点D14S68(图A)、D18S69(图B)、D20S199(图C)扩增、电泳结果
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裸鼠模型因其提供了与人体类似的体内环境而受到重视。但由裸鼠模型得出的实验结果是否适用于人类？尚需证明人肿瘤与裸鼠移植瘤的同源性。以高变异DNA序列作为遗传标记为此问题的解决提供了良好的手段。据估算小卫星DNA探针33.15产生的两个随机个体的DNA指纹图谱相同的概率仅为3×10-11。微卫星DNA(MS)具有比小卫星DNA更高的个体特异性、体细胞稳定性和稳定遗传性，人群多态性更高，所以两个个体在三个位点上的微卫星序列均相同的概率非常小。因此理论上，随机选取三个微卫星位点即可充分说明人乳腺癌与裸鼠移植瘤的同源性。但一般选择微卫星标记主要根据其在染色体的位置、等位基因数目≥5和/或杂合率≥70%以及PCR扩增片段不超过400bp(保证PAGE能分辨相差1bp的片段)，进一步选择需根据PCR反应情况及凝胶电泳图形情况而定。我所细胞遗传室的前期工作表明在微卫星位点D14S68、D18S69、D20S199的PCR条件易于控制，结果稳定，带型清晰。所以我们选择了这三个位点。本实验中裸鼠移植瘤及转移灶在三个位点与人乳腺癌均具有完全相同的扩增产物，与裸鼠正常组织的扩增产物明显不同，证明裸鼠移植瘤及转移灶来源于人乳腺癌。亦可以说明人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移、体外培养过程中具有遗传稳定性。此点为利用本模型做进一步的实验提供了保障。
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人肿瘤裸鼠转移模型中微转移的早期发现一直是此研究中的难点。本实验中通过检测转移灶的微卫星DNA，在一个裸鼠淋巴结和长径约4 mm的裸鼠肺组织中发现了微转移灶，且从提取组织DNA至银染完毕，整个过程仅需2～3 d，不失为是一种简便、敏感、准确的发现和鉴定裸鼠移植瘤微转移的方法。而更为重要的是，本实验为直接在人体中发现微转移提供了线索。
应用本实验所采用的方法检测其血液中是否存在转移细胞，从而在很早期就可发现微转移。甚至可以设想提取尿液、胃液中脱落细胞的DNA进行检测，若发现MSI，则可以发现亚临床期肿瘤。如果实验证实此法可行，MSI将在癌症普查、早期诊断、微转移检测和疗效评估等方面具有一定意义。
基金项目：北京市自然科学基金资助项目(7972011)
参考文献
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(收稿日期：2000-01-10), 百拇医药