足叶乙甙诱导的鼻咽癌细胞亚系共表达多药耐药相关蛋白和P-gp
作者：杨红枚 李文鑫 章小平 刘辉
单位：杨红枚 李文鑫 章小平 刘辉(430072 武汉大学生命科学学院病毒学及分子生物学系)；章小平(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)
关键词：
中华医学杂志000233 导致化学治疗失败的主要原因是肿瘤细胞对药物产生的耐药性，而药物耐药中起主要作用的是多药耐药(MDR)。鼻咽癌是高发于东南亚和我国广东、广西的区域性肿瘤，我们对鼻咽癌(NPC)MDR进行了研究。
一、材料和方法
1.细胞培养和耐药细胞系LCE/VP的建立：鼻咽癌亲代细胞系LCE由本室建立并保存，用含7%小牛血清的PRMI1640(Gibco产品)常规培养。采用足叶乙甙(VP-16)大剂量短暂冲击结合低浓度递增法[1]建立耐药细胞系LCE/VP。用于本实验前细胞已在8 μmol/L浓度VP-16下稳定生长2个月。整个过程历时26周，传代22代。
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2.细胞形态和生长情况观察：在相差显微镜斜下光下和Giemsa染色后观察细胞并摄影。按常规方法求取生长曲线和细胞倍增时间。
3.肿瘤细胞的药物敏感实验：采用改良的MTT法。
4.P-gp和多药耐药相关蛋白(MRP)的免疫荧光检测：采用免疫荧光间接法。
5.流式细胞仪(FCM)观察P-gp、MRP的染色率及染色强度：用-20℃ 80%的乙醇固定收获的细胞并过夜；离心、PBS洗3次后分别加100 μl的JSB-1和QRCL-1，37℃孵育40 min；PBS洗2次，每管再加入100 μl FITC(1：20)，37 ℃孵育40 min；PBS洗3次，用冷500 μl PBS混匀细胞，在流式细胞仪上检测。
6.药物柔红霉素(Dau)在细胞体内的聚集和滞留及3种逆转剂对其影响：加入Dau终浓度为2 μmol/L培养基作用后定时收获、处理细胞，在FCM上检测2种细胞内的Dau浓度。当细胞内的Dau浓度达到稳定状态后，换用不含Dau的培养基，再观察细胞内Dau外排的情况。设刚加入培养基即收获的细胞作为对照。加入Dau终浓度为2 μmol/L的培养基，同时分别加入逆转剂环孢霉素A(CsA)，终浓度为4 μmol/L、维拉帕米(Ver)终浓度为10 μmol/L、黄体酮(Prog)终浓度为2 μmol/L，各自设不加逆转剂者为对照。37℃孵育后分别在150和180 min收获LCE和LCE/VP细胞检测。另取细胞单独在Dau(终浓度为2 μmol/L)作用150和180 min后，换无药培养基并同时各加入上述浓度的CsA、Ver、Prog，各以不加逆转剂者为对照，作用90 min后检测细胞内Dau的滞留量。以上所有实验均重复2次。
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二、结果
1.细胞形态及生长的一般情况：耐药细胞LCE/VP形态发生了一定变化，生长速度变慢，倍增时间延长。
2.化疗药物敏感实验：LCE/VP不仅对VP-16的相对耐药度提高了102倍,且对长春新碱、阿霉素、环磷酰胺、丝裂霉素、5-氟脲嘧啶分别提高了64、19、7.5、5.4和3倍，对卡铂、顺铂、氨甲喋呤则无明显耐药。药物敏感实验结果呈典型的MDR表型。LCE/VP在无药培养基中培养6周后，其对VP-16的耐药程度基本没有减退，保持在90%以上。
3.蛋白质表达情况：大部分LCE/VP细胞高表达MRP，部分细胞高表达P-gp，而LCE细胞的MRP、P-gp均呈极弱的非特异性荧光染色。FCM检测显示，LCE/VP的荧光染色率分别为MRP 84.5%、P-gp 46.6%,而LCE荧光染色率分别为MRP 2.23%、P-gp 5.32%,前者提高了近38倍,后者提高了近9倍。
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4.药物Dau在细胞内的聚集和滞留：在相同条件下不仅LCE/VP细胞内聚集的化疗药物浓度明显低于亲代细胞，而且其外排药物的速度也快于亲代细胞。逆转剂Ver、Prog、CsA对 LCE细胞内的Dau聚集和外排没有明显影响，而Ver、CsA可以分别使LCE/VP细胞内的Dau浓度提高65%和88%，使药物外排速度减慢，Prog对此只有轻微影响。
三、讨论
绝大部分NPC属低分化鳞癌，是具有高度远处转移率和复发能力的恶性肿瘤。目前放疗仍是首选的治疗方法，由于缺乏严格对照和系统观察，许多人认为单纯放疗和放疗+化疗的疗效无差别,但近来研究认为，放疗+适当化疗可以明显提高鼻咽癌的治疗效果。其实NPC对化疗也很敏感，近期疗效和放疗相近，但远期疗效远较放疗差，结合文献我们分析这种现象主要是由于NPC细胞易于产生药物耐药。
建立MDR细胞模型是深入研究MDR的重要前提。我们采用药物大剂量短暂冲击的方法更好地模拟了人类肿瘤化疗后发生的抗药性和逐步递增持续诱导方法相比，用时较短，且MDR表型典型。免疫荧光和FCM的检测显示，LCE/VP细胞有明显的MRP 高表达，P-gp亦有一定程度的表达增高。这种MRP和P-gp共表达现象见于膀胱癌[3]、结肠癌[4]、肺癌[5]等肿瘤，在NPC中还未见报道。
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FCM可用来检测细胞内某些发放荧光的药物的含量，以此评估细胞聚集和外排该药物的功能状况。我们的研究中，LCE/VP细胞内的药物聚集减少约一倍，P-gp的经典逆转剂Ver和CsA可以提高LCE/VP细胞内的药物聚集和药物外排，而对亲代LCE细胞却没有作用，这提示逆转剂的逆转功能必须通过耐药细胞表达的耐药蛋白起作用。Prog被认为是一种P-gp生物泵的阻断剂，对LCE/VP细胞内的药物浓度没有影响，这进一步证实LCE/VP细胞MDR中起主导作用的是高表达的MRP，而非P-gp。Cole等[2]认为，P-gp的逆转剂钙离子通道阻滞剂Ver对MRP高表达的细胞无逆转作用，这和我们的结果不一致。我们认为，MRP具有和P-gp相似的功能，通过降低细胞内的药物浓度导致MDR，P-gp的逆转剂Ver、CsA等都可能不同程度地逆转MRP介导的MDR，至少在NPC中有这种现象。
总之，我们建立的LCE/VP存在MRP、P-gp的共表达，具备典型的MDR表型，结合其他人的研究可以判断，不仅P-gp参与了NPC的MDR，而且MRP在NPC的MDR中也起重要作用。
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基金项目：国家教委博士点基金资助项目；湖北省科委基金资助项目
通信作者：李文鑫，430072，武汉大学生命科学学院病毒及分子生物学系
参考文献
[1]Francis M,Thomas K,Steven V,et al. Establishment and characterization of a doxorubicin-resistant human bldder cancer cell line(MGH-U1R). Urol, 1988, 140:410-414.
[2]Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH,et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line. Science，1992，258:1650-1654.
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[3]Hasgawa S, Abe T, Naito S, et al. Expression of multidrug resistance-associated protein(MRP),MDR/and DNA topoisomerase in human multidrug-resistant bladder cancer cell. Br J Cancer,1995,71:907-913.
[4]Fillpits M, Suchomel RW, Dekan G, et al. Expression of the multirug resistance-associated protein(MRP)gene in colorectal carcinomas. Br J Cancer，1997，75:206-212.
[5]Doyle LA, Ross DD, Ordonez JV, et al. An etoposide-resistant lung cancer subline overexpresses the multidrug resistance-associated protein. Br J Cancer, 1995，72:535-542.
收稿日期：1998-12-24, 百拇医药
单位：杨红枚 李文鑫 章小平 刘辉(430072 武汉大学生命科学学院病毒学及分子生物学系)；章小平(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)
关键词：
中华医学杂志000233 导致化学治疗失败的主要原因是肿瘤细胞对药物产生的耐药性，而药物耐药中起主要作用的是多药耐药(MDR)。鼻咽癌是高发于东南亚和我国广东、广西的区域性肿瘤，我们对鼻咽癌(NPC)MDR进行了研究。
一、材料和方法
1.细胞培养和耐药细胞系LCE/VP的建立：鼻咽癌亲代细胞系LCE由本室建立并保存，用含7%小牛血清的PRMI1640(Gibco产品)常规培养。采用足叶乙甙(VP-16)大剂量短暂冲击结合低浓度递增法[1]建立耐药细胞系LCE/VP。用于本实验前细胞已在8 μmol/L浓度VP-16下稳定生长2个月。整个过程历时26周，传代22代。
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2.细胞形态和生长情况观察：在相差显微镜斜下光下和Giemsa染色后观察细胞并摄影。按常规方法求取生长曲线和细胞倍增时间。
3.肿瘤细胞的药物敏感实验：采用改良的MTT法。
4.P-gp和多药耐药相关蛋白(MRP)的免疫荧光检测：采用免疫荧光间接法。
5.流式细胞仪(FCM)观察P-gp、MRP的染色率及染色强度：用-20℃ 80%的乙醇固定收获的细胞并过夜；离心、PBS洗3次后分别加100 μl的JSB-1和QRCL-1，37℃孵育40 min；PBS洗2次，每管再加入100 μl FITC(1：20)，37 ℃孵育40 min；PBS洗3次，用冷500 μl PBS混匀细胞，在流式细胞仪上检测。
6.药物柔红霉素(Dau)在细胞体内的聚集和滞留及3种逆转剂对其影响：加入Dau终浓度为2 μmol/L培养基作用后定时收获、处理细胞，在FCM上检测2种细胞内的Dau浓度。当细胞内的Dau浓度达到稳定状态后，换用不含Dau的培养基，再观察细胞内Dau外排的情况。设刚加入培养基即收获的细胞作为对照。加入Dau终浓度为2 μmol/L的培养基，同时分别加入逆转剂环孢霉素A(CsA)，终浓度为4 μmol/L、维拉帕米(Ver)终浓度为10 μmol/L、黄体酮(Prog)终浓度为2 μmol/L，各自设不加逆转剂者为对照。37℃孵育后分别在150和180 min收获LCE和LCE/VP细胞检测。另取细胞单独在Dau(终浓度为2 μmol/L)作用150和180 min后，换无药培养基并同时各加入上述浓度的CsA、Ver、Prog，各以不加逆转剂者为对照，作用90 min后检测细胞内Dau的滞留量。以上所有实验均重复2次。
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二、结果
1.细胞形态及生长的一般情况：耐药细胞LCE/VP形态发生了一定变化，生长速度变慢，倍增时间延长。
2.化疗药物敏感实验：LCE/VP不仅对VP-16的相对耐药度提高了102倍,且对长春新碱、阿霉素、环磷酰胺、丝裂霉素、5-氟脲嘧啶分别提高了64、19、7.5、5.4和3倍，对卡铂、顺铂、氨甲喋呤则无明显耐药。药物敏感实验结果呈典型的MDR表型。LCE/VP在无药培养基中培养6周后，其对VP-16的耐药程度基本没有减退，保持在90%以上。
3.蛋白质表达情况：大部分LCE/VP细胞高表达MRP，部分细胞高表达P-gp，而LCE细胞的MRP、P-gp均呈极弱的非特异性荧光染色。FCM检测显示，LCE/VP的荧光染色率分别为MRP 84.5%、P-gp 46.6%,而LCE荧光染色率分别为MRP 2.23%、P-gp 5.32%,前者提高了近38倍,后者提高了近9倍。
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4.药物Dau在细胞内的聚集和滞留：在相同条件下不仅LCE/VP细胞内聚集的化疗药物浓度明显低于亲代细胞，而且其外排药物的速度也快于亲代细胞。逆转剂Ver、Prog、CsA对 LCE细胞内的Dau聚集和外排没有明显影响，而Ver、CsA可以分别使LCE/VP细胞内的Dau浓度提高65%和88%，使药物外排速度减慢，Prog对此只有轻微影响。
三、讨论
绝大部分NPC属低分化鳞癌，是具有高度远处转移率和复发能力的恶性肿瘤。目前放疗仍是首选的治疗方法，由于缺乏严格对照和系统观察，许多人认为单纯放疗和放疗+化疗的疗效无差别,但近来研究认为，放疗+适当化疗可以明显提高鼻咽癌的治疗效果。其实NPC对化疗也很敏感，近期疗效和放疗相近，但远期疗效远较放疗差，结合文献我们分析这种现象主要是由于NPC细胞易于产生药物耐药。
建立MDR细胞模型是深入研究MDR的重要前提。我们采用药物大剂量短暂冲击的方法更好地模拟了人类肿瘤化疗后发生的抗药性和逐步递增持续诱导方法相比，用时较短，且MDR表型典型。免疫荧光和FCM的检测显示，LCE/VP细胞有明显的MRP 高表达，P-gp亦有一定程度的表达增高。这种MRP和P-gp共表达现象见于膀胱癌[3]、结肠癌[4]、肺癌[5]等肿瘤，在NPC中还未见报道。
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FCM可用来检测细胞内某些发放荧光的药物的含量，以此评估细胞聚集和外排该药物的功能状况。我们的研究中，LCE/VP细胞内的药物聚集减少约一倍，P-gp的经典逆转剂Ver和CsA可以提高LCE/VP细胞内的药物聚集和药物外排，而对亲代LCE细胞却没有作用，这提示逆转剂的逆转功能必须通过耐药细胞表达的耐药蛋白起作用。Prog被认为是一种P-gp生物泵的阻断剂，对LCE/VP细胞内的药物浓度没有影响，这进一步证实LCE/VP细胞MDR中起主导作用的是高表达的MRP，而非P-gp。Cole等[2]认为，P-gp的逆转剂钙离子通道阻滞剂Ver对MRP高表达的细胞无逆转作用，这和我们的结果不一致。我们认为，MRP具有和P-gp相似的功能，通过降低细胞内的药物浓度导致MDR，P-gp的逆转剂Ver、CsA等都可能不同程度地逆转MRP介导的MDR，至少在NPC中有这种现象。
总之，我们建立的LCE/VP存在MRP、P-gp的共表达，具备典型的MDR表型，结合其他人的研究可以判断，不仅P-gp参与了NPC的MDR，而且MRP在NPC的MDR中也起重要作用。
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基金项目：国家教委博士点基金资助项目；湖北省科委基金资助项目
通信作者：李文鑫，430072，武汉大学生命科学学院病毒及分子生物学系
参考文献
[1]Francis M,Thomas K,Steven V,et al. Establishment and characterization of a doxorubicin-resistant human bldder cancer cell line(MGH-U1R). Urol, 1988, 140:410-414.
[2]Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH,et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line. Science，1992，258:1650-1654.
, http://www.100md.com
[3]Hasgawa S, Abe T, Naito S, et al. Expression of multidrug resistance-associated protein(MRP),MDR/and DNA topoisomerase in human multidrug-resistant bladder cancer cell. Br J Cancer,1995,71:907-913.
[4]Fillpits M, Suchomel RW, Dekan G, et al. Expression of the multirug resistance-associated protein(MRP)gene in colorectal carcinomas. Br J Cancer，1997，75:206-212.
[5]Doyle LA, Ross DD, Ordonez JV, et al. An etoposide-resistant lung cancer subline overexpresses the multidrug resistance-associated protein. Br J Cancer, 1995，72:535-542.
收稿日期：1998-12-24, 百拇医药