SDS-PAGE电泳法测定胸腺肽的相对分子质量
作者：夏晓燕 沈君 李宁 王薇 卜跃华
单位：夏晓燕 沈君 李宁 王薇(沈阳市药品检验所，沈阳 110001)；卜跃华(中国医科大学制药厂，沈阳 110001)
关键词：SDS；聚丙烯酰胺；电泳；相对分子质量；胸腺肽
沈阳药科大学学报00zk21 摘 要 用SDS-PAGE法测定胸腺肽的相对分子质量(Mr)，采用Pharmacia公司生产的标准蛋白做标准曲线，此法适于测定相对分子质量为14 000～100 000 D的样品.考马斯亮蓝R 250染色，甲醇-冰醋酸脱色，测得胸腺肽主要成分的相对分子质量为14 000 D.
分类号 R917
Determination of the Relative Molecular Weight of Thymopeptide by SDS-PAGE
, 百拇医药
Xia Xiaoyan, Shen Jun, Li Ning, Wang Wei， Pu Yuehua
(The Shenyang Institute for Drug Control,Shenyang 110001)
Abstract To determinate the molecular weight of thymopeptide by SDS-PAGE,the standard curve was made by using the protein standard provided by the Pharmacia Company. It was used in determing the samples and the molecular weight ranged from 14 000D to 100 000D.It was decolored with Coomassis brilliant blue and stained with methanol-acetic acid.The results showed that the molecular weight of the major component of thymopeptide was 14 000D.
, 百拇医药
Key words SDS;PAGE;electrophoresis;molecular weight;thymopeptide
注射用胸腺肽是临床使用较广泛的一种免疫调节剂，用于调整治疗与免疫相关的疾病，目前国内生产厂家众多，由于生产工艺不同，其组分差异较大.法定测定方法仅以多肽蛋白含量测定来确定药品质量，不检测相对分子质量，对大分子蛋白的控制也只停留在豚鼠致敏实验水平上.实验采用SDS-PAGE电泳法〔1〕测定胸腺肽注射液的相对分子质量，实验所用系统条件适于测定相对分子质量为14 000～100 000 D的样品，在此范围内，电泳相对迁移率(Rm)与相对分子质量(Mr)的对数呈线性关系.
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白分子是依据其具有氨基和羧基的两性电解质特性，当溶液酸碱度与蛋白质等电点不相同时可以解离，在外加电场作用下定向移动，其迁移速率ν=eq/6πrηd ，当电压(e)两极间距(d)及溶液粘度(η)相对不变时，蛋白分子在凝胶中移动速度与分子所带净电荷(q)及分子球径大小(r)两个因素相关.当在电泳系统中加入SDS阴离子表面活性剂后，SDS能与大多数蛋白质分子按比例结合成复合物，使蛋白质分子所带负电荷远远超过天然蛋白质的负电荷，消除了不同蛋白质分子自身的电荷效应，这样蛋白质分子的电泳速率将只取决于相对分子质量的大小，从而借助不同浓度配比，形成不同孔径的凝胶，将相对分子质量不同的各蛋白组分完全依据分子筛效应分离开.在测定样品时与标准蛋白平行操作，从标准蛋白曲线上即可求知样品的相对分子质量.
, http://www.100md.com
1 仪器与试剂
ECP 3000电泳仪、垂直板电泳槽.
标准蛋白(Pharmacia公司生产)，聚丙烯酰胺(日本进口)，考马斯亮蓝R 250染色液(上海化学试剂厂进口分装)，甲醇-冰醋酸脱色液(沈阳试剂一厂).
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制
取标准蛋白加样品处理液制成5 mg/mL标准液，制胶后点样20 μL，在50 mA，200 V条件下进行SDS-PAGE垂直板电泳，当溴酚蓝染料到达前沿时停止，取出凝胶，固定液中固定30 min，浸入染色液染色1 h，然后脱色至凝胶本底色带清晰为止，测量染料移动距离，染色前胶长，蛋白移动距离和脱色后胶长，按下式计算相对迁移率(Rm).
, 百拇医药
以Rm为横坐标，以标准蛋白的对数为纵坐标，进行logMr-Rm线性回归，得标准曲线.回归方
程为logMr=-1.025 Rm+5.062 〈1〉
r=-0.991 0.
2.2 胸腺肽注射液相对分子质量的测定
取样品水浴蒸干，加样品溶解液制成5 mg/mL溶液，点样量20 μL，按标准曲线方法同步操作，电泳脱色后，可见5条多肽色带，按公式计算迁移率，由标准曲线求得其对应的相对分子质量.结果见表1.
Tab.1 The determination of molecular weight No.
Rm
Mr(D)
, 百拇医药
1
0.566
30 321
2
0.590
28 652
3
0.900
13 787
4
0.925
12 997
5
, 百拇医药
0.950
12 252
3 讨论
胸腺肽注射液电泳后出现5条多肽色带，色带颜色最深的，其相对分子质量为13 787D，是主要成分.色带颜色较浅者，含量极少.实验证明，由于大分子肽类的存在，该类制剂在临床上可引起变态反应，为确保临床用药的安全，建议用电泳法进一步控制该类制剂的纯度及相对分子质量的范围.
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：化学工业出版社，1995.附录31
收稿日期:2000-04-18, 百拇医药
单位：夏晓燕 沈君 李宁 王薇(沈阳市药品检验所，沈阳 110001)；卜跃华(中国医科大学制药厂，沈阳 110001)
关键词：SDS；聚丙烯酰胺；电泳；相对分子质量；胸腺肽
沈阳药科大学学报00zk21 摘 要 用SDS-PAGE法测定胸腺肽的相对分子质量(Mr)，采用Pharmacia公司生产的标准蛋白做标准曲线，此法适于测定相对分子质量为14 000～100 000 D的样品.考马斯亮蓝R 250染色，甲醇-冰醋酸脱色，测得胸腺肽主要成分的相对分子质量为14 000 D.
分类号 R917
Determination of the Relative Molecular Weight of Thymopeptide by SDS-PAGE
, 百拇医药
Xia Xiaoyan, Shen Jun, Li Ning, Wang Wei， Pu Yuehua
(The Shenyang Institute for Drug Control,Shenyang 110001)
Abstract To determinate the molecular weight of thymopeptide by SDS-PAGE,the standard curve was made by using the protein standard provided by the Pharmacia Company. It was used in determing the samples and the molecular weight ranged from 14 000D to 100 000D.It was decolored with Coomassis brilliant blue and stained with methanol-acetic acid.The results showed that the molecular weight of the major component of thymopeptide was 14 000D.
, 百拇医药
Key words SDS;PAGE;electrophoresis;molecular weight;thymopeptide
注射用胸腺肽是临床使用较广泛的一种免疫调节剂，用于调整治疗与免疫相关的疾病，目前国内生产厂家众多，由于生产工艺不同，其组分差异较大.法定测定方法仅以多肽蛋白含量测定来确定药品质量，不检测相对分子质量，对大分子蛋白的控制也只停留在豚鼠致敏实验水平上.实验采用SDS-PAGE电泳法〔1〕测定胸腺肽注射液的相对分子质量，实验所用系统条件适于测定相对分子质量为14 000～100 000 D的样品，在此范围内，电泳相对迁移率(Rm)与相对分子质量(Mr)的对数呈线性关系.
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白分子是依据其具有氨基和羧基的两性电解质特性，当溶液酸碱度与蛋白质等电点不相同时可以解离，在外加电场作用下定向移动，其迁移速率ν=eq/6πrηd ，当电压(e)两极间距(d)及溶液粘度(η)相对不变时，蛋白分子在凝胶中移动速度与分子所带净电荷(q)及分子球径大小(r)两个因素相关.当在电泳系统中加入SDS阴离子表面活性剂后，SDS能与大多数蛋白质分子按比例结合成复合物，使蛋白质分子所带负电荷远远超过天然蛋白质的负电荷，消除了不同蛋白质分子自身的电荷效应，这样蛋白质分子的电泳速率将只取决于相对分子质量的大小，从而借助不同浓度配比，形成不同孔径的凝胶，将相对分子质量不同的各蛋白组分完全依据分子筛效应分离开.在测定样品时与标准蛋白平行操作，从标准蛋白曲线上即可求知样品的相对分子质量.
, http://www.100md.com
1 仪器与试剂
ECP 3000电泳仪、垂直板电泳槽.
标准蛋白(Pharmacia公司生产)，聚丙烯酰胺(日本进口)，考马斯亮蓝R 250染色液(上海化学试剂厂进口分装)，甲醇-冰醋酸脱色液(沈阳试剂一厂).
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制
取标准蛋白加样品处理液制成5 mg/mL标准液，制胶后点样20 μL，在50 mA，200 V条件下进行SDS-PAGE垂直板电泳，当溴酚蓝染料到达前沿时停止，取出凝胶，固定液中固定30 min，浸入染色液染色1 h，然后脱色至凝胶本底色带清晰为止，测量染料移动距离，染色前胶长，蛋白移动距离和脱色后胶长，按下式计算相对迁移率(Rm).
, 百拇医药
以Rm为横坐标，以标准蛋白的对数为纵坐标，进行logMr-Rm线性回归，得标准曲线.回归方
程为logMr=-1.025 Rm+5.062 〈1〉
r=-0.991 0.
2.2 胸腺肽注射液相对分子质量的测定
取样品水浴蒸干，加样品溶解液制成5 mg/mL溶液，点样量20 μL，按标准曲线方法同步操作，电泳脱色后，可见5条多肽色带，按公式计算迁移率，由标准曲线求得其对应的相对分子质量.结果见表1.
Tab.1 The determination of molecular weight No.
Rm
Mr(D)
, 百拇医药
1
0.566
30 321
2
0.590
28 652
3
0.900
13 787
4
0.925
12 997
5
, 百拇医药
0.950
12 252
3 讨论
胸腺肽注射液电泳后出现5条多肽色带，色带颜色最深的，其相对分子质量为13 787D，是主要成分.色带颜色较浅者，含量极少.实验证明，由于大分子肽类的存在，该类制剂在临床上可引起变态反应，为确保临床用药的安全，建议用电泳法进一步控制该类制剂的纯度及相对分子质量的范围.
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：化学工业出版社，1995.附录31
收稿日期:2000-04-18, 百拇医药