用抑制性差减杂交法和基因芯片鉴定蚊虫抗药性和敏感性相关基因
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南京医科大学学报 2000年第4期第20卷 科研简报
作者：田海生 朱昌亮 李秀兰 马磊 高晓红 吴观陵
单位：南京医科大学寄生虫学教研室， 南京 210029
关键词：淡色库蚊；抗药性；基因克降；抑制性差减杂交；基因芯片
南京医科大学学报000425
由于杀虫剂的广泛、大量和长期使用，媒介昆虫对杀虫剂逐步产生了抗药性(抗性)。对媒介昆虫抗性的分子机理研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。抗药性和(或)敏感性相关基因的分离将为抗性分子机理的深入研究打下基础。近年来，国外研究者采用经典的“功能克隆法”克隆到一些抗药性相关基因。然而，在事先无目的蛋白或其相应基因定位的情况下分离这些基因是相当困难的。最近建立的抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization, SSH)这一“表型克隆”新策略，无需事先知道起作用基因的背景资料，仅凭表型直接分离基因，为抗性基因的分离提供了有效手段。本研究将SSH与具有高通量鉴定能力的基因芯片(gene chip)技术结合，极大地提高了相关基因的分离速度和效率，部分结果并经逆Northern(reverse northern)进行了进一步验证。
, 百拇医药
1 材料和方法
蚊虫样本 淡色库蚊敏感品系引自中国科学院上海昆虫研究所。抗性品系为本室对敏感品系经一定量溴氰菊酯杀虫剂逐代汰选而成的高纯抗性品系。
Total RNA和mRNA的分离 分别按QIAGEN和Promega试剂盒提供的操作步骤进行。
抑制性差减杂交 基本按照CLONTECH试剂盒操作步骤。即正向杂交法，首先用获得的2种mRNA反转录合成dscDNA，然后RsaⅠ酶切，再将酶切过的抗性蚊dscDNA均分为2，分别加上接头1和2R，与过量的敏感蚊dscDNA进行2轮杂交，再经2轮抑制性PCR。反向杂交则用过量的抗性蚊dscDNA与加接头的敏感蚊dscDNA杂交。
T/A克隆及PCR扩增 将所获PCR产物进行T/A(PINPOINT质粒载体)克隆并提取所得克隆质粒DNA，以质粒载体两端序列设计PCR引物扩增插入的重组片段。
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基因芯片鉴定
(1)芯片的制备 通过微阵列技术(Microarray)用TAS BioRobotics自动点膜仪将PCR产物浓缩变性后点于固相载体尼龙膜表面，每个样本重复点样2次。
(2)探针的制备 分别以2种分离的mRNA为模板反转录合成含同位素α-33P-dATP的探针。
(3)杂交、检测与分析 常规杂交、洗膜，步骤基本按《分子克隆实验指南》进行。最后进行磷屏压片并用信号记录仪(FUJIFILMFLA-300)扫描分析。
(4)信号分析标准 两张膜上的背景亮度值均设为3；同一张膜上代表同一克隆的两个点亮度差异在2倍之内；如一张膜上同一克隆的两点亮度分别是另一张膜上对应点亮度的3倍以上，可以确信这个克隆代表的基因在这两种样本中有明显的表达差异。
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逆Northern鉴定 将10个已经芯片鉴定的PCR样本电泳、转膜。将2种mRNA反转录合成含同位素α-33P-dATP的cDNA探针，按上述方法杂交、压片及扫描分析。
测序及结果分析 对部分基因序列进行单向测序并用Blast软件与Genbank进行同源性检索。
2 结 果
正、反向抑制性差减杂交分别获得523个和286个阳性克隆，经基因芯片鉴定，3倍以上差异的基因片段分别有42个和9个(图1)。逆Northern再鉴定其中10个片段，差异度与基因芯片的结果吻合(图2)。在51个基因片段中，首次测序29个，分子大小在130～520个碱基之间，平均约310个碱基，经Blast软件检索均为新序列，已向Genbank申请注册。
图1 2种探针的基因芯片杂交结果
图2 抗性蚊(上)和敏感蚊(下)cDNA探针逆Northern
(2000-05-22收稿), 百拇医药
单位：南京医科大学寄生虫学教研室， 南京 210029
关键词：淡色库蚊；抗药性；基因克降；抑制性差减杂交；基因芯片
南京医科大学学报000425
由于杀虫剂的广泛、大量和长期使用，媒介昆虫对杀虫剂逐步产生了抗药性(抗性)。对媒介昆虫抗性的分子机理研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。抗药性和(或)敏感性相关基因的分离将为抗性分子机理的深入研究打下基础。近年来，国外研究者采用经典的“功能克隆法”克隆到一些抗药性相关基因。然而，在事先无目的蛋白或其相应基因定位的情况下分离这些基因是相当困难的。最近建立的抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization, SSH)这一“表型克隆”新策略，无需事先知道起作用基因的背景资料，仅凭表型直接分离基因，为抗性基因的分离提供了有效手段。本研究将SSH与具有高通量鉴定能力的基因芯片(gene chip)技术结合，极大地提高了相关基因的分离速度和效率，部分结果并经逆Northern(reverse northern)进行了进一步验证。
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1 材料和方法
蚊虫样本 淡色库蚊敏感品系引自中国科学院上海昆虫研究所。抗性品系为本室对敏感品系经一定量溴氰菊酯杀虫剂逐代汰选而成的高纯抗性品系。
Total RNA和mRNA的分离 分别按QIAGEN和Promega试剂盒提供的操作步骤进行。
抑制性差减杂交 基本按照CLONTECH试剂盒操作步骤。即正向杂交法，首先用获得的2种mRNA反转录合成dscDNA，然后RsaⅠ酶切，再将酶切过的抗性蚊dscDNA均分为2，分别加上接头1和2R，与过量的敏感蚊dscDNA进行2轮杂交，再经2轮抑制性PCR。反向杂交则用过量的抗性蚊dscDNA与加接头的敏感蚊dscDNA杂交。
T/A克隆及PCR扩增 将所获PCR产物进行T/A(PINPOINT质粒载体)克隆并提取所得克隆质粒DNA，以质粒载体两端序列设计PCR引物扩增插入的重组片段。
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基因芯片鉴定
(1)芯片的制备 通过微阵列技术(Microarray)用TAS BioRobotics自动点膜仪将PCR产物浓缩变性后点于固相载体尼龙膜表面，每个样本重复点样2次。
(2)探针的制备 分别以2种分离的mRNA为模板反转录合成含同位素α-33P-dATP的探针。
(3)杂交、检测与分析 常规杂交、洗膜，步骤基本按《分子克隆实验指南》进行。最后进行磷屏压片并用信号记录仪(FUJIFILMFLA-300)扫描分析。
(4)信号分析标准 两张膜上的背景亮度值均设为3；同一张膜上代表同一克隆的两个点亮度差异在2倍之内；如一张膜上同一克隆的两点亮度分别是另一张膜上对应点亮度的3倍以上，可以确信这个克隆代表的基因在这两种样本中有明显的表达差异。
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逆Northern鉴定 将10个已经芯片鉴定的PCR样本电泳、转膜。将2种mRNA反转录合成含同位素α-33P-dATP的cDNA探针，按上述方法杂交、压片及扫描分析。
测序及结果分析 对部分基因序列进行单向测序并用Blast软件与Genbank进行同源性检索。
2 结 果
正、反向抑制性差减杂交分别获得523个和286个阳性克隆，经基因芯片鉴定，3倍以上差异的基因片段分别有42个和9个(图1)。逆Northern再鉴定其中10个片段，差异度与基因芯片的结果吻合(图2)。在51个基因片段中，首次测序29个，分子大小在130～520个碱基之间，平均约310个碱基，经Blast软件检索均为新序列，已向Genbank申请注册。
图1 2种探针的基因芯片杂交结果
图2 抗性蚊(上)和敏感蚊(下)cDNA探针逆Northern
(2000-05-22收稿), 百拇医药