体外转运富含GPI-蛋白的红细胞囊泡改善PNH溶血的探索△
作者：杨洋 许彩民 潘华珍 吕照江 张之南
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005
关键词：红细胞囊泡；反应性溶血膜抑制物；阵发性睡眠性血红蛋白尿症
中国医学科学院学报990408 摘要 目的 在体外观察是否能将富含CD59的红细胞囊泡转运到缺失CD59的阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)红细胞膜上，以改善PNH溶血，为PNH的治疗提供新的线索。方法 采用免疫亲和层析分离技术分离PNH CD59-红细胞，采用Western印迹分析、流式细胞仪及蛇毒因子溶血实验等检测和分析红细胞与囊泡的结合。结果 Western印迹分析显示，红细胞囊泡含有CD59；流式细胞仪测定表明，PNH CD59-红细胞与囊泡结合后，CD59的荧光标记率明显增高(P<0.001)；蛇毒因子溶血实验显示，加入囊泡后PNH CD59-红细胞溶血度也显著下降(P<0.05)。结论 红细胞囊泡上的CD59可以在体外转运到PNH CD59-红细胞上，并产生抑制补体溶血的作用，使PNH CD59-红细胞在体外受补体攻击时不易溶血。
, 百拇医药
中图号 R556.6
Protection of PNH Red Blood Cells from Lysis by Transfering GPI-anchored Protein Vesicles of Normal Human RBCs in vitro Protein Vesicles of Normal Human RBCs in vitro
Yang Yang Xu Caimin# Pan Huazhen, et al
(National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005)
Objective To observe the transfer of GPI-anchored protein CD59 from vesicles of normal RBCs to paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH) RBCs can correct the susceptibility to complement attack in vitro.Methods Vesicles released from normal RBCs under ATP depletion or storage, are rich in CD59. PNH CD59- RBCs were separated by elution from immunoaffinity column bound with monoclonal antibody CD59,and then incubated with normal RBCs vesicles.The content of CD59 in vesicles and RBCs was detected by Western blot and flowcytometric analysis respectively and hemolysis of PNH CD59- RBCs was detected by cobra venom factor hemolysis test. Results The fluorescence intensity of PNH CD59- RBCs were increased from (1.68±0.57)% to (58.42±8.25)% and the hemolysis was significantly decreased from (27.13±9.69)% to (19.49±7.61)% after incubation with vesicles prepared from normal donors (P<0.05),while normal RBCs had no obvious change before and after the same treatment.(P>0.05).Conclusions It seems that CD59 protein molecules could be transfered from normal RBCs vesicles to PNH CD59- RBCs and retaining the complement regulatory function. CD59- RBCs could be rendered less liable to hemolyze during complement attack.
, 百拇医药
Key words vesicles of human RBCs; CD59； paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是在造血干细胞水平发病，患者外周血中病态与正常红细胞同时存在，病态细胞的共同特点是细胞膜表面的糖肌醇磷脂(glycosylphosphatidylinositol,GPI)-蛋白减少或缺乏。GPI-蛋白是一类特殊的膜蛋白，目前已发现该类有80多种成员，与补体调节有关的蛋白有C3转换酶衰变加速因子(CD55)，反应性溶血膜抑制物(CD59)和C8结合蛋白(CD58)等。由于PNH患者红细胞膜上缺乏这些补体调节蛋白，所以红细胞易遭受补体破坏，发生溶血现象。对于PNH的治疗，至今尚缺少有效的方法。1996年Medof[1]提出GPI-蛋白能自动地从一个细胞膜上转运到另一个细胞膜上，这种转运可在同一个细胞的不同部位或在细胞与细胞之间进行。笔者设想是否可将富含GPI-蛋白的正常红细胞囊泡转移到PNH患者的病态红细胞上，以达到缓解PNH溶血的目的。本实验以PNH患者红细胞(缺乏CD59，CD59-)为研究对象，以正常人红细胞囊泡(主要含GPI-蛋白CD59，)作为GPI-蛋白供体，将正常人红细胞囊泡转运到PNH CD59-红细胞上，通过蛇毒因子CoF溶血实验检测溶血现象的改善情况。
, 百拇医药
1 材料和方法
研究对象 正常人红细胞购自北京协和医院血库，PNH患者血标本采自协和医院门诊。
正常红细胞囊泡的制备 采用两种方法制备，(1)存储法：按文献[2]的方法进行；(2) ATP耗空法：按文献[2]的方法进行。制备的囊泡分装后存于-70℃备用。用Folin-酚法测定蛋白含量。
Western印迹分析 按文献[3]的方法进行免疫印迹实验。一抗用CD59单克隆抗体(购自Pharmingen公司)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(购自中山公司)，用DAB(diaminobenzidine，购自Sigma公司)作底物显色。
PNH CD59-红细胞的分离 采用protein A-sepharose 6MB免疫亲和层析法分离PNH CD59-和CD59+红细胞[4]。2%PNH红细胞悬液流经sepharose层析柱时，PNH CD59+红细胞保留在柱上，CD59-红细胞流出，收集流出的PNH CD59-红细胞备用。
, 百拇医药
红细胞与囊泡的结合 将正常人红细胞和经柱层析分离的PNH CD59-红细胞用生理盐水配制成体积分数为2%的细胞悬液，分成4组进行实验(每组取细胞悬液0.1 ml): (1) 正常人红细胞；(2) 正常人红细胞+0.05 ml囊泡；(3) PNH CD59-红细胞；(4) PNH CD59-红细胞+0.05 ml囊泡。(囊泡的蛋白含量为4.7 mg/ml)37℃孵育2 h后，用大量生理盐水洗去游离的囊泡。
PNH CD59-红细胞结合囊泡后CD59荧光标记率的测定 将上述4组红细胞用2%的BSA配成体积分数为1%的红细胞悬液，取0.1 ml红细胞悬液与0.1 ml CD59单克隆抗体(1∶1 000稀释)在室温孵育30 min，以生理盐水洗1次，再与异硫氰酸光素(FITC)标记的二抗结合。采用流式细胞仪(Epics Division of Coulter Corporation)检测4组红细胞的荧光标记率(%)。
, 百拇医药
PNH红细胞蛇毒因子(CoF)溶血实验 按文献[5]的方法进行，在波长415 nm条件下比色，计算溶血度(%)。
统计学处理 数据以均值±标准差表示，采用配对t检验。
2 结果
红细胞囊泡CD59的鉴定 Western印迹分析显示，在相对分子质量为1.8×104～2.0×104处呈现单一的与CD59单克隆抗体反应的条带(附图)。
附图 免疫印迹法鉴定囊泡CD59图谱
Fig Western blot analysis of CD59 in RBCs vesicles
, 百拇医药
1.molecular weight standards,SDS-PAGE stained with aminoblack;
2.storage vesicles;3.ATP depletion-induced vesicles
PNH CD59-红细胞与囊泡保温后CoF溶血实验 6例正常对照组和6例PNH患者红细胞溶血度测定结果显示，对照组红细胞加和不加囊泡的溶血度分别为(1.54±0.97)%和(2.09±1.15)%，相差(0.557±0.56)%两组间差异无显著性(P>0.05)；而PNH组红细胞加和不加囊泡的溶血度分别为(19.49±7.61)%和(27.13±9.69)%，相差(7.63±5.23)%，两组间差异有显著性意义(P<0.05)。
CD59-细胞结合囊泡后流式细胞仪检测结果 6例PNH患者CD59-红细胞CD59荧光标记率在加囊泡前为(1.68±0.57)%，加囊泡后荧光标记率上升至(58.42±8.52)%，加囊泡作用前后，差别有极显著意义(P<0.001)。
, 百拇医药
3 讨论
PNH是由于PIG-A基因突变导致GPI-蛋白的缺乏或减少引起的溶血性疾病。根据Medof[1]提出的GPI-蛋白可转运的原理，以及红细胞经4℃存储或ATP耗竭时，红细胞易形成 直径150～300 nm的囊泡从红细胞脱落，且囊泡富含GPI-蛋白、CD55、乙酰胆碱酯酶[2]等事实，本研究制备的囊泡经Western印迹方法鉴定显示，囊泡富含有CD59。进而以红细胞囊泡作为CD59供体，将PNH红细胞经免疫亲和层析柱分离得到的PNH CD59-红细胞与囊泡共孵育，使CD59转运到PNH CD59-红细胞上。流式细胞仪检测表明，PNH CD59-红细胞与囊泡结合后，CD59荧光标记率显著提高，提示富含CD59的红细胞囊泡在体外条件下能够转运到PNH CD59-红细胞上。蛇毒因子溶血实验结果表明，PNH CD59-红细胞加囊泡后，溶血度明显降低，而正常人红细胞加囊泡后其溶血度不受影响。上述结果表明囊泡中的CD59转运到PNH CD59-红细胞后确实能够抑制由补体激活而引起的溶血。同时，也进一步提示：根据细胞表面工程的原理，若能采用一种比较简单的方法转运红细胞囊泡以纠正或弥补PNH红细胞缺乏GPI-蛋白的缺陷，则有可能为PNH的治疗开辟一条新的途径。
, 百拇医药
△国家自然科学基金(39779334)，卫生部基金(98-1-025)，北京市自然科学基金(7982032)资助；*中国医学科学院协和医院血液内科，北京100730；#通讯作者
参考文献
1 Medof ME,Nagarajan S.Surface protein engineering and GPI protein. FASEJ,1996,10：574～579
2 Butikofer P,Kuypers FA，Xu CM, et al. Enrichment of two glycosyl-phosphatidylinositol-anchored proteins acetylcholinesterase and decay accelerating factor in vesicles relased from human red blood cells.Blood,1989,74:1481～1485
, 百拇医药
3 Shinar E,Shalev O,Rachmailewitz EA,et al. Skeleton abnormalities in seven β-thalassemia.Blood,1988,70:158～164
4 许彩民，卢 红，崔 毅，等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症红细胞乙酰胆碱酯酶的研究.生物化学杂志，1994.10：471～476
5 张之南，殷德厚主编.贫血.重庆：科学技术文献出版社重庆分社，1989.349～350
6 崔 毅，张之南，刘尔坤，等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症红细胞膜磷脂酰肌醇连接蛋白缺失的研究.中华血液学杂志，1992，13：515～517
(1997-07-02收稿), http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005
关键词：红细胞囊泡；反应性溶血膜抑制物；阵发性睡眠性血红蛋白尿症
中国医学科学院学报990408 摘要 目的 在体外观察是否能将富含CD59的红细胞囊泡转运到缺失CD59的阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)红细胞膜上，以改善PNH溶血，为PNH的治疗提供新的线索。方法 采用免疫亲和层析分离技术分离PNH CD59-红细胞，采用Western印迹分析、流式细胞仪及蛇毒因子溶血实验等检测和分析红细胞与囊泡的结合。结果 Western印迹分析显示，红细胞囊泡含有CD59；流式细胞仪测定表明，PNH CD59-红细胞与囊泡结合后，CD59的荧光标记率明显增高(P<0.001)；蛇毒因子溶血实验显示，加入囊泡后PNH CD59-红细胞溶血度也显著下降(P<0.05)。结论 红细胞囊泡上的CD59可以在体外转运到PNH CD59-红细胞上，并产生抑制补体溶血的作用，使PNH CD59-红细胞在体外受补体攻击时不易溶血。
, 百拇医药
中图号 R556.6
Protection of PNH Red Blood Cells from Lysis by Transfering GPI-anchored Protein Vesicles of Normal Human RBCs in vitro Protein Vesicles of Normal Human RBCs in vitro
Yang Yang Xu Caimin# Pan Huazhen, et al
(National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005)
Objective To observe the transfer of GPI-anchored protein CD59 from vesicles of normal RBCs to paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH) RBCs can correct the susceptibility to complement attack in vitro.Methods Vesicles released from normal RBCs under ATP depletion or storage, are rich in CD59. PNH CD59- RBCs were separated by elution from immunoaffinity column bound with monoclonal antibody CD59,and then incubated with normal RBCs vesicles.The content of CD59 in vesicles and RBCs was detected by Western blot and flowcytometric analysis respectively and hemolysis of PNH CD59- RBCs was detected by cobra venom factor hemolysis test. Results The fluorescence intensity of PNH CD59- RBCs were increased from (1.68±0.57)% to (58.42±8.25)% and the hemolysis was significantly decreased from (27.13±9.69)% to (19.49±7.61)% after incubation with vesicles prepared from normal donors (P<0.05),while normal RBCs had no obvious change before and after the same treatment.(P>0.05).Conclusions It seems that CD59 protein molecules could be transfered from normal RBCs vesicles to PNH CD59- RBCs and retaining the complement regulatory function. CD59- RBCs could be rendered less liable to hemolyze during complement attack.
, 百拇医药
Key words vesicles of human RBCs; CD59； paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是在造血干细胞水平发病，患者外周血中病态与正常红细胞同时存在，病态细胞的共同特点是细胞膜表面的糖肌醇磷脂(glycosylphosphatidylinositol,GPI)-蛋白减少或缺乏。GPI-蛋白是一类特殊的膜蛋白，目前已发现该类有80多种成员，与补体调节有关的蛋白有C3转换酶衰变加速因子(CD55)，反应性溶血膜抑制物(CD59)和C8结合蛋白(CD58)等。由于PNH患者红细胞膜上缺乏这些补体调节蛋白，所以红细胞易遭受补体破坏，发生溶血现象。对于PNH的治疗，至今尚缺少有效的方法。1996年Medof[1]提出GPI-蛋白能自动地从一个细胞膜上转运到另一个细胞膜上，这种转运可在同一个细胞的不同部位或在细胞与细胞之间进行。笔者设想是否可将富含GPI-蛋白的正常红细胞囊泡转移到PNH患者的病态红细胞上，以达到缓解PNH溶血的目的。本实验以PNH患者红细胞(缺乏CD59，CD59-)为研究对象，以正常人红细胞囊泡(主要含GPI-蛋白CD59，)作为GPI-蛋白供体，将正常人红细胞囊泡转运到PNH CD59-红细胞上，通过蛇毒因子CoF溶血实验检测溶血现象的改善情况。
, 百拇医药
1 材料和方法
研究对象 正常人红细胞购自北京协和医院血库，PNH患者血标本采自协和医院门诊。
正常红细胞囊泡的制备 采用两种方法制备，(1)存储法：按文献[2]的方法进行；(2) ATP耗空法：按文献[2]的方法进行。制备的囊泡分装后存于-70℃备用。用Folin-酚法测定蛋白含量。
Western印迹分析 按文献[3]的方法进行免疫印迹实验。一抗用CD59单克隆抗体(购自Pharmingen公司)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(购自中山公司)，用DAB(diaminobenzidine，购自Sigma公司)作底物显色。
PNH CD59-红细胞的分离 采用protein A-sepharose 6MB免疫亲和层析法分离PNH CD59-和CD59+红细胞[4]。2%PNH红细胞悬液流经sepharose层析柱时，PNH CD59+红细胞保留在柱上，CD59-红细胞流出，收集流出的PNH CD59-红细胞备用。
, 百拇医药
红细胞与囊泡的结合 将正常人红细胞和经柱层析分离的PNH CD59-红细胞用生理盐水配制成体积分数为2%的细胞悬液，分成4组进行实验(每组取细胞悬液0.1 ml): (1) 正常人红细胞；(2) 正常人红细胞+0.05 ml囊泡；(3) PNH CD59-红细胞；(4) PNH CD59-红细胞+0.05 ml囊泡。(囊泡的蛋白含量为4.7 mg/ml)37℃孵育2 h后，用大量生理盐水洗去游离的囊泡。
PNH CD59-红细胞结合囊泡后CD59荧光标记率的测定 将上述4组红细胞用2%的BSA配成体积分数为1%的红细胞悬液，取0.1 ml红细胞悬液与0.1 ml CD59单克隆抗体(1∶1 000稀释)在室温孵育30 min，以生理盐水洗1次，再与异硫氰酸光素(FITC)标记的二抗结合。采用流式细胞仪(Epics Division of Coulter Corporation)检测4组红细胞的荧光标记率(%)。
, 百拇医药
PNH红细胞蛇毒因子(CoF)溶血实验 按文献[5]的方法进行，在波长415 nm条件下比色，计算溶血度(%)。
统计学处理 数据以均值±标准差表示，采用配对t检验。
2 结果
红细胞囊泡CD59的鉴定 Western印迹分析显示，在相对分子质量为1.8×104～2.0×104处呈现单一的与CD59单克隆抗体反应的条带(附图)。
附图 免疫印迹法鉴定囊泡CD59图谱
Fig Western blot analysis of CD59 in RBCs vesicles
, 百拇医药
1.molecular weight standards,SDS-PAGE stained with aminoblack;
2.storage vesicles;3.ATP depletion-induced vesicles
PNH CD59-红细胞与囊泡保温后CoF溶血实验 6例正常对照组和6例PNH患者红细胞溶血度测定结果显示，对照组红细胞加和不加囊泡的溶血度分别为(1.54±0.97)%和(2.09±1.15)%，相差(0.557±0.56)%两组间差异无显著性(P>0.05)；而PNH组红细胞加和不加囊泡的溶血度分别为(19.49±7.61)%和(27.13±9.69)%，相差(7.63±5.23)%，两组间差异有显著性意义(P<0.05)。
CD59-细胞结合囊泡后流式细胞仪检测结果 6例PNH患者CD59-红细胞CD59荧光标记率在加囊泡前为(1.68±0.57)%，加囊泡后荧光标记率上升至(58.42±8.52)%，加囊泡作用前后，差别有极显著意义(P<0.001)。
, 百拇医药
3 讨论
PNH是由于PIG-A基因突变导致GPI-蛋白的缺乏或减少引起的溶血性疾病。根据Medof[1]提出的GPI-蛋白可转运的原理，以及红细胞经4℃存储或ATP耗竭时，红细胞易形成 直径150～300 nm的囊泡从红细胞脱落，且囊泡富含GPI-蛋白、CD55、乙酰胆碱酯酶[2]等事实，本研究制备的囊泡经Western印迹方法鉴定显示，囊泡富含有CD59。进而以红细胞囊泡作为CD59供体，将PNH红细胞经免疫亲和层析柱分离得到的PNH CD59-红细胞与囊泡共孵育，使CD59转运到PNH CD59-红细胞上。流式细胞仪检测表明，PNH CD59-红细胞与囊泡结合后，CD59荧光标记率显著提高，提示富含CD59的红细胞囊泡在体外条件下能够转运到PNH CD59-红细胞上。蛇毒因子溶血实验结果表明，PNH CD59-红细胞加囊泡后，溶血度明显降低，而正常人红细胞加囊泡后其溶血度不受影响。上述结果表明囊泡中的CD59转运到PNH CD59-红细胞后确实能够抑制由补体激活而引起的溶血。同时，也进一步提示：根据细胞表面工程的原理，若能采用一种比较简单的方法转运红细胞囊泡以纠正或弥补PNH红细胞缺乏GPI-蛋白的缺陷，则有可能为PNH的治疗开辟一条新的途径。
, 百拇医药
△国家自然科学基金(39779334)，卫生部基金(98-1-025)，北京市自然科学基金(7982032)资助；*中国医学科学院协和医院血液内科，北京100730；#通讯作者
参考文献
1 Medof ME,Nagarajan S.Surface protein engineering and GPI protein. FASEJ,1996,10：574～579
2 Butikofer P,Kuypers FA，Xu CM, et al. Enrichment of two glycosyl-phosphatidylinositol-anchored proteins acetylcholinesterase and decay accelerating factor in vesicles relased from human red blood cells.Blood,1989,74:1481～1485
, 百拇医药
3 Shinar E,Shalev O,Rachmailewitz EA,et al. Skeleton abnormalities in seven β-thalassemia.Blood,1988,70:158～164
4 许彩民，卢 红，崔 毅，等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症红细胞乙酰胆碱酯酶的研究.生物化学杂志，1994.10：471～476
5 张之南，殷德厚主编.贫血.重庆：科学技术文献出版社重庆分社，1989.349～350
6 崔 毅，张之南，刘尔坤，等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症红细胞膜磷脂酰肌醇连接蛋白缺失的研究.中华血液学杂志，1992，13：515～517
(1997-07-02收稿), http://www.100md.com