胆囊结石中胆固醇代谢变化的实验研究
作者：赵纪春 舒晔 程南生 肖路加 朱红
单位：赵纪春(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；舒晔(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；程南生(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；肖路加(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；朱红(华西医科大学基础医学院生化教研室，四川 成都 610041)
关键词：胆结石/代谢；胆固醇/代谢；胆结石/病因学；胆固醇；膳食；疾病模型；动物
中国普通外科杂志000210 摘 要：目的 探讨胆囊结石的胆固醇代谢变化。方法 采用高胆固醇膳食诱发兔胆囊结石模型，对进食高胆固醇膳食后1，2，3，4周实验组和对照组血清脂蛋白胆固醇、肝脏总胆固醇(HTC)、胆汁中胆固醇(BC)和甘氨胆酸(GCA)，肝细胞低密度脂蛋白受体活性变化进行了动态研究。结果 高胆固醇膳食后，1周开始出现胆囊结石，2，3和4周分别有40%，60%，70%出现胆囊结石。血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，磷脂(PL)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)，HTC，BC均逐渐明显升高(与对照组比较P均<0.05)；高密度脂蛋白胆固醇及其亚组分(HDL-C，HDL2-C，HDL3-C)有降低趋势，但无显著性差异(P>0.05)；GCA逐渐降低，以3周和4周时明显(P<0.05)；125I-LDL与肝细胞低密度脂蛋白受体(LDLr)最大结合力(Bmax)在1周组略升高(P<0.05)，2周组逐渐下降，3周和4周组时明显下降(P<0.05)，解离常数Kd值逐渐升高，以3周和4周组明显(P<0.05)。结论 随着高胆固醇膳食进食时间延长，血清及肝脏中胆固醇均增加，胆汁中胆固醇增加，肝细胞低密度脂蛋白受体活性下降，可能致胆汁中甘氨胆酸合成减少，成石性胆汁形成。提示胆固醇代谢中不同环节的变化均可在胆囊结石中发挥作用。
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分类号：R575.62；R151.2 文献标识码：A
文章编号：1005-6947(2000)02-0124-05
Changes of cholesterol metabolism in cholesterol gallstone
formation in the rabbit
ZHAO Ji-chun, SHU Ye, CHENG Nan-sheng, XIAO Lu-jia
(Department of Surgery, The First Affiliated Hospital, West China University of Medical Science, Chengdu 610041, China)
, 百拇医药
ZHU Hong
(Department of Biochimestry, West China University of Medical Science, Chengdu 600041, China)
Abstract：Objective To study the changes of cholesterol metabolism in gallstone formation in the rabbit. Methods Rabbit model was adopted with gallstone induced by high cholesterol diet. Dynamic study on the serum lipoprotein cholesterol, hepatic total cholesterol, bile cholesterol and glycocholate, and low density lipoprotein(LDL) recepter activity of hepatocytes had been conductd for the test and control groups after 1,2,3 and 4 weeks respectively. Results (1) After high cholesterol diet, gallstone appearred within one week; and 40%,60% and 70% of animals showed gallstone after 2,3 and 4 weeks respectively. (2) The serum concentration of total cholesterol(TC), triglyceride(TG), phospholipid(PL), low density lipoprotein cholesterol(LDL-C), very low density lipoprotein cholesterol(VLDL-C), as well as hepatic total cholesterol and bile cholesterol increased significantly(P<0.05). High density lipoprotein cholesterol and its subfraction(HDL-C, HDL2-C, HDL3-C) decreased slightly, but without statistical significance(P>0.05). Glycocholate(GCA) in bile in 3 and 4 weeks groups decreased significantly(P<0.05). The Bmax values of LDL receptor of hepatocytes binding to 125I-LDL decreased significantly in 3 and 4 weeks group(P<0.05).Kd values of those became increased in 3 and 4 weeks groups(P<0.05), which suggested that the activity of LDL receptor decreased gradually. Conclusions After intake of high cholesterol diet, the serum and hepatic cholesterol increase with time, which possibly causes an enhanced secretion or biliary cholesterol into bile and reduces the synthesis of glycocholate into bile. It is suggested that various steps of cholesterol metabolism play a role in gallstone formation.
, 百拇医药
Key words：CHOLELITHIASIS/metab；CHOLESTEROL/metab；CHOLELITHIASIS/etiol；CHOLESTEROL,DIETARY；DISEASES MODELS,ANIMAL▲
胆囊胆固醇结石常见，脂蛋白胆固醇代谢紊乱的各个环节及其在成石过程中的作用尚有争论。本研究采用高胆固醇膳食制造兔胆囊胆固醇结石模型，观察胆囊结石形成过程中肝脏及胆汁中胆固醇以及肝细胞低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)的动态变化，以从分子受体水平研究胆囊结石的成因。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及实验方法
成年健康日本杂交大耳白兔50只(华西医科大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重1.80～2.25kg/只。随机分为5组，即对照组(Con)、1周组(1W组)，2周组(2W组)，3周组(3W组)及4周组(4W组)，每组10只。对照组喂普通颗粒饲料(华西医科大学实验动物中心提供)4周，其余试验组喂含1.2%高胆固醇饲料[1]，均单笼饲养，常规进食、饮水。
, 百拇医药
1.2 标本收集
根据各实验组饲养时间，剖杀前禁食12h。局麻下开腹，为减少溶血，经腹主动脉插管抽血，分离血清用于全套脂质的测定。取适量肝组织行胆固醇测定，取下胆囊，收集胆汁并观察成石情况。
1.3 检测指标
1.3.1 胆囊胆汁胆固醇结晶及结石鉴定 结石判断标准：肉眼观察胆汁内有成形粗大颗粒，光镜下观察为致密大团块结晶，经红外光谱分析证实为胆固醇即定为结石[1]。
1.3.2 血脂，肝脏总胆固醇，胆汁胆固醇及甘氨胆酸 甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及其亚成分(HDL2-C，HDL3-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)，均用酶法测定(东欧生物工程试剂仪器厂产药盒，上海光电仪器设备厂GW-351型光电比色仪比色)；磷脂(PL)用抗坏血酸法测定；肝脏总胆固醇(HTC)及胆汁中胆固醇(BC)经提取后采用硫铁磷法测定；胆汁中甘氨胆酸(GCA)采用双波长薄层扫描法测定。
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1.3.3 肝细胞LDL受体活性
1.3.3.1 LDL自行分离纯化 Na125I无载体，英国产品。胶原酶(Ⅱ型)及HEPES分别为Sigma和Merck公司产品。
1.3.3.2 血清 脂蛋白制备 血清极低密度脂蛋白(VLDL，d=1.006)，低密度脂蛋 白(LDL，d=1.0400-1.0560)、高密度脂蛋白 (HDL，d=1.1750-1.2000)、无脂血清(LPDS，d>1.2100)， 按1次密度梯度离心法分离。所得各脂蛋白液置4℃保存，经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实为纯化的LDL，以牛血清白蛋白(BSA)作标准，按Makwell方法测定LDL和LPDS蛋白含量。
1.3.3.3 125I-LDL制备 按改良MacFarIane法(单氯化碘法)[2]。用Na125I标记LDL，标记后的125I-LDL比放射性为70～220cpm/ng，游离碘及脂质标记率分别小于1%和5%。
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1.3.3.4 兔肝实质细胞的分离 基本按照Seglen方法分离肝细胞。经门静脉插管，先以D-Hank's液灌流肝脏5min，再以0.05%胶原酶液(Ⅱ型)(配于100mmol/L HEPES, 5mmol/L, CaCl2, 3.9g/L NaCl, 0.5g/LKCL, 0.1% BSA, pH7.6溶液内)灌流10min。将肝脏移至冰浴中，用镊子去肝包膜轻轻将肝组织分散，加入少量新鲜胶原酶液再于37℃水浴内轻轻摇动保温10min。取出置4℃ Hank's液中终止反应，用100目及180目两层筛网过 滤除去结缔组织，滤液于5000rpm, 离心10min，细胞沉淀用冷Hank's液洗5次，最后1次离心沉淀即为纯化的肝实质细胞，本实验分离的肝细胞纯度大于95%，台盼兰染色存活率大于90%，将上述分离的肝细胞浮于培养液(20mmol/L HEPES, 8.0g/L NaCl, 0.4g/L KCl, 0.06g/L Na2HPO4 2H2O, 0.06g/L KH2PO4, 0.2g/L MgSO4 7H2O, 0.4g/L CaCl 2H2O, 0.18g/L葡萄糖及10% LPDS， pH7.4)中并在冰浴中平衡30min，加入新鲜培养液稀释至一定浓度的细胞悬液(肝实质细胞(1～2)×105/ml)，立即进行受体分析实验。另取一定量细胞悬液(计数后)用0.1N MaOH裂解，4℃过液，用改良Lowry法测定细胞蛋白含量。
, 百拇医药
1.3.3.5 兔肝实质细胞受体结合试验 参照Brown和Goldstein方法[2]进行。取上述细胞悬液100μl， 加入一定浓度的125I-LDL至总体积200μl， 4℃保温2h，置冰浴中止反应。离心收集细胞并用1ml PBS洗3次后，测定沉淀细胞的放射性，此即为细胞在4℃对125I-LDL的总结合量。细胞对125I-LDL的非特异结合采用同时加入过量25倍非标记LDL的 方法测定，总结合减去非特异性结合即为特异性结合量。根据细胞蛋白含量， LDLR活性以每毫克(mg)细胞蛋白结合125I-LDL 的纳克(ng)数表示。
1.4 统计学方法
统计分析均采用IBM-AT计算机SPSS软件包处理。
2 实验结果
, 百拇医药
2.1 胆固醇结晶与成石情况
对照组胆囊胆汁几乎无胆固醇结晶，高胆固醇膳食试验组1周组胆固醇结晶开始增加，2周组明显增加，3周及4周组更明显增加；出现结石率，1周组为20%(2/10)，2周组40%(4/10)，3周组60%(6/10)，4周组70%(7/10)，与对照组比P<0.05。
2.2 血清脂质、肝脏及胆汁胆固醇和胆汁甘氨胆酸测定结果
各组测定结果见表1。
表1 各组血脂质，肝脏及胆汁胆固醇和胆汁甘氨酸测定结果(mmol/L) 项目
Con
1W
2W
, 百拇医药
3W
4W
GCA
0.21±0.12
0.19±0.13
0.16±0.11
0.13±0.021)
0.09±0.081)
TC
0.79±0.03
4.50±1.861)
, 百拇医药
7.23±3.87
16.35±3.491)，2)，3)
17.21±4.781)，2)，3)
TG
0.83±0.21
1.10±0.45
1.45±0.51
1.52±0.411)
2.87±0.811)，2)，3)
PL
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0.94±0.29
2.37±0.681)
3.10±1.321)
6.24±2.431)，2)，3)
6.71±2.801)，2)，3)
HDL-C
0.70±0.21
0.72±0.30
0.52±0.23
0.55±0.21
, 百拇医药
0.58±0.24
HDL2-C
0.32±0.10
0.35±0.11
0.52±0.13
0.27±0.11
0.31±0.16
HDL3-C
0.31±0.11
0.37±0.17
0.26±0.12
, 百拇医药
0.29±0.17
0.28±0.15
LDL-C
0.05±0.02
0.90±0.131)
1.88±0.971)，3)
4.86±0.981)，2)，3)
5.56±1.071)，2)，3)
VLDL-C
0.06±0.01
, 百拇医药
0.45±0.181)
1.22±0.911)，3)
3.43±0.871)，2，3)
3.76±1.011)，2)，3)
BC
2.51±1.36
3.58±1.98
3.85±1.41
4.32±1.231)
5.02±1.861)
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HTC
25.02±6.21
33.63±16.861)
36.23±8.311)
65.75±33.411)，3)
83.87±353)
注：1) 1W、2W、3W、4W组与Con组比P<0.05；2) 3W、4W与2W组比P<0.05；3) 2W、3W、4W与1W比P<0.05
2.3 各组肝细胞LDLR最大结合力(Bmax)及解离常数(Kd)值测定结果
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动物进 高胆固醇膳食前，Bmax值为(218.13±9.51)ng/mg细胞蛋白，进食高胆固醇膳食1周后为(231.51±10.10)ng/mg细胞蛋白(P>0.05)；2周组则 开始下降至(193.62±9.23)ng/mg细胞蛋白，3周组下降到(123.20±8.65)ng/mg细胞蛋白，4周组为(88.26±6.27)ng/mg细胞蛋白，与进食高胆固醇膳食前有显著差异(P<0.05)。Kd值对照组为(12.85±3.43)ng/ml，进食高胆固醇膳食后1周时无明显变化，2周时开始升高，到3周及4周时明显升高(P<0.05)，表明受体亲和力降低。综上可见，随着进食高胆固醇膳食时间延长，肝细胞LDLR活性逐渐下降，以3周组及4周组明显(表2)。表2 各组肝实质细胞LDL受体Bmax及Kd值 项目
Con
1W
2W
, 百拇医药 3W
4W
Bmax(ng/mg)
218.13±9.51
231.51±10.1
193.62±9.23
123.20±8.651)
88.26±6.271)，2)
Kd(mg/ml)
12.85±3.43
12.78±3.23
, 百拇医药
14.39±2.66
17.74±2.21
16.55±1.871)
注：1) 3W，4W组与Con,1W，2W组比P<0.05；2) 4W组与3W组比P<0.05
3 讨 论
临床流行病学资料发现，在胆囊胆固醇结石病人中，血清VLDL-C，LDL-C明显升高。血清脂蛋白胆固醇浓度主要由3个因素决定：①脂蛋白胆固醇形成速率；②依赖受体转运率及受体亲和力大小；③非受体依赖转运率。由于胆汁中胆固醇过饱和以及胆汁酸减少是胆囊结石形成的重要原因，而血清胆固醇主要存在于LDL中，LDL大部分经LDLR在肝脏内代谢降解，再经肝脏合成胆汁酸或分泌胆固醇进入胆汁。因此，LDL代谢途径在调节肝脏分泌胆固醇或合成胆汁酸进入胆汁中可能起着重要作用。新近研究认为，血清LDL-C浓度的稳定状态由4个因素决定：①LDL-C形成速率；②LDL-C从血清经受体转运速率；③LDL-C颗粒与LDL受体亲和力；④非LDLR途径LDL-C转运率。本研究结果显示：随着进食高胆固醇膳食时间延长，血清VLDL-C，LDL-C，肝脏胆固醇和胆汁胆固醇进行性升高，表明LDL-C形成增加后，其转运率也加强。高胆固醇血症时，血清胆固醇可经肝细胞浆膜转运分泌进入胆汁或经肝脏低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor-related protein, LRP)途径摄入胆固醇再分泌入胆汁[3，4]。Bowden[5]发现摄入高胆固醇膳食后，血清LDL-C水平增加，LDLR活性降低。随着血中LDL-C持续升高，较多的LDL-C摄入肝细胞内，抑制了LDLR合成，使LDLR代谢途径发生障碍，血中LDL-C水平进一步升高，肝细胞则启动LDL-C的非LDLR途径转运，后者为代偿机制，不受细胞内胆固醇反馈抑制调节[6]，从而加速胆固醇排除，致胆汁中胆固醇增加。本研究显示，动物进食高胆固醇膳食后1周时，Bmax值 略有升高，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。 解离常数Kd值无明显变化；到3和4周时，肝细胞LDLR Bmax值明显减少，而Kd值明显增大，表明LDLR活性降低。另一方面，胆汁中胆汁酸减少和胆固醇过饱和与肝脏胆固醇不同的代谢紊乱有关：①脂蛋白胆固醇向肝脏内流增加；②肝脏胆固醇合成增加；③胆固醇在肝脏内酯化减少致游离胆固醇增加；④胆固醇经肝脏合成胆汁酸减少。前三者均可致肝脏分泌入胆汁中的胆固醇增加，最后者可致胆汁中胆汁酸减少，成石性胆汁形成。本研究结果还显示：随着进食高胆固醇膳食时间增加，肝脏胆固醇和胆汁中胆固醇均逐渐增加，而胆汁中甘氨胆酸逐渐减少。由于进食高胆固醇膳食后，肝脏合成胆固醇受到抑制而减少，肝脏内胆固醇主要来自肝脏摄取的血清脂蛋白胆固醇，但不同脂蛋白胆固醇经肝脏代谢后参与合成的胆汁酸也不同。正常情况下，经肝脏LDLR摄入的LDL游离胆固醇优先合成胆酸，尤其与参与胆酸和甘氨酸结合形成甘氨胆酸密切相关。Nicolosi[7]发现LDLR活性升高，血浆LDL-C降低，胆汁中甘氨胆酸量升高。Everson[8]发现刺激肝脏胆汁酸合成可降低血中LDL-C浓度。Reihner[9]报道服用消胆胺后，肝细胞LDLR活性增加，同时胆汁酸合成相应增强。因此，进食高胆固醇食后，由于肝细胞受体活性下降，经此途径摄取胆固醇供以合成胆汁酸相应减少，使胆汁中胆固醇呈过饱和，易于结晶成石。■
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基金项目：卫生部青年科研基金(942170)和纽约中华医学基金资助项目(Y-9411)
作者简介：赵纪春(1964-)，男，山东五莲人，华西医科大学附属第一医院讲师，博士，从事胆石成因方面研究。
参考文献：
[1]别平，孟宪钧，杨可祯，等.前列腺素环磷酸腺苷在胆囊结石形成中的作用[J].中华外科杂志，1987，25(6)：339～342.
[2]Brown MS, Goldstein JL. A receptor-mediated pathway for cholesterol for cholesterol pathway homestasis[J]. Sciences, 1986,232(1):34～47.
[3]Kern FJ. Effects of dietary cholesterol in cholesterol and bile acid homeostasis in patients with cholesterol gallstones[J]. J Clin Invest, 1994,93(3):1186～1194.
, 百拇医药
[4]Nervi FI, Marinouie I, Rogott A, et al. Regulation of biliary cholesterol secretion: functional relationship between the canalicular and sinusoidal cholesterol secretory pathways in the rat[J]. J Clin Invest, 1988,82(6):1818～1826.
[5]Bowden DA. Down-regulation of the low density lipoprotein receptor by dietary cholesterol[J]. Am J Clin Nutr, 1984,39(3):360～372.
[6]Spady DK, Meddings SM, Dietschy JM. Kinetic constants for receptor-dependent and receptor-independent low density lipoprotein transport in the tissues of the rat and hamster[J]. J Clin Invest, 1986,77(5):1471～1481.
, 百拇医药
[7]Nicolosi RJ, Stucchi AF, Kowala MC, et al. Effect of dietary fat saturation and cholesterol on LDL composition and metabolism[J]. Arterioselerosis, 1990,10(1):119～128.
[8]Everson GT, Daggy BP, Mckinley GT, et al. Dietary fiber(psillium) lowers LDL cholesterol by stimulating bile acid synthesis in man[J]. Hepatology, 1991,14(suppl):148a.
[9]Reihner E, Angelin B, Rudling M, et al. Regulation of hepatic cholesterol metabolism in human: stimulatory effects of cholestyramine on HMG-COA reductase activity and low density lipoprotein receptor expression in gallstone patients[J]. J Lipid Res, 1990,31(12):2219～2226.
收稿日期：1998-10-26
修稿日期：2000-02-14, 百拇医药
单位：赵纪春(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；舒晔(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；程南生(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；肖路加(华西医科大学附属第一医院普外科， 四川 成都 610041)；朱红(华西医科大学基础医学院生化教研室，四川 成都 610041)
关键词：胆结石/代谢；胆固醇/代谢；胆结石/病因学；胆固醇；膳食；疾病模型；动物
中国普通外科杂志000210 摘 要：目的 探讨胆囊结石的胆固醇代谢变化。方法 采用高胆固醇膳食诱发兔胆囊结石模型，对进食高胆固醇膳食后1，2，3，4周实验组和对照组血清脂蛋白胆固醇、肝脏总胆固醇(HTC)、胆汁中胆固醇(BC)和甘氨胆酸(GCA)，肝细胞低密度脂蛋白受体活性变化进行了动态研究。结果 高胆固醇膳食后，1周开始出现胆囊结石，2，3和4周分别有40%，60%，70%出现胆囊结石。血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，磷脂(PL)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)，HTC，BC均逐渐明显升高(与对照组比较P均<0.05)；高密度脂蛋白胆固醇及其亚组分(HDL-C，HDL2-C，HDL3-C)有降低趋势，但无显著性差异(P>0.05)；GCA逐渐降低，以3周和4周时明显(P<0.05)；125I-LDL与肝细胞低密度脂蛋白受体(LDLr)最大结合力(Bmax)在1周组略升高(P<0.05)，2周组逐渐下降，3周和4周组时明显下降(P<0.05)，解离常数Kd值逐渐升高，以3周和4周组明显(P<0.05)。结论 随着高胆固醇膳食进食时间延长，血清及肝脏中胆固醇均增加，胆汁中胆固醇增加，肝细胞低密度脂蛋白受体活性下降，可能致胆汁中甘氨胆酸合成减少，成石性胆汁形成。提示胆固醇代谢中不同环节的变化均可在胆囊结石中发挥作用。
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分类号：R575.62；R151.2 文献标识码：A
文章编号：1005-6947(2000)02-0124-05
Changes of cholesterol metabolism in cholesterol gallstone
formation in the rabbit
ZHAO Ji-chun, SHU Ye, CHENG Nan-sheng, XIAO Lu-jia
(Department of Surgery, The First Affiliated Hospital, West China University of Medical Science, Chengdu 610041, China)
, 百拇医药
ZHU Hong
(Department of Biochimestry, West China University of Medical Science, Chengdu 600041, China)
Abstract：Objective To study the changes of cholesterol metabolism in gallstone formation in the rabbit. Methods Rabbit model was adopted with gallstone induced by high cholesterol diet. Dynamic study on the serum lipoprotein cholesterol, hepatic total cholesterol, bile cholesterol and glycocholate, and low density lipoprotein(LDL) recepter activity of hepatocytes had been conductd for the test and control groups after 1,2,3 and 4 weeks respectively. Results (1) After high cholesterol diet, gallstone appearred within one week; and 40%,60% and 70% of animals showed gallstone after 2,3 and 4 weeks respectively. (2) The serum concentration of total cholesterol(TC), triglyceride(TG), phospholipid(PL), low density lipoprotein cholesterol(LDL-C), very low density lipoprotein cholesterol(VLDL-C), as well as hepatic total cholesterol and bile cholesterol increased significantly(P<0.05). High density lipoprotein cholesterol and its subfraction(HDL-C, HDL2-C, HDL3-C) decreased slightly, but without statistical significance(P>0.05). Glycocholate(GCA) in bile in 3 and 4 weeks groups decreased significantly(P<0.05). The Bmax values of LDL receptor of hepatocytes binding to 125I-LDL decreased significantly in 3 and 4 weeks group(P<0.05).Kd values of those became increased in 3 and 4 weeks groups(P<0.05), which suggested that the activity of LDL receptor decreased gradually. Conclusions After intake of high cholesterol diet, the serum and hepatic cholesterol increase with time, which possibly causes an enhanced secretion or biliary cholesterol into bile and reduces the synthesis of glycocholate into bile. It is suggested that various steps of cholesterol metabolism play a role in gallstone formation.
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Key words：CHOLELITHIASIS/metab；CHOLESTEROL/metab；CHOLELITHIASIS/etiol；CHOLESTEROL,DIETARY；DISEASES MODELS,ANIMAL▲
胆囊胆固醇结石常见，脂蛋白胆固醇代谢紊乱的各个环节及其在成石过程中的作用尚有争论。本研究采用高胆固醇膳食制造兔胆囊胆固醇结石模型，观察胆囊结石形成过程中肝脏及胆汁中胆固醇以及肝细胞低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)的动态变化，以从分子受体水平研究胆囊结石的成因。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及实验方法
成年健康日本杂交大耳白兔50只(华西医科大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重1.80～2.25kg/只。随机分为5组，即对照组(Con)、1周组(1W组)，2周组(2W组)，3周组(3W组)及4周组(4W组)，每组10只。对照组喂普通颗粒饲料(华西医科大学实验动物中心提供)4周，其余试验组喂含1.2%高胆固醇饲料[1]，均单笼饲养，常规进食、饮水。
, 百拇医药
1.2 标本收集
根据各实验组饲养时间，剖杀前禁食12h。局麻下开腹，为减少溶血，经腹主动脉插管抽血，分离血清用于全套脂质的测定。取适量肝组织行胆固醇测定，取下胆囊，收集胆汁并观察成石情况。
1.3 检测指标
1.3.1 胆囊胆汁胆固醇结晶及结石鉴定 结石判断标准：肉眼观察胆汁内有成形粗大颗粒，光镜下观察为致密大团块结晶，经红外光谱分析证实为胆固醇即定为结石[1]。
1.3.2 血脂，肝脏总胆固醇，胆汁胆固醇及甘氨胆酸 甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及其亚成分(HDL2-C，HDL3-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)，均用酶法测定(东欧生物工程试剂仪器厂产药盒，上海光电仪器设备厂GW-351型光电比色仪比色)；磷脂(PL)用抗坏血酸法测定；肝脏总胆固醇(HTC)及胆汁中胆固醇(BC)经提取后采用硫铁磷法测定；胆汁中甘氨胆酸(GCA)采用双波长薄层扫描法测定。
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1.3.3 肝细胞LDL受体活性
1.3.3.1 LDL自行分离纯化 Na125I无载体，英国产品。胶原酶(Ⅱ型)及HEPES分别为Sigma和Merck公司产品。
1.3.3.2 血清 脂蛋白制备 血清极低密度脂蛋白(VLDL，d=1.006)，低密度脂蛋 白(LDL，d=1.0400-1.0560)、高密度脂蛋白 (HDL，d=1.1750-1.2000)、无脂血清(LPDS，d>1.2100)， 按1次密度梯度离心法分离。所得各脂蛋白液置4℃保存，经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实为纯化的LDL，以牛血清白蛋白(BSA)作标准，按Makwell方法测定LDL和LPDS蛋白含量。
1.3.3.3 125I-LDL制备 按改良MacFarIane法(单氯化碘法)[2]。用Na125I标记LDL，标记后的125I-LDL比放射性为70～220cpm/ng，游离碘及脂质标记率分别小于1%和5%。
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1.3.3.4 兔肝实质细胞的分离 基本按照Seglen方法分离肝细胞。经门静脉插管，先以D-Hank's液灌流肝脏5min，再以0.05%胶原酶液(Ⅱ型)(配于100mmol/L HEPES, 5mmol/L, CaCl2, 3.9g/L NaCl, 0.5g/LKCL, 0.1% BSA, pH7.6溶液内)灌流10min。将肝脏移至冰浴中，用镊子去肝包膜轻轻将肝组织分散，加入少量新鲜胶原酶液再于37℃水浴内轻轻摇动保温10min。取出置4℃ Hank's液中终止反应，用100目及180目两层筛网过 滤除去结缔组织，滤液于5000rpm, 离心10min，细胞沉淀用冷Hank's液洗5次，最后1次离心沉淀即为纯化的肝实质细胞，本实验分离的肝细胞纯度大于95%，台盼兰染色存活率大于90%，将上述分离的肝细胞浮于培养液(20mmol/L HEPES, 8.0g/L NaCl, 0.4g/L KCl, 0.06g/L Na2HPO4 2H2O, 0.06g/L KH2PO4, 0.2g/L MgSO4 7H2O, 0.4g/L CaCl 2H2O, 0.18g/L葡萄糖及10% LPDS， pH7.4)中并在冰浴中平衡30min，加入新鲜培养液稀释至一定浓度的细胞悬液(肝实质细胞(1～2)×105/ml)，立即进行受体分析实验。另取一定量细胞悬液(计数后)用0.1N MaOH裂解，4℃过液，用改良Lowry法测定细胞蛋白含量。
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1.3.3.5 兔肝实质细胞受体结合试验 参照Brown和Goldstein方法[2]进行。取上述细胞悬液100μl， 加入一定浓度的125I-LDL至总体积200μl， 4℃保温2h，置冰浴中止反应。离心收集细胞并用1ml PBS洗3次后，测定沉淀细胞的放射性，此即为细胞在4℃对125I-LDL的总结合量。细胞对125I-LDL的非特异结合采用同时加入过量25倍非标记LDL的 方法测定，总结合减去非特异性结合即为特异性结合量。根据细胞蛋白含量， LDLR活性以每毫克(mg)细胞蛋白结合125I-LDL 的纳克(ng)数表示。
1.4 统计学方法
统计分析均采用IBM-AT计算机SPSS软件包处理。
2 实验结果
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2.1 胆固醇结晶与成石情况
对照组胆囊胆汁几乎无胆固醇结晶，高胆固醇膳食试验组1周组胆固醇结晶开始增加，2周组明显增加，3周及4周组更明显增加；出现结石率，1周组为20%(2/10)，2周组40%(4/10)，3周组60%(6/10)，4周组70%(7/10)，与对照组比P<0.05。
2.2 血清脂质、肝脏及胆汁胆固醇和胆汁甘氨胆酸测定结果
各组测定结果见表1。
表1 各组血脂质，肝脏及胆汁胆固醇和胆汁甘氨酸测定结果(mmol/L) 项目
Con
1W
2W
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3W
4W
GCA
0.21±0.12
0.19±0.13
0.16±0.11
0.13±0.021)
0.09±0.081)
TC
0.79±0.03
4.50±1.861)
, 百拇医药
7.23±3.87
16.35±3.491)，2)，3)
17.21±4.781)，2)，3)
TG
0.83±0.21
1.10±0.45
1.45±0.51
1.52±0.411)
2.87±0.811)，2)，3)
PL
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0.94±0.29
2.37±0.681)
3.10±1.321)
6.24±2.431)，2)，3)
6.71±2.801)，2)，3)
HDL-C
0.70±0.21
0.72±0.30
0.52±0.23
0.55±0.21
, 百拇医药
0.58±0.24
HDL2-C
0.32±0.10
0.35±0.11
0.52±0.13
0.27±0.11
0.31±0.16
HDL3-C
0.31±0.11
0.37±0.17
0.26±0.12
, 百拇医药
0.29±0.17
0.28±0.15
LDL-C
0.05±0.02
0.90±0.131)
1.88±0.971)，3)
4.86±0.981)，2)，3)
5.56±1.071)，2)，3)
VLDL-C
0.06±0.01
, 百拇医药
0.45±0.181)
1.22±0.911)，3)
3.43±0.871)，2，3)
3.76±1.011)，2)，3)
BC
2.51±1.36
3.58±1.98
3.85±1.41
4.32±1.231)
5.02±1.861)
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HTC
25.02±6.21
33.63±16.861)
36.23±8.311)
65.75±33.411)，3)
83.87±353)
注：1) 1W、2W、3W、4W组与Con组比P<0.05；2) 3W、4W与2W组比P<0.05；3) 2W、3W、4W与1W比P<0.05
2.3 各组肝细胞LDLR最大结合力(Bmax)及解离常数(Kd)值测定结果
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动物进 高胆固醇膳食前，Bmax值为(218.13±9.51)ng/mg细胞蛋白，进食高胆固醇膳食1周后为(231.51±10.10)ng/mg细胞蛋白(P>0.05)；2周组则 开始下降至(193.62±9.23)ng/mg细胞蛋白，3周组下降到(123.20±8.65)ng/mg细胞蛋白，4周组为(88.26±6.27)ng/mg细胞蛋白，与进食高胆固醇膳食前有显著差异(P<0.05)。Kd值对照组为(12.85±3.43)ng/ml，进食高胆固醇膳食后1周时无明显变化，2周时开始升高，到3周及4周时明显升高(P<0.05)，表明受体亲和力降低。综上可见，随着进食高胆固醇膳食时间延长，肝细胞LDLR活性逐渐下降，以3周组及4周组明显(表2)。表2 各组肝实质细胞LDL受体Bmax及Kd值 项目
Con
1W
2W
, 百拇医药 3W
4W
Bmax(ng/mg)
218.13±9.51
231.51±10.1
193.62±9.23
123.20±8.651)
88.26±6.271)，2)
Kd(mg/ml)
12.85±3.43
12.78±3.23
, 百拇医药
14.39±2.66
17.74±2.21
16.55±1.871)
注：1) 3W，4W组与Con,1W，2W组比P<0.05；2) 4W组与3W组比P<0.05
3 讨 论
临床流行病学资料发现，在胆囊胆固醇结石病人中，血清VLDL-C，LDL-C明显升高。血清脂蛋白胆固醇浓度主要由3个因素决定：①脂蛋白胆固醇形成速率；②依赖受体转运率及受体亲和力大小；③非受体依赖转运率。由于胆汁中胆固醇过饱和以及胆汁酸减少是胆囊结石形成的重要原因，而血清胆固醇主要存在于LDL中，LDL大部分经LDLR在肝脏内代谢降解，再经肝脏合成胆汁酸或分泌胆固醇进入胆汁。因此，LDL代谢途径在调节肝脏分泌胆固醇或合成胆汁酸进入胆汁中可能起着重要作用。新近研究认为，血清LDL-C浓度的稳定状态由4个因素决定：①LDL-C形成速率；②LDL-C从血清经受体转运速率；③LDL-C颗粒与LDL受体亲和力；④非LDLR途径LDL-C转运率。本研究结果显示：随着进食高胆固醇膳食时间延长，血清VLDL-C，LDL-C，肝脏胆固醇和胆汁胆固醇进行性升高，表明LDL-C形成增加后，其转运率也加强。高胆固醇血症时，血清胆固醇可经肝细胞浆膜转运分泌进入胆汁或经肝脏低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor-related protein, LRP)途径摄入胆固醇再分泌入胆汁[3，4]。Bowden[5]发现摄入高胆固醇膳食后，血清LDL-C水平增加，LDLR活性降低。随着血中LDL-C持续升高，较多的LDL-C摄入肝细胞内，抑制了LDLR合成，使LDLR代谢途径发生障碍，血中LDL-C水平进一步升高，肝细胞则启动LDL-C的非LDLR途径转运，后者为代偿机制，不受细胞内胆固醇反馈抑制调节[6]，从而加速胆固醇排除，致胆汁中胆固醇增加。本研究显示，动物进食高胆固醇膳食后1周时，Bmax值 略有升高，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。 解离常数Kd值无明显变化；到3和4周时，肝细胞LDLR Bmax值明显减少，而Kd值明显增大，表明LDLR活性降低。另一方面，胆汁中胆汁酸减少和胆固醇过饱和与肝脏胆固醇不同的代谢紊乱有关：①脂蛋白胆固醇向肝脏内流增加；②肝脏胆固醇合成增加；③胆固醇在肝脏内酯化减少致游离胆固醇增加；④胆固醇经肝脏合成胆汁酸减少。前三者均可致肝脏分泌入胆汁中的胆固醇增加，最后者可致胆汁中胆汁酸减少，成石性胆汁形成。本研究结果还显示：随着进食高胆固醇膳食时间增加，肝脏胆固醇和胆汁中胆固醇均逐渐增加，而胆汁中甘氨胆酸逐渐减少。由于进食高胆固醇膳食后，肝脏合成胆固醇受到抑制而减少，肝脏内胆固醇主要来自肝脏摄取的血清脂蛋白胆固醇，但不同脂蛋白胆固醇经肝脏代谢后参与合成的胆汁酸也不同。正常情况下，经肝脏LDLR摄入的LDL游离胆固醇优先合成胆酸，尤其与参与胆酸和甘氨酸结合形成甘氨胆酸密切相关。Nicolosi[7]发现LDLR活性升高，血浆LDL-C降低，胆汁中甘氨胆酸量升高。Everson[8]发现刺激肝脏胆汁酸合成可降低血中LDL-C浓度。Reihner[9]报道服用消胆胺后，肝细胞LDLR活性增加，同时胆汁酸合成相应增强。因此，进食高胆固醇食后，由于肝细胞受体活性下降，经此途径摄取胆固醇供以合成胆汁酸相应减少，使胆汁中胆固醇呈过饱和，易于结晶成石。■
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基金项目：卫生部青年科研基金(942170)和纽约中华医学基金资助项目(Y-9411)
作者简介：赵纪春(1964-)，男，山东五莲人，华西医科大学附属第一医院讲师，博士，从事胆石成因方面研究。
参考文献：
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[3]Kern FJ. Effects of dietary cholesterol in cholesterol and bile acid homeostasis in patients with cholesterol gallstones[J]. J Clin Invest, 1994,93(3):1186～1194.
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[4]Nervi FI, Marinouie I, Rogott A, et al. Regulation of biliary cholesterol secretion: functional relationship between the canalicular and sinusoidal cholesterol secretory pathways in the rat[J]. J Clin Invest, 1988,82(6):1818～1826.
[5]Bowden DA. Down-regulation of the low density lipoprotein receptor by dietary cholesterol[J]. Am J Clin Nutr, 1984,39(3):360～372.
[6]Spady DK, Meddings SM, Dietschy JM. Kinetic constants for receptor-dependent and receptor-independent low density lipoprotein transport in the tissues of the rat and hamster[J]. J Clin Invest, 1986,77(5):1471～1481.
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[7]Nicolosi RJ, Stucchi AF, Kowala MC, et al. Effect of dietary fat saturation and cholesterol on LDL composition and metabolism[J]. Arterioselerosis, 1990,10(1):119～128.
[8]Everson GT, Daggy BP, Mckinley GT, et al. Dietary fiber(psillium) lowers LDL cholesterol by stimulating bile acid synthesis in man[J]. Hepatology, 1991,14(suppl):148a.
[9]Reihner E, Angelin B, Rudling M, et al. Regulation of hepatic cholesterol metabolism in human: stimulatory effects of cholestyramine on HMG-COA reductase activity and low density lipoprotein receptor expression in gallstone patients[J]. J Lipid Res, 1990,31(12):2219～2226.
收稿日期：1998-10-26
修稿日期：2000-02-14, 百拇医药