胆汁中氨肽酶N的分离、提纯及其促成核作用的初步研究
作者：陈祥柏 祝学光 张红军 邵黎 王新惠 赵华
单位：陈祥柏(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；祝学光(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；张红军(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；王新惠(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；赵华(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；邵黎(北京医科大学 生理教研室，北京 100083)
关键词：氨肽酶/分离和提纯；胆汁/化学；胆结石/病因学；胆结石/化学
中国普通外科杂志000208 摘 要：目的 观察氨肽酶N(APN)在胆石形成中的成核活性。方法 应用伴刀豆凝集素A亲和层析、羟基磷灰石柱层析及高压液相法从胆石症患者胆汁中分离、提纯胆汁中的APN，并用模拟胆汁观察APN的成核活性。结果 最终APN纯化倍数达294倍，酶的活性为12.9nM.min-1.μg-1，分子量为130kDa。随后在模拟胆汁观察到APN有明显的促成核活性。结论 APN在胆固醇结石形成中具有促成核作用。
, http://www.100md.com
分类号：R575.62；Q592.9 文献标识码：A
文章编号：1005-6947(2000)02-0117-03
Isolation and purification of aminopeptidase N and promotion of
nucleating activity in bile
CHEN Xiang-bai, ZHU Xue-guang, ZHANG Hong-jun, WANG Xin-hui, ZHAO Hua
(Department of General Surgery, Affiliated People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China)
, 百拇医药
SHAO Li
(Department of Physiology, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
Abstract：Objective To observe the nucleation effect of aminopeptiase N(APN) in gallstone formation. Methods Purification procedures including conA affinity chromatography, hydroxyapatite column chromatography and HPLC were adopted to isolate and purify APN from bile of the patients with gallstones. Artificial bile was used to demonstrate the nucleation effect of APN. Results The concentration of APN was found 294 times higher after the purification with specific activity 12.9mM.min.μg-1 and molecular weight 130 kDa. The following observation of artificial bile displayed the pronucleating action of APN, showing that the nucleation time(NT) of APN is shorter than that of control artificial bile(NT=6.7 days, P<0.01). Conclusions APN is a natural pronucleating factor in bile and might play a critical role in the formation of human cholesterol gallstones.
, http://www.100md.com
Key words：AMINOPEPTIDASE/isol；BILE/chem；CHOLELITHIASIS/etiol；CHOLELITHIASIS/chem▲
胆汁成核理论的提出及成核时间概念的应用是胆石形成机制研究中的重要进展。胆固醇结石的形成可能是胆汁中促、抗成核因子平衡破坏的结果。研究发现，胆汁中的一些糖蛋白类物质可能具有促成核作用。我们应用伴刀豆凝集素A(ConA)亲和层析、羟基磷灰石柱层析、高压液相离子交换(Mono-Q)柱层析方法分离、提纯胆汁中的氨肽酶N(APN)，并观察它对胆汁成核作用的影响，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
L-亮氨酸-4-氨基-甲基香豆素、胆固醇、卵磷脂、牛碘胆酸钠、标准蛋白BSA、考马斯亮兰G250及R250、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇均购自Sigma公司；Mono-Q柱，Sepharose G-200，ConA-Sepharose 4B来自Pharmacia公司；其余试剂均为国产分析纯级。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 胆固醇结石胆囊胆汁的收集 对择期行胆囊切除术的胆结石病例，按Strasberg法[1]抽取术中胆囊胆汁并用快速定性法对结石进行 分类后，挑选胆固醇结石病人的胆汁，经10，000rpm 高速离心30min后，取上清液，加1mM苯*****(PMSF)，0.02%叠氮钠(NaN3)保存于-20℃备用。共收集20例。
1.2.2 ConA-Sepharose 4B亲和层析柱 取5ml ConA-Sepharose置于层析柱内(1cm×10cm)，用含0.2M NaCl,1mM CaCl2,1mM MgCl2,1mM MnCl2的 50mM Tris-Cl缓冲液(pH7.4)平衡，取5ml 胆汁用上述缓冲液稀释10倍过柱，充分吸附后再用上述缓冲液洗去不结合组分。之后用含0.1M α-D-甲基甘露糖、0.2M NaCl2的50mM Tris-Cl(pH7.4)洗脱液洗脱，用紫外监测仪监测下收集结合组分。 在4℃、10mM Tris-Cl(pH7.4) 充分透析48h，PEG8000浓缩，测其蛋白浓度及APN活性。多次重复过柱。
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1.2.3 羟基磷灰石柱 用0.5M磷酸盐缓冲液(pH6.8)浸泡羟基磷灰石1h后，上柱(1.5cm×10cm)，用1mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡。上样后用10倍柱床体积的1mM磷酸盐缓冲液洗去不结合组分，再用从1mM～100mM磷酸盐缓冲液100ml行梯度洗脱，每1ml收集1管，紫外监测，并测其蛋白浓度及APN活性。收集具有活性组分，充分透析，PEG8000浓缩，测其蛋白浓度及活性。
1.2.4 Mono-Q柱 用10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡该柱，上样后用0.01M～0.3M NaCl等梯度洗脱，流速1ml/min,40min洗脱程序结束。1ml收集1管，测其活性，收集具有活性的部分，透析浓缩，测其蛋白浓度及活性。
1.2.5 APN活性的测定 参照Blackmon法[2]。在37℃，pH7.4,50mM,Tris-Cl缓冲液中，以7-氨基-甲基甘露糖为底物，用荧光 分光光度计在激发光为380nm，发射光为450nm 条件下测定其活性。
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1.2.6 蛋白质纯度的鉴定
1.2.6.1 SDS-PAGE参照Laemmli法[3] 以高分子量蛋白质标准与泳动距离做标准曲线，并计算其分子量。
1.2.6.2 Sepharose G-200柱 浸泡Sepharose G-200，72h后装柱，用50mM Tris-Cl(pH7.0)流洗，上样后紫外监测仪监测，同时连同步记录仪，波长为280nm，描记蛋白吸收曲线。以高分子量蛋白质标准与洗脱体积做标准曲线，并计算其分子量。
1.2.7 成核时间 人工模拟胆汁的制备参考Kibe的方法[4]改良制作。胆固醇、磷脂、胆酸的浓度分别为17，47，107mM，胆盐/磷脂的比=2.3/1，CSI为1.2。把配制好的模拟胆汁分成各含6个等份的2组，1组为实验组加入含APN的10mM Tris-Cl(APN终浓度为50μg/ml)，另1组加入等量的不含APN的10mM Tris-Cl作为对照组。用Holan法[5]观察成核时间，并按照Groen[6]方法计算其成核活性。成核活性=APN成核活性(NTs)/对照组成核活性(NTc)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 APN纯化结果
APN纯化结果见表1。
表1 APN纯化结果 方法
总活性(mM)
总蛋白(μg)
比活(nM.min-1.μg-1)
回收率(%)
纯化倍数
胆汁
, 百拇医药
458.8
370000
1.24
100
1
ConA亲和层析
237
20555
11.53
51.4
9.3
羟基磷灰石柱
164.1
, 百拇医药
3162
51.90
35.6
41.6
Mono-Q柱
132.5
362
366.13
28.7
293.7
2.2 分子量测定
SDS-PAGE后，用考马斯亮兰R250染色，出现单一条带，根据蛋白质分子量标准计算得出该蛋白质分子量为130kDa。
, 百拇医药
2.3 Sepharose G-200柱
根据标准蛋白质分子量与洗脱体积的标准曲线，由该蛋白的洗脱体积得出APN的分子量为130kDa，并且出现对称单峰波形。
2.4 成核活性的测定
通过模拟胆汁，测得APN的成核时间(NTs)平均为 3.8d，而对照组的成核时间(NTc)为6.7d (表2)，两组间差异显著(P<0.01)。计算APN成核活性为0.5742，表明本实验所提纯的APN具有明显的促成核效应，为一促成核因子。表2 APN成核时间(d) 组别
APN(d)
对照组(d)
1
3
, http://www.100md.com
7
2
4
6
3
3
8
4
5
7
5
5
6
6
, 百拇医药
3
6
±s
3.83±0.98
6.67±0.82
注： P<0.01与对照组
3 讨 论
本实验先后应用ConA亲和层析、羟基磷灰石柱层析、高压液相离子交换柱层析等方法从胆固醇结石病人的胆囊胆汁中分离、提纯APN，提纯倍数分别是9.3，41.6，293.7倍。ConA亲和层析克服了胆汁中脂类、粘蛋白和胆色素等复杂成份的干扰，在温和条件下进行，不破坏APN的活性，获得率较高。羟基磷灰石柱对酶的分离呈现很好的效果，本实验中经羟基磷灰石柱后APN活性保持比较好。高压液相离子交换因为其快速、高效、重复性好，目前广泛应用于酶类的提纯。APN经过这一步提纯后，依旧具有良好的活性，使下面成核时间的观察更接近天然APN。且经SDS-PAGE鉴定为单一条带。整个提纯过程都是在低温下进行，可确保APN的生物活性。APN的酶活性达12.9nM.min-1.μg-1蛋白质。
, 百拇医药
经成核时间观察及成核活性测定表明，APN的成核时间显著较对照组为短。成核活性为0.5742，根据Groen关于成核活性<1者为促成核因子的解释，APN为一有较强促成核活性的物质。
APN是细胞表面表达的一种糖蛋白。APN曾用名有氨肽酶M、亮氨酸氨肽酶、抗原CD13，广泛存在于人体各个组织，尤以肝脏、肾脏、小肠含量较高。APN酶催化多肽氨基端氨基酸，尤其是中性氨基酸的水解。APN在pH7.6时具有最大的活性，在pH6.0～10.5时稳定。在pH3.5以下及pH11以上发生快速变性。
胆汁中的APN主要来源于胆小管上皮细胞膜表面[7]。目前认为可能是因为胆汁中的胆汁酸与APN的疏水区相互作用而把APN带入胆汁中。不难设想当饱和指数较高的胆汁积存在胆汁淤滞、排空不良的胆囊内，再遇到较高浓度具有促成核活性的APN，则在胆囊胆汁中成核和成石几乎是难以避免的后果。因此，胆汁中APN升高及相应抗成核因子的不足可能是胆固醇结石的发生的重要因素。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39770719)
作者简介：陈祥柏(1968-)，男，湖南茶陵人，北京医科大学附属人民医院主治医师，博士，从事胆结石成因方面研究。
参考文献：
[1]Groen AK. Nonmucous glycoproteins as pronucleating agents[J]. Hepatology, 1990,12(3):189S～194S.
[2]Blackmon DL, Watson AJM, Montrose MH. Assay of apical me-
mbrane enzymes based on fluorogenic substrates[J]. Analytic Biochemistry, 1992,200(2):352～358.
, 百拇医药
[3]Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970,227(259):680～685.
[4]Kibe A, Dudley MA, Halpern Z. Factors affecting cholesterol monohydrate crystal nucleation time in model systems of supersaturated bile[J]. J Lipid Research, 1985,26(9):1102～1111.
[5]Holan KR, Holzbach T, Hermann RE, et al. Nucleation time: A key factor in the pathogenesis of choleserol gallstone disease[J]. Gastroenterology, 1979,77(4):611～617.
, 百拇医药
[6]Groen AK, Drapers JAG, Heok FJ, et al. Cholesterol nucleation-influencing activity in T-tube bile[J]. Hepatology, 1988,8(2):347～352.
[7]Offner GD, Gong D, Afdhal NH. Identification of a 130-kilodalton human billary concanavalin a binding protein as aminopeptidase N[J]. Gastroenterology, 1994,106(3):755～762.
收稿日期：1999-01-18
修稿日期：2000-01-24, 百拇医药
单位：陈祥柏(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；祝学光(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；张红军(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；王新惠(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；赵华(北京医科大学附属人民医院 普外科，北京 100044)；邵黎(北京医科大学 生理教研室，北京 100083)
关键词：氨肽酶/分离和提纯；胆汁/化学；胆结石/病因学；胆结石/化学
中国普通外科杂志000208 摘 要：目的 观察氨肽酶N(APN)在胆石形成中的成核活性。方法 应用伴刀豆凝集素A亲和层析、羟基磷灰石柱层析及高压液相法从胆石症患者胆汁中分离、提纯胆汁中的APN，并用模拟胆汁观察APN的成核活性。结果 最终APN纯化倍数达294倍，酶的活性为12.9nM.min-1.μg-1，分子量为130kDa。随后在模拟胆汁观察到APN有明显的促成核活性。结论 APN在胆固醇结石形成中具有促成核作用。
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分类号：R575.62；Q592.9 文献标识码：A
文章编号：1005-6947(2000)02-0117-03
Isolation and purification of aminopeptidase N and promotion of
nucleating activity in bile
CHEN Xiang-bai, ZHU Xue-guang, ZHANG Hong-jun, WANG Xin-hui, ZHAO Hua
(Department of General Surgery, Affiliated People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China)
, 百拇医药
SHAO Li
(Department of Physiology, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
Abstract：Objective To observe the nucleation effect of aminopeptiase N(APN) in gallstone formation. Methods Purification procedures including conA affinity chromatography, hydroxyapatite column chromatography and HPLC were adopted to isolate and purify APN from bile of the patients with gallstones. Artificial bile was used to demonstrate the nucleation effect of APN. Results The concentration of APN was found 294 times higher after the purification with specific activity 12.9mM.min.μg-1 and molecular weight 130 kDa. The following observation of artificial bile displayed the pronucleating action of APN, showing that the nucleation time(NT) of APN is shorter than that of control artificial bile(NT=6.7 days, P<0.01). Conclusions APN is a natural pronucleating factor in bile and might play a critical role in the formation of human cholesterol gallstones.
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Key words：AMINOPEPTIDASE/isol；BILE/chem；CHOLELITHIASIS/etiol；CHOLELITHIASIS/chem▲
胆汁成核理论的提出及成核时间概念的应用是胆石形成机制研究中的重要进展。胆固醇结石的形成可能是胆汁中促、抗成核因子平衡破坏的结果。研究发现，胆汁中的一些糖蛋白类物质可能具有促成核作用。我们应用伴刀豆凝集素A(ConA)亲和层析、羟基磷灰石柱层析、高压液相离子交换(Mono-Q)柱层析方法分离、提纯胆汁中的氨肽酶N(APN)，并观察它对胆汁成核作用的影响，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
L-亮氨酸-4-氨基-甲基香豆素、胆固醇、卵磷脂、牛碘胆酸钠、标准蛋白BSA、考马斯亮兰G250及R250、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇均购自Sigma公司；Mono-Q柱，Sepharose G-200，ConA-Sepharose 4B来自Pharmacia公司；其余试剂均为国产分析纯级。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 胆固醇结石胆囊胆汁的收集 对择期行胆囊切除术的胆结石病例，按Strasberg法[1]抽取术中胆囊胆汁并用快速定性法对结石进行 分类后，挑选胆固醇结石病人的胆汁，经10，000rpm 高速离心30min后，取上清液，加1mM苯*****(PMSF)，0.02%叠氮钠(NaN3)保存于-20℃备用。共收集20例。
1.2.2 ConA-Sepharose 4B亲和层析柱 取5ml ConA-Sepharose置于层析柱内(1cm×10cm)，用含0.2M NaCl,1mM CaCl2,1mM MgCl2,1mM MnCl2的 50mM Tris-Cl缓冲液(pH7.4)平衡，取5ml 胆汁用上述缓冲液稀释10倍过柱，充分吸附后再用上述缓冲液洗去不结合组分。之后用含0.1M α-D-甲基甘露糖、0.2M NaCl2的50mM Tris-Cl(pH7.4)洗脱液洗脱，用紫外监测仪监测下收集结合组分。 在4℃、10mM Tris-Cl(pH7.4) 充分透析48h，PEG8000浓缩，测其蛋白浓度及APN活性。多次重复过柱。
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1.2.3 羟基磷灰石柱 用0.5M磷酸盐缓冲液(pH6.8)浸泡羟基磷灰石1h后，上柱(1.5cm×10cm)，用1mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡。上样后用10倍柱床体积的1mM磷酸盐缓冲液洗去不结合组分，再用从1mM～100mM磷酸盐缓冲液100ml行梯度洗脱，每1ml收集1管，紫外监测，并测其蛋白浓度及APN活性。收集具有活性组分，充分透析，PEG8000浓缩，测其蛋白浓度及活性。
1.2.4 Mono-Q柱 用10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡该柱，上样后用0.01M～0.3M NaCl等梯度洗脱，流速1ml/min,40min洗脱程序结束。1ml收集1管，测其活性，收集具有活性的部分，透析浓缩，测其蛋白浓度及活性。
1.2.5 APN活性的测定 参照Blackmon法[2]。在37℃，pH7.4,50mM,Tris-Cl缓冲液中，以7-氨基-甲基甘露糖为底物，用荧光 分光光度计在激发光为380nm，发射光为450nm 条件下测定其活性。
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1.2.6 蛋白质纯度的鉴定
1.2.6.1 SDS-PAGE参照Laemmli法[3] 以高分子量蛋白质标准与泳动距离做标准曲线，并计算其分子量。
1.2.6.2 Sepharose G-200柱 浸泡Sepharose G-200，72h后装柱，用50mM Tris-Cl(pH7.0)流洗，上样后紫外监测仪监测，同时连同步记录仪，波长为280nm，描记蛋白吸收曲线。以高分子量蛋白质标准与洗脱体积做标准曲线，并计算其分子量。
1.2.7 成核时间 人工模拟胆汁的制备参考Kibe的方法[4]改良制作。胆固醇、磷脂、胆酸的浓度分别为17，47，107mM，胆盐/磷脂的比=2.3/1，CSI为1.2。把配制好的模拟胆汁分成各含6个等份的2组，1组为实验组加入含APN的10mM Tris-Cl(APN终浓度为50μg/ml)，另1组加入等量的不含APN的10mM Tris-Cl作为对照组。用Holan法[5]观察成核时间，并按照Groen[6]方法计算其成核活性。成核活性=APN成核活性(NTs)/对照组成核活性(NTc)。
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2 结 果
2.1 APN纯化结果
APN纯化结果见表1。
表1 APN纯化结果 方法
总活性(mM)
总蛋白(μg)
比活(nM.min-1.μg-1)
回收率(%)
纯化倍数
胆汁
, 百拇医药
458.8
370000
1.24
100
1
ConA亲和层析
237
20555
11.53
51.4
9.3
羟基磷灰石柱
164.1
, 百拇医药
3162
51.90
35.6
41.6
Mono-Q柱
132.5
362
366.13
28.7
293.7
2.2 分子量测定
SDS-PAGE后，用考马斯亮兰R250染色，出现单一条带，根据蛋白质分子量标准计算得出该蛋白质分子量为130kDa。
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2.3 Sepharose G-200柱
根据标准蛋白质分子量与洗脱体积的标准曲线，由该蛋白的洗脱体积得出APN的分子量为130kDa，并且出现对称单峰波形。
2.4 成核活性的测定
通过模拟胆汁，测得APN的成核时间(NTs)平均为 3.8d，而对照组的成核时间(NTc)为6.7d (表2)，两组间差异显著(P<0.01)。计算APN成核活性为0.5742，表明本实验所提纯的APN具有明显的促成核效应，为一促成核因子。表2 APN成核时间(d) 组别
APN(d)
对照组(d)
1
3
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7
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7
5
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±s3.83±0.98
6.67±0.82
注： P<0.01与对照组
3 讨 论
本实验先后应用ConA亲和层析、羟基磷灰石柱层析、高压液相离子交换柱层析等方法从胆固醇结石病人的胆囊胆汁中分离、提纯APN，提纯倍数分别是9.3，41.6，293.7倍。ConA亲和层析克服了胆汁中脂类、粘蛋白和胆色素等复杂成份的干扰，在温和条件下进行，不破坏APN的活性，获得率较高。羟基磷灰石柱对酶的分离呈现很好的效果，本实验中经羟基磷灰石柱后APN活性保持比较好。高压液相离子交换因为其快速、高效、重复性好，目前广泛应用于酶类的提纯。APN经过这一步提纯后，依旧具有良好的活性，使下面成核时间的观察更接近天然APN。且经SDS-PAGE鉴定为单一条带。整个提纯过程都是在低温下进行，可确保APN的生物活性。APN的酶活性达12.9nM.min-1.μg-1蛋白质。
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经成核时间观察及成核活性测定表明，APN的成核时间显著较对照组为短。成核活性为0.5742，根据Groen关于成核活性<1者为促成核因子的解释，APN为一有较强促成核活性的物质。
APN是细胞表面表达的一种糖蛋白。APN曾用名有氨肽酶M、亮氨酸氨肽酶、抗原CD13，广泛存在于人体各个组织，尤以肝脏、肾脏、小肠含量较高。APN酶催化多肽氨基端氨基酸，尤其是中性氨基酸的水解。APN在pH7.6时具有最大的活性，在pH6.0～10.5时稳定。在pH3.5以下及pH11以上发生快速变性。
胆汁中的APN主要来源于胆小管上皮细胞膜表面[7]。目前认为可能是因为胆汁中的胆汁酸与APN的疏水区相互作用而把APN带入胆汁中。不难设想当饱和指数较高的胆汁积存在胆汁淤滞、排空不良的胆囊内，再遇到较高浓度具有促成核活性的APN，则在胆囊胆汁中成核和成石几乎是难以避免的后果。因此，胆汁中APN升高及相应抗成核因子的不足可能是胆固醇结石的发生的重要因素。■
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基金项目：国家自然科学基金资助课题(39770719)
作者简介：陈祥柏(1968-)，男，湖南茶陵人，北京医科大学附属人民医院主治医师，博士，从事胆结石成因方面研究。
参考文献：
[1]Groen AK. Nonmucous glycoproteins as pronucleating agents[J]. Hepatology, 1990,12(3):189S～194S.
[2]Blackmon DL, Watson AJM, Montrose MH. Assay of apical me-
mbrane enzymes based on fluorogenic substrates[J]. Analytic Biochemistry, 1992,200(2):352～358.
, 百拇医药
[3]Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970,227(259):680～685.
[4]Kibe A, Dudley MA, Halpern Z. Factors affecting cholesterol monohydrate crystal nucleation time in model systems of supersaturated bile[J]. J Lipid Research, 1985,26(9):1102～1111.
[5]Holan KR, Holzbach T, Hermann RE, et al. Nucleation time: A key factor in the pathogenesis of choleserol gallstone disease[J]. Gastroenterology, 1979,77(4):611～617.
, 百拇医药
[6]Groen AK, Drapers JAG, Heok FJ, et al. Cholesterol nucleation-influencing activity in T-tube bile[J]. Hepatology, 1988,8(2):347～352.
[7]Offner GD, Gong D, Afdhal NH. Identification of a 130-kilodalton human billary concanavalin a binding protein as aminopeptidase N[J]. Gastroenterology, 1994,106(3):755～762.
收稿日期：1999-01-18
修稿日期：2000-01-24, 百拇医药