CCl4诱导肝损伤对大鼠细胞免疫功能的影响
作者：王丙云 陈龙 毛鑫智 J.Gonzalez-Gallego
单位：王丙云 (广东省佛山科技学院动物医学系 广东省南海市 528231)； 陈 龙 (南京师范大学生命科学学院 江苏省南京市 210097)； 毛鑫智 (南京农业大学动物医学院 江苏省南京市 210095)； J.Gonzalez-Gallego (西班牙莱昂大学生理学系 莱昂 24071)
关键词：四氯化碳；肝/病理学；免疫，细胞
世界华人消化杂志991236 中国图书馆分类号 R735
Subject headings Carbon tetrachloride; liver/pathology; immunity，cellular
现初步知道肝脏是重要的免疫器官.它是胸腺以外的T淋巴细胞分化的重要场所，同时可通过分泌一些化学物质如IGF-1(胰岛素样生长因子)参与免疫调节，因而肝脏与免疫的关系非常密切[1-3].许多肝病时的肝脏通过释放一些化学物质如极低密度脂蛋白(VLDL)、肝性免疫调节蛋白(LIP)、甲胎蛋白等参与机体免疫功能的调节，免疫细胞及其递质也可参与肝病的发生与发展[4-7].由于引起机体免疫功能变化的肝病大多数由生物性致病因子如病毒、细菌、寄生虫等侵害造成的.这些生物性因子既能通过损伤肝脏间接影响机体免疫功能，又能作为抗原直接影响机体免疫功能，因而难以说明肝损伤与机体免疫功能之间的关系.本文用CCl4诱导肝损伤的模型来研究肝损伤对机体免疫功能(主要是细胞免疫功能)的影响，可更好地说明肝损伤与机体免疫功能之间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 由南京医科大学动物实验部提供30只健康1月龄、平均体重83.20g±2.11g，雌雄各15只SD品系大鼠.随机分成对照组和注射CCl4组，每组15只，饲喂购自江浦动物饲料厂的大鼠全价饲料，自由饮水.注射CCl4诱导肝损伤：将分析纯CCl4(苏州振兴化工厂提供，批号970526)用橄榄油稀释成50%浓度的注射溶液.CCl4组大鼠按0.2mL/100g体重腹腔注射CCl4注射液，2次/wk，连续8wk，共16次.对照组用同样方法同时注射等量橄榄油.血样与器官采集和处理：分别在CCl4注射后wk2,4,6,8，对每组大鼠称重，并从眶下静脉丛采血样2mL，迅速放入含有肝素钠(1∶500)的带盖塑料管内，即刻混匀，然后4℃离心(3000r/min,20min)，分离出血浆置-20℃保存用于指标的测定.在注射后wk4和wk8，分两次宰杀大鼠，取肝脏、胸腺、脾脏，用纸吸干称重后，置-20℃保存.
, 百拇医药
1.2 测定指标与方法 ①肝脏指数、胸腺指数和脾脏指数：器官指数=器官重量/体重.②白细胞免疫指标：白细胞总数(WBC)——常规试管法；白细胞分类计数(DC)——Wright-Giemsa染色法[8]；T，B淋巴细胞比例——酸性非特异性酯酶(acid-α-naphthyl-acetate esterase，ANAE)组织化学染色法[9].③血清中白介素2的测定：放射免疫分析法，试剂盒由中国科学院上海原子核研究所提供.
统计学处理 以平均值和标准误表示，用SAS软件对数据作方差分析和Student＇s t检验，确定差异显著性.
2 结果
2.1 CCl4诱发肝损伤对大鼠的一些器官指数的影响 注射CCl4后wk4和wk8的大鼠肝脏指数分别为6.15±0.60(×10-2)和6.10±0.29，高于或显著高于对照组的5.19±0.60和4.58±0.17；CCl4组大鼠的脾脏指数分别为4.02±0.57(×10-3)和6.36±0.64也明显高于对照组的3.24±0.25和2.97±0.14；但CCl4组大鼠的胸腺指数分别为3.82±0.50(×10-3)和2.85±0.31低于或显著低于对照组的3.24±0.25和2.97±0.14.
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2.2 CCl4诱导肝损伤对大鼠血液白细胞数和分类计数的影响 大鼠注射CCl4后，白细胞总数上升.白细胞分类中淋巴细胞比例显著下降，而嗜酸性和中性粒细胞升高(表1).
表1 注射CCl4时大鼠血液白细胞总数和分类计数的变化 (
±s) 检查
组别
注射CCl4后周数
2(n=15)
4(n=15)
, 百拇医药
6(n=8)
8(n=8)
WBC(×109/L)
对照
14.59±0.88a
12.03±0.95
14.01±1.48a
14.39±0.92b
CCl4
11.41±1.07
10.20±0.68
, http://www.100md.com
9.23±0.52
9.19±1.25
DC(%)
N
对照
24.00±1.64d
25.45±3.08d
24.33±5.72c
22.14±3.40
CCl4
16.91±1.67
, 百拇医药
13.79±1.80
10.00±1.38
15.14±1.18
L
对照
71.00±1.69
64.68±2.43
62.83±4.09
63.14±5.72c
CCl4
79.38±2.07
, http://www.100md.com
81.54±2.42
85.29±2.39
79.86±0.91
E
对照
4.01±0.58
9.85±1.64d
11.42±4.16
13.00±4.54
CCl4
2.59±0.51
, http://www.100md.com 3.95±0.56
3.14±0.88
5.80±1.83
M
对照
1.64±0.37
0.63±0.30
0.42±0.20
1.00±0.45
CCl4
2.00±0.76
0.59±0.29
, 百拇医药
0.25±0.16
0.38±0.18
B
对照
0.50±0.25
0.18±0.10
0.67±0.21
0.83±0.47
CCl4
0.53±0.15
0.10±0.07
0.13±0.13
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0.50±0.27
N:中性粒细胞，L:淋巴细胞，E:嗜酸性细胞，M:单核细胞，B:嗜碱性细胞
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，dP<0.01，vs 对照组值.
2.3 CCl4诱导肝损伤对大鼠血液T，B淋巴细胞比例的影响(表2).
表2 CCl4诱导肝损伤时大鼠血液T，B淋巴细胞比例(%)变化 (±s) Week
, 百拇医药
T-lymphocyte
B-lymphocyte
CCl4
对照组
CCl4
对照组
2
31.92±1.77
61.93±11.90
68.19±1.65
37.57±2.65
4
, 百拇医药
30.37±2.34
62.27±1.73
70.18±2.22
36.72±1.73
6
31.33±2.54
60.00±3.75
65.33±1.76d
40.00±3.75
8
29.50±4.02b
, 百拇医药
57.57±4.78
72.50±2.47d
42.43±4.78
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，dP<0.01，vs对照组值.
表2显示，大鼠注射CCl4后血液T淋巴细胞比例极显著下降，而B淋巴细胞却明显上升.
2.4 CCl4诱导肝损伤对大鼠血浆白介素2(IL-2)水平的影响 大鼠注射CCl4后wk2，4，6和8的IL-2水平分别为3.58±0.43，3.13±0.32，2.77±0.18和2.65±0.17，极显著低于对照组的6.53±0.15，5.81±0.38，6.43±0.17和6.01±0.18.
, 百拇医药
3 讨论
本实验给大鼠多次反复注射亚致死量的CCl4，造成属于弥漫性肝纤维化的肝脏损伤模型.大鼠注射CCl4后，腹部明显肿胀、变硬.剖开腹腔可见，腹腔积有多量淡黄色液体，肝脏颜色变淡，呈花斑状，肿胀，质地坚硬，对照组无异常变化.肝脏和脾脏指数均高于对照组，而胸腺指数明显低于对照组.结果提示，CCl4诱导的肝损伤，引起肝脏和脾脏肿胀、增生，影响肝脏内分泌功能，减少胰岛样生长因子(IGF-1)，从而影响动物生长和抑制胸腺发育[10].注射CCl4的大鼠血液的白细胞总数明显增加，白细胞分类中的中性粒细胞和嗜酸性细胞增加而淋巴细胞比例却显著下降，这可能同CCl4导致的肝脏炎症反应有关.外周血T和B淋巴细胞比例和白介素2水平测定的结果表明，CCl4组大鼠的外周血T淋巴细胞比例和白介素2显著低于对照组，说明CCl4诱发的肝损伤能明显抑制机体的细胞免疫功能.Paronetto的实验表明[11]：原发性肝硬变(PBC)患者的外周血T淋巴细胞百分率下降，病理早期CD4细胞减少，CD4/CD8比值降低，病理后期CD8细胞减少，CD4/CD8比值升高，淋巴细胞对PHA刺激的反应减弱，TS细胞功能下降.其他类型的肝硬变患者T细胞比例也明显下降.本实验与其结果基本一致 .肝在损伤时可释放大量的甲胎蛋白，而甲胎蛋白可抑制T淋巴细胞介导的免疫反应[12].
, 百拇医药
欧盟资助国际合作项目IC18-CT95-0001 (DG-VLSA)
通讯作者 王丙云
参考文献
1 黎光.肝脏内非胸腺来源的T淋巴细胞及其免疫学、生物学功能.国外医学免疫学分册，1998；21：41
2 Hai T，Watanabe Sedl HS.Ontogeny and development of extrathymic T cell in mouse liver.Immunology，1992;77:556
3 王丙云，毛鑫智.肝脏的免疫功能.国外医学免疫学分册，1999；22：158
4 许剑平摘译.急慢性肝病时T细胞的功能.国外医学消化系疾病分册，1981；2：114
, http://www.100md.com
5 杨尚琪，蔡访勤.肝脏若干免疫调节功能.临床肝胆病杂志，1993；9：62
6 陈贤明，韩德五，许瑞令，尹镭，赵元昌，梁振昌.内毒素对实验性肝功能不全的作用.中国病理生理杂志，1989；5：164
7 Nolan JP.Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-an idea whose time has come again.Hepatoloy，1989;10:887
8 上海医学化验所主编.临床生化检验.上海：上海科学技术出版社，1982：168
9 王承浩，唐玉新，王亚鸣.T淋巴细胞的酸性非特异性酯酶标记及其定位.江西农业大学学报，1984；1：1
10 Clark R.The somatogenic hormone and insulin-like growth factor; stimulator of lymphopoiesis and immune function.Endocrine Rev，1997;18:157
11 Paronetto F.Cell immune in liver disease.Hum Pathol，1986;1792:168
12 陈士葆摘译.肝硬化患者T细胞功能损伤和自然杀伤性别活性减少及其在发生肝细胞癌症中的意义.国外医学消化系疾病分册，1981；2：114
收稿日期 1999-07-15 修回日期 1999-11-08, http://www.100md.com
单位：王丙云 (广东省佛山科技学院动物医学系 广东省南海市 528231)； 陈 龙 (南京师范大学生命科学学院 江苏省南京市 210097)； 毛鑫智 (南京农业大学动物医学院 江苏省南京市 210095)； J.Gonzalez-Gallego (西班牙莱昂大学生理学系 莱昂 24071)
关键词：四氯化碳；肝/病理学；免疫，细胞
世界华人消化杂志991236 中国图书馆分类号 R735
Subject headings Carbon tetrachloride; liver/pathology; immunity，cellular
现初步知道肝脏是重要的免疫器官.它是胸腺以外的T淋巴细胞分化的重要场所，同时可通过分泌一些化学物质如IGF-1(胰岛素样生长因子)参与免疫调节，因而肝脏与免疫的关系非常密切[1-3].许多肝病时的肝脏通过释放一些化学物质如极低密度脂蛋白(VLDL)、肝性免疫调节蛋白(LIP)、甲胎蛋白等参与机体免疫功能的调节，免疫细胞及其递质也可参与肝病的发生与发展[4-7].由于引起机体免疫功能变化的肝病大多数由生物性致病因子如病毒、细菌、寄生虫等侵害造成的.这些生物性因子既能通过损伤肝脏间接影响机体免疫功能，又能作为抗原直接影响机体免疫功能，因而难以说明肝损伤与机体免疫功能之间的关系.本文用CCl4诱导肝损伤的模型来研究肝损伤对机体免疫功能(主要是细胞免疫功能)的影响，可更好地说明肝损伤与机体免疫功能之间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 由南京医科大学动物实验部提供30只健康1月龄、平均体重83.20g±2.11g，雌雄各15只SD品系大鼠.随机分成对照组和注射CCl4组，每组15只，饲喂购自江浦动物饲料厂的大鼠全价饲料，自由饮水.注射CCl4诱导肝损伤：将分析纯CCl4(苏州振兴化工厂提供，批号970526)用橄榄油稀释成50%浓度的注射溶液.CCl4组大鼠按0.2mL/100g体重腹腔注射CCl4注射液，2次/wk，连续8wk，共16次.对照组用同样方法同时注射等量橄榄油.血样与器官采集和处理：分别在CCl4注射后wk2,4,6,8，对每组大鼠称重，并从眶下静脉丛采血样2mL，迅速放入含有肝素钠(1∶500)的带盖塑料管内，即刻混匀，然后4℃离心(3000r/min,20min)，分离出血浆置-20℃保存用于指标的测定.在注射后wk4和wk8，分两次宰杀大鼠，取肝脏、胸腺、脾脏，用纸吸干称重后，置-20℃保存.
, 百拇医药
1.2 测定指标与方法 ①肝脏指数、胸腺指数和脾脏指数：器官指数=器官重量/体重.②白细胞免疫指标：白细胞总数(WBC)——常规试管法；白细胞分类计数(DC)——Wright-Giemsa染色法[8]；T，B淋巴细胞比例——酸性非特异性酯酶(acid-α-naphthyl-acetate esterase，ANAE)组织化学染色法[9].③血清中白介素2的测定：放射免疫分析法，试剂盒由中国科学院上海原子核研究所提供.
统计学处理 以平均值和标准误表示，用SAS软件对数据作方差分析和Student＇s t检验，确定差异显著性.
2 结果
2.1 CCl4诱发肝损伤对大鼠的一些器官指数的影响 注射CCl4后wk4和wk8的大鼠肝脏指数分别为6.15±0.60(×10-2)和6.10±0.29，高于或显著高于对照组的5.19±0.60和4.58±0.17；CCl4组大鼠的脾脏指数分别为4.02±0.57(×10-3)和6.36±0.64也明显高于对照组的3.24±0.25和2.97±0.14；但CCl4组大鼠的胸腺指数分别为3.82±0.50(×10-3)和2.85±0.31低于或显著低于对照组的3.24±0.25和2.97±0.14.
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2.2 CCl4诱导肝损伤对大鼠血液白细胞数和分类计数的影响 大鼠注射CCl4后，白细胞总数上升.白细胞分类中淋巴细胞比例显著下降，而嗜酸性和中性粒细胞升高(表1).
表1 注射CCl4时大鼠血液白细胞总数和分类计数的变化 (
±s) 检查组别
注射CCl4后周数
2(n=15)
4(n=15)
, 百拇医药
6(n=8)
8(n=8)
WBC(×109/L)
对照
14.59±0.88a
12.03±0.95
14.01±1.48a
14.39±0.92b
CCl4
11.41±1.07
10.20±0.68
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9.23±0.52
9.19±1.25
DC(%)
N
对照
24.00±1.64d
25.45±3.08d
24.33±5.72c
22.14±3.40
CCl4
16.91±1.67
, 百拇医药
13.79±1.80
10.00±1.38
15.14±1.18
L
对照
71.00±1.69
64.68±2.43
62.83±4.09
63.14±5.72c
CCl4
79.38±2.07
, http://www.100md.com
81.54±2.42
85.29±2.39
79.86±0.91
E
对照
4.01±0.58
9.85±1.64d
11.42±4.16
13.00±4.54
CCl4
2.59±0.51
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3.14±0.88
5.80±1.83
M
对照
1.64±0.37
0.63±0.30
0.42±0.20
1.00±0.45
CCl4
2.00±0.76
0.59±0.29
, 百拇医药
0.25±0.16
0.38±0.18
B
对照
0.50±0.25
0.18±0.10
0.67±0.21
0.83±0.47
CCl4
0.53±0.15
0.10±0.07
0.13±0.13
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0.50±0.27
N:中性粒细胞，L:淋巴细胞，E:嗜酸性细胞，M:单核细胞，B:嗜碱性细胞
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，dP<0.01，vs 对照组值.
2.3 CCl4诱导肝损伤对大鼠血液T，B淋巴细胞比例的影响(表2).
表2 CCl4诱导肝损伤时大鼠血液T，B淋巴细胞比例(%)变化 (
±s) Week, 百拇医药
T-lymphocyte
B-lymphocyte
CCl4
对照组
CCl4
对照组
2
31.92±1.77
61.93±11.90
68.19±1.65
37.57±2.65
4
, 百拇医药
30.37±2.34
62.27±1.73
70.18±2.22
36.72±1.73
6
31.33±2.54
60.00±3.75
65.33±1.76d
40.00±3.75
8
29.50±4.02b
, 百拇医药
57.57±4.78
72.50±2.47d
42.43±4.78
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，dP<0.01，vs对照组值.
表2显示，大鼠注射CCl4后血液T淋巴细胞比例极显著下降，而B淋巴细胞却明显上升.
2.4 CCl4诱导肝损伤对大鼠血浆白介素2(IL-2)水平的影响 大鼠注射CCl4后wk2，4，6和8的IL-2水平分别为3.58±0.43，3.13±0.32，2.77±0.18和2.65±0.17，极显著低于对照组的6.53±0.15，5.81±0.38，6.43±0.17和6.01±0.18.
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3 讨论
本实验给大鼠多次反复注射亚致死量的CCl4，造成属于弥漫性肝纤维化的肝脏损伤模型.大鼠注射CCl4后，腹部明显肿胀、变硬.剖开腹腔可见，腹腔积有多量淡黄色液体，肝脏颜色变淡，呈花斑状，肿胀，质地坚硬，对照组无异常变化.肝脏和脾脏指数均高于对照组，而胸腺指数明显低于对照组.结果提示，CCl4诱导的肝损伤，引起肝脏和脾脏肿胀、增生，影响肝脏内分泌功能，减少胰岛样生长因子(IGF-1)，从而影响动物生长和抑制胸腺发育[10].注射CCl4的大鼠血液的白细胞总数明显增加，白细胞分类中的中性粒细胞和嗜酸性细胞增加而淋巴细胞比例却显著下降，这可能同CCl4导致的肝脏炎症反应有关.外周血T和B淋巴细胞比例和白介素2水平测定的结果表明，CCl4组大鼠的外周血T淋巴细胞比例和白介素2显著低于对照组，说明CCl4诱发的肝损伤能明显抑制机体的细胞免疫功能.Paronetto的实验表明[11]：原发性肝硬变(PBC)患者的外周血T淋巴细胞百分率下降，病理早期CD4细胞减少，CD4/CD8比值降低，病理后期CD8细胞减少，CD4/CD8比值升高，淋巴细胞对PHA刺激的反应减弱，TS细胞功能下降.其他类型的肝硬变患者T细胞比例也明显下降.本实验与其结果基本一致 .肝在损伤时可释放大量的甲胎蛋白，而甲胎蛋白可抑制T淋巴细胞介导的免疫反应[12].
, 百拇医药
欧盟资助国际合作项目IC18-CT95-0001 (DG-VLSA)
通讯作者 王丙云
参考文献
1 黎光.肝脏内非胸腺来源的T淋巴细胞及其免疫学、生物学功能.国外医学免疫学分册，1998；21：41
2 Hai T，Watanabe Sedl HS.Ontogeny and development of extrathymic T cell in mouse liver.Immunology，1992;77:556
3 王丙云，毛鑫智.肝脏的免疫功能.国外医学免疫学分册，1999；22：158
4 许剑平摘译.急慢性肝病时T细胞的功能.国外医学消化系疾病分册，1981；2：114
, http://www.100md.com
5 杨尚琪，蔡访勤.肝脏若干免疫调节功能.临床肝胆病杂志，1993；9：62
6 陈贤明，韩德五，许瑞令，尹镭，赵元昌，梁振昌.内毒素对实验性肝功能不全的作用.中国病理生理杂志，1989；5：164
7 Nolan JP.Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-an idea whose time has come again.Hepatoloy，1989;10:887
8 上海医学化验所主编.临床生化检验.上海：上海科学技术出版社，1982：168
9 王承浩，唐玉新，王亚鸣.T淋巴细胞的酸性非特异性酯酶标记及其定位.江西农业大学学报，1984；1：1
10 Clark R.The somatogenic hormone and insulin-like growth factor; stimulator of lymphopoiesis and immune function.Endocrine Rev，1997;18:157
11 Paronetto F.Cell immune in liver disease.Hum Pathol，1986;1792:168
12 陈士葆摘译.肝硬化患者T细胞功能损伤和自然杀伤性别活性减少及其在发生肝细胞癌症中的意义.国外医学消化系疾病分册，1981；2：114
收稿日期 1999-07-15 修回日期 1999-11-08, http://www.100md.com