胆固醇酯转移蛋白基因taqIB多态性与胆囊结石病关系的临床实验研究
作者：张明仪 舒晔 赵纪春 刘嘉林 程南生 李宁 肖路加
单位：张明仪 四川省肿瘤医院腹部外科(610041)； 舒晔 赵纪春 刘嘉林 程南生 李宁 肖路加 华西医科大学附属第一医院普外科
关键词：胆囊结石病；胆固醇酯转移蛋白；基因多态性异常脂血症
华西医学990173 摘要：目的：揭示胆囊结石病与遗传因素的关系。方法：运用多聚酶链反应技术(PCR)和基因限制性片段长度多态性分析法(RFLPs)对104例胆囊结石病人和68例健康人进行调查研究。结果：发现胆囊结石组B1等位基因，B1B1基因型，B2等位基因，B2B2基因型频率与对照组相应等位基因及基因型频率比较有差异(0.5230vs0.3460 0.2880vs0.1176 0.4770vs0.6540 0.2420vs0.4264 P<0.01)。B1B1基因型HDL-ch和HDL2-ch水平降低，与B2B2基因型的HDL-ch、HDL2-ch比较有差异(P<0.01)。结论：B1等位基因和B1B1基因型与低HDL-ch、HDL2-ch水平相关。B1等位基因是部分中国汉族人胆囊结石病人的遗传易感因素。
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〔中图分类号〕R575.6+2；R894
〔文献标识码〕B
Polymorphism at Cholesteryl Ester Transfer Protein Gene Loci in Patients with Gallstone
ZHANG Ming-yi1，SHU Ye2，ZHAO2 Ji-chun，et al.
流行病学调查发现胆囊结石病人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-ch)下降、甘油三酯(TG)上升等是胆囊结石形成的高危因素〔1，2〕，胆囊结石病人的家族聚集性表明胆囊结石病具遗传倾向〔3〕。有学者用小鼠作实验证实有致石基因(Lith genes)〔4〕。本实验调查与胆固醇逆转运密切相关的胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)基因多态性以及与血HDL-ch及HDL-ch亚型水平的关系，为揭示胆囊结石病发病中某些遗传易感因素。
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1 资料和方法
1.1 实验对象及分组 实验分胆囊结石组、对照组。胆囊结石组系在华西医科大学附一院住院择期行胆囊切除的汉族患者。包括腹腔镜手术、开腹手术者。术中皆证实为胆囊结石病。胆囊结石组共104例，男性39例，女性65例。平均年龄51.41±12.8岁。对照组为同期作健康体检的汉族志愿者。对照组纳入标准，无高血脂、无糖尿病、无肥胖、未怀孕、未服用避孕药。无肝、胆、甲状腺等病史。共68例，男性30例，女性38例。平均年龄47.28±10.49岁。
1.2 标本收集 禁食12小时，次日晨抽外周静脉血5ml，置于10ml无菌加盖EDTA抗凝塑料离心管中。冰浴保存。当日离心：3500rpm×15分钟分离血标本。取上层血浆于-85℃保存，以备检测血脂质和载脂蛋白等相关指标，血细胞部份-20℃保存，冻溶红细胞，用于抽提DNA。
1.3 CETP基因 taqIB多态性分析
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1.3.1 血细胞DNA抽提 酚抽提法。
1.3.2 PCR扩增引物由Cybersyn公司合成。扩增片断长1420bp。引物碱基序列为〔5〕：Primer1：5’-ACA TAT TAA GCA ATT ATC CAG AT-3’，Primer2：5’-CAC TTG TGC AAC CCA TAC TTG ACT-3’.总反应体积50ul，PCR循环参数：预变性反应95℃×7分钟，变性反应95℃×1分钟、复性反应58℃×50秒、延伸反应72℃×1分钟，35个循环，保温72℃×7分钟，终止反应4℃×10秒，PCR扩增用PCR仪自动扩增〔5〕。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增成功，见图1。
图1.PCR扩增CETPtaqIB多态性目的基因片段产物电泳结果，图示在Marker1420bp处有扩增成功的PCR产物条带。
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1.3.3 酶切及电泳 反应体积20ul，依次加入无菌去离子纯水7.5ul，B.Buffer2ul，PCR扩增产物10ul，限制性内切酶taqI5u(宝灵曼公司)至0.5ml无菌Eppendorf管中，65℃恒温水浴箱中保温3小时，终止反应。制8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果，见图2～3。
图2.taqI酶切后B1B1，B1B2基因型电泳图谱，图示Lanel-3：B1B2，Lane4：B1B1，Lane5：Marker。
图3.taqI酶切后B1B1，B2B2基因型电泳图谱，图示Lanel-1：B2B2，Lane2～4：B1B2，Lane5：Marker。
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1.3.4 酶切结果分析 CETP基因taqIB多态性目的基因片断长1420bp，经taqI酶切后形成三种片断：1420bp、600bp、820bp。构成三种基因型：B1B1、B1B2、B2B2。在电泳图谱上表现为：B1B1有600bp及820bp两条电泳带，B1B2有1420bp、600bp、820bp三条电泳带，B2B2只有1420bp一条电泳带。
1.4 血浆载脂蛋白apoAI及血脂测定 试剂盒购自华西医科大学生化教研组载脂蛋白研究室自行研制药盒。按试剂盒说明操作。用RIA法(Radial Immuodiffusion Assay)分析样品血浆apoAI。甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-ch)，高密度脂蛋白亚型(HDL2-ch)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-ch)和极低密度脂蛋白胆固醇(vLDL-ch)均用酶法测定。试剂盒购自东瓯生物工程有限公司。
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1.5 统计分析 计量指标用
±S表示，两均数t检验进行统计处理、计数资料用x2检验进行统计处理。
2 实验结果
2.1 胆囊结石组及对照组CETP基因taqIB多态性基因频率检测结果 胆囊结石组及对照组各基因型频率及等位基因频率观察值经Hardy weinburg方程检验皆使方程平衡。同组同一基因型频率或等位基因频率的观察值与期望值比较无显著性差异(P>0.01)，说明实验结果与被研究群体符合，实验结果可靠。胆囊结石组B1B1，B2B2基因型频率及B1等位基因频率，B2等位基因频率与对照组比较有显著性差异(P*<0.01)，结果见表1。
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表1.胆囊结石组与对照组CETPtaqIB基因频率结果 基因型
胆囊结石组
P
对照组
P
P*
N
%
N
%
B1B1
观察值
, 百拇医药
30/104
28.8%
>0.01
8/68
11.76%
>0.01
<0.01
期望值
28.70/104
27.6%
7.39/68
10.87%
B1B2
, 百拇医药
观察值
49/104
47%
>0.01
31/68
45.5%
>0.01
>0.01
期望值
51.79/104
49.8%
30.06/68
44.2%
, 百拇医药
B2B2
观察值
25/104
24.2%
>0.01
29/68
42.6%
>0.01
<0.01
期望值
23.36/104
22.4%
, 百拇医药
30.51/68
44.8%
B1
观察值
52.3%
>0.01
34.6%
>0.01
<0.01
期望值
52.6%
33.0%
B2
, 百拇医药
观察值
47.7%
>0.01
65.4%
>0.01
<0.01
期望值
47.4%
67.0%
2.2 胆囊结石组及对照组不同基因型血脂及相关指标结果 胆囊结石组B1B1基因型HDL-ch、HDL2-ch水平低于B2B2基因型HDL-ch、HDL2-ch水平(P<0.01)，对照组结果类似。结果详见表2。表2.胆囊结石组及对照组不同基因型血脂及相关指标比较
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胆囊结石组
对照组
B1B1
B1B2
B2B2
B1B1
B1B2
B2B2
N
30
, 百拇医药
49
25
8
31
29
性别(男/女)
12/18
17/32
10/15
4/4
13/18
13/16
年龄(岁)
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51.17±12.13
52.3±14.9
49.6±12.8
48.25±13.65
47.2±11.66
46.96±8.62
BMI(Kg/m2)
23.78±2.21
24.26±2.04
24.09±2.4
21.1±1.93
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20.75±1.74
21.36±2.04
apoAI(mg/dl)
87.37±9.85
93.79±14.7
90.97±11.11
89.21±12.2
97.34±17.58
94.44±14.84
TG(mmol/L)
1.31±0.69
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1624±0.66
1.12±0.47
0.96±0.53
0.82±0.43
0.78±0.34
TC(mmol/L)
3.56±0.59
3.46±0.52
3.62±0.44
3.62±0.77
3.72±0.55
3.78±0.59
, 百拇医药
vLDL-/ch(mmol/L)
0.77±0.21
0.71±0.13
0.67±0.11
0.49±0.12
0.48±0.14
0.47±0.11
LDL-ch(mmol/L)
1.92±0.55
1.76±0.48
1.71±0.38
, 百拇医药
2.23±0.45
2.13±0.36
2.16±0.41
HDL-ch(mmol/L)
0.86±0.14
0.96±0.15
1.18±0.11△
0.90±0.17
1.13±0.12
1.25±0.07*
HDL2-ch(mmol/L)
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0.41±0.09
0.53±0.12
0.68±0.08△
0.47±0.08
0.59±0.1
0.75±0.11*
注：1.△：同组B1B1 VS B2B2 P<0.01 2.*：同组B1B1 VS B2B2 P<0.01
3 讨论
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本实验结果发现胆囊结石组CETP基因taqIB多态性B1B1基因型频率为28.8%、B1B2基因型频率占47%，B2B2基因型频率占24.2%，B1等位基因频率为52.3%，B2等位基因频率为47.7%与对照组比较胆囊结石组B1等位基因频率及B1B1基因型频率高于对照组(P*<0.01)，相反，胆囊结石组B2等位基因频率及B2B2基因型频率低于对照组(P*<0.01)。说明在胆囊结石组B1等位基因是主导基因，在对照组B2等位基因是主导基因。
流行病学的调查发现胆囊结石病患者脂代谢异常主要特点之一是HDL降低或相对降低。胆囊结石病患者有家族聚集性〔3〕。上述研究提示胆囊结石病成因既有代谢因素也有遗传因素参与。但从遗传学角度探讨胆囊结石病患者HDL-ch及亚型降低的原因报导很少。Juvonen晚近报告胆囊结石病患者CETP基因taqIB多态性B1等位基因与HDL-ch水平下降有联系。初步揭示西方胆囊结石病患者中CETP基因taqIB多态性与HDL-ch的关系〔6〕。本实验用中国汉族人作研究对象，发现B1等位基因及B1B1基因型与低水平HDL-ch、HDL2-ch的联系。有学者证实CETP基因taqIB多态性是影响HDL-ch、HDL2-ch代谢的独立因素〔5，7，8〕。证明遗传因素在影响HDL-ch及亚型代谢中的地位。本研究胆囊结石组B1等位基因频率及B1B1基因型频率高于对照组(P<0.01)。提示B1等位基因及B1B1基因型在胆囊结石组具优势作用。B1B1基因型脂代谢特征为血HDL-ch及HDL2-ch水平降低，而血HDL-ch及HDL2-ch水平降低是胆囊结石形成的高危因素。说明B1等位基因及B1B1基因型是是部分中国汉族人胆囊结石病患者的遗传因素。
, 百拇医药
参考文献
1.Jergensen T.Gallstones and Plasma Lipids in a Danish Population.Scand J Gastroenterol 1989；24∶916.
2.Gregory.C.M.Plasma Lipids and Gallbladder Disease.American Journal of Epidemiology.1991；34∶78.
3.Shiv.K.S.High familial prevalence of gallstones in the first-degree relativesof gallstone patients.Hepatology 1995；22∶138.
4.David QH，Wang，Beveriy P，et al Phenotypiccharacterization of Lith genes that determine susceptibility to cholesterol cholelithiasis in inbred mice∶physicalchemistry of gallbladder bile.J Lip Res.1997；38∶1395.
, 百拇医药
5.Kuivenhoven JA，Kuijft P，Jolayuda MA.et al.Heterogeneity at the CETP Gene locus in fluence on plasma CETP concentrations and HDLcholesterol levels.Arteri.Thcom.vasclu.Bio.1997；17∶560.
6.Juvonen T，Savolainen M J，KairaluomaM L.et al.Polymorphisms at the apoB，apoAI，and cholesteryl ester transfer protein gene loci in patiens with gallbladder disease.J.Lipid.Res.1995；36∶804.
7.Freeman DJ.Polymorphisms in the gene coding for cholesteryl ester transfer protein are related to plasma high-desity lipoproein cholesterol and transfer proten activity.Clin Sci.1990；79∶575～581.
8.Freeman DJ.Grifin BA.Holmes AP.et al.Regulation of plasma HDL cholesterol and subfraction distribution by genetic and enviroumenal factors：associations between the TaqIB in the CETP gene and smoking and obesity.Arterioscler Thromb.1994；14∶336～344.
(1998-11-11收稿), 百拇医药
单位：张明仪 四川省肿瘤医院腹部外科(610041)； 舒晔 赵纪春 刘嘉林 程南生 李宁 肖路加 华西医科大学附属第一医院普外科
关键词：胆囊结石病；胆固醇酯转移蛋白；基因多态性异常脂血症
华西医学990173 摘要：目的：揭示胆囊结石病与遗传因素的关系。方法：运用多聚酶链反应技术(PCR)和基因限制性片段长度多态性分析法(RFLPs)对104例胆囊结石病人和68例健康人进行调查研究。结果：发现胆囊结石组B1等位基因，B1B1基因型，B2等位基因，B2B2基因型频率与对照组相应等位基因及基因型频率比较有差异(0.5230vs0.3460 0.2880vs0.1176 0.4770vs0.6540 0.2420vs0.4264 P<0.01)。B1B1基因型HDL-ch和HDL2-ch水平降低，与B2B2基因型的HDL-ch、HDL2-ch比较有差异(P<0.01)。结论：B1等位基因和B1B1基因型与低HDL-ch、HDL2-ch水平相关。B1等位基因是部分中国汉族人胆囊结石病人的遗传易感因素。
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〔中图分类号〕R575.6+2；R894
〔文献标识码〕B
Polymorphism at Cholesteryl Ester Transfer Protein Gene Loci in Patients with Gallstone
ZHANG Ming-yi1，SHU Ye2，ZHAO2 Ji-chun，et al.
流行病学调查发现胆囊结石病人高密度脂蛋白胆固醇(HDL-ch)下降、甘油三酯(TG)上升等是胆囊结石形成的高危因素〔1，2〕，胆囊结石病人的家族聚集性表明胆囊结石病具遗传倾向〔3〕。有学者用小鼠作实验证实有致石基因(Lith genes)〔4〕。本实验调查与胆固醇逆转运密切相关的胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)基因多态性以及与血HDL-ch及HDL-ch亚型水平的关系，为揭示胆囊结石病发病中某些遗传易感因素。
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1 资料和方法
1.1 实验对象及分组 实验分胆囊结石组、对照组。胆囊结石组系在华西医科大学附一院住院择期行胆囊切除的汉族患者。包括腹腔镜手术、开腹手术者。术中皆证实为胆囊结石病。胆囊结石组共104例，男性39例，女性65例。平均年龄51.41±12.8岁。对照组为同期作健康体检的汉族志愿者。对照组纳入标准，无高血脂、无糖尿病、无肥胖、未怀孕、未服用避孕药。无肝、胆、甲状腺等病史。共68例，男性30例，女性38例。平均年龄47.28±10.49岁。
1.2 标本收集 禁食12小时，次日晨抽外周静脉血5ml，置于10ml无菌加盖EDTA抗凝塑料离心管中。冰浴保存。当日离心：3500rpm×15分钟分离血标本。取上层血浆于-85℃保存，以备检测血脂质和载脂蛋白等相关指标，血细胞部份-20℃保存，冻溶红细胞，用于抽提DNA。
1.3 CETP基因 taqIB多态性分析
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1.3.1 血细胞DNA抽提 酚抽提法。
1.3.2 PCR扩增引物由Cybersyn公司合成。扩增片断长1420bp。引物碱基序列为〔5〕：Primer1：5’-ACA TAT TAA GCA ATT ATC CAG AT-3’，Primer2：5’-CAC TTG TGC AAC CCA TAC TTG ACT-3’.总反应体积50ul，PCR循环参数：预变性反应95℃×7分钟，变性反应95℃×1分钟、复性反应58℃×50秒、延伸反应72℃×1分钟，35个循环，保温72℃×7分钟，终止反应4℃×10秒，PCR扩增用PCR仪自动扩增〔5〕。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增成功，见图1。
图1.PCR扩增CETPtaqIB多态性目的基因片段产物电泳结果，图示在Marker1420bp处有扩增成功的PCR产物条带。
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1.3.3 酶切及电泳 反应体积20ul，依次加入无菌去离子纯水7.5ul，B.Buffer2ul，PCR扩增产物10ul，限制性内切酶taqI5u(宝灵曼公司)至0.5ml无菌Eppendorf管中，65℃恒温水浴箱中保温3小时，终止反应。制8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果，见图2～3。
图2.taqI酶切后B1B1，B1B2基因型电泳图谱，图示Lanel-3：B1B2，Lane4：B1B1，Lane5：Marker。
图3.taqI酶切后B1B1，B2B2基因型电泳图谱，图示Lanel-1：B2B2，Lane2～4：B1B2，Lane5：Marker。
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1.3.4 酶切结果分析 CETP基因taqIB多态性目的基因片断长1420bp，经taqI酶切后形成三种片断：1420bp、600bp、820bp。构成三种基因型：B1B1、B1B2、B2B2。在电泳图谱上表现为：B1B1有600bp及820bp两条电泳带，B1B2有1420bp、600bp、820bp三条电泳带，B2B2只有1420bp一条电泳带。
1.4 血浆载脂蛋白apoAI及血脂测定 试剂盒购自华西医科大学生化教研组载脂蛋白研究室自行研制药盒。按试剂盒说明操作。用RIA法(Radial Immuodiffusion Assay)分析样品血浆apoAI。甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-ch)，高密度脂蛋白亚型(HDL2-ch)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-ch)和极低密度脂蛋白胆固醇(vLDL-ch)均用酶法测定。试剂盒购自东瓯生物工程有限公司。
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1.5 统计分析 计量指标用
±S表示，两均数t检验进行统计处理、计数资料用x2检验进行统计处理。2 实验结果
2.1 胆囊结石组及对照组CETP基因taqIB多态性基因频率检测结果 胆囊结石组及对照组各基因型频率及等位基因频率观察值经Hardy weinburg方程检验皆使方程平衡。同组同一基因型频率或等位基因频率的观察值与期望值比较无显著性差异(P>0.01)，说明实验结果与被研究群体符合，实验结果可靠。胆囊结石组B1B1，B2B2基因型频率及B1等位基因频率，B2等位基因频率与对照组比较有显著性差异(P*<0.01)，结果见表1。
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表1.胆囊结石组与对照组CETPtaqIB基因频率结果 基因型
胆囊结石组
P
对照组
P
P*
N
%
N
%
B1B1
观察值
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30/104
28.8%
>0.01
8/68
11.76%
>0.01
<0.01
期望值
28.70/104
27.6%
7.39/68
10.87%
B1B2
, 百拇医药
观察值
49/104
47%
>0.01
31/68
45.5%
>0.01
>0.01
期望值
51.79/104
49.8%
30.06/68
44.2%
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B2B2
观察值
25/104
24.2%
>0.01
29/68
42.6%
>0.01
<0.01
期望值
23.36/104
22.4%
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30.51/68
44.8%
B1
观察值
52.3%
>0.01
34.6%
>0.01
<0.01
期望值
52.6%
33.0%
B2
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观察值
47.7%
>0.01
65.4%
>0.01
<0.01
期望值
47.4%
67.0%
2.2 胆囊结石组及对照组不同基因型血脂及相关指标结果 胆囊结石组B1B1基因型HDL-ch、HDL2-ch水平低于B2B2基因型HDL-ch、HDL2-ch水平(P<0.01)，对照组结果类似。结果详见表2。表2.胆囊结石组及对照组不同基因型血脂及相关指标比较
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胆囊结石组
对照组
B1B1
B1B2
B2B2
B1B1
B1B2
B2B2
N
30
, 百拇医药
49
25
8
31
29
性别(男/女)
12/18
17/32
10/15
4/4
13/18
13/16
年龄(岁)
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51.17±12.13
52.3±14.9
49.6±12.8
48.25±13.65
47.2±11.66
46.96±8.62
BMI(Kg/m2)
23.78±2.21
24.26±2.04
24.09±2.4
21.1±1.93
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20.75±1.74
21.36±2.04
apoAI(mg/dl)
87.37±9.85
93.79±14.7
90.97±11.11
89.21±12.2
97.34±17.58
94.44±14.84
TG(mmol/L)
1.31±0.69
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1624±0.66
1.12±0.47
0.96±0.53
0.82±0.43
0.78±0.34
TC(mmol/L)
3.56±0.59
3.46±0.52
3.62±0.44
3.62±0.77
3.72±0.55
3.78±0.59
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vLDL-/ch(mmol/L)
0.77±0.21
0.71±0.13
0.67±0.11
0.49±0.12
0.48±0.14
0.47±0.11
LDL-ch(mmol/L)
1.92±0.55
1.76±0.48
1.71±0.38
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2.23±0.45
2.13±0.36
2.16±0.41
HDL-ch(mmol/L)
0.86±0.14
0.96±0.15
1.18±0.11△
0.90±0.17
1.13±0.12
1.25±0.07*
HDL2-ch(mmol/L)
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0.41±0.09
0.53±0.12
0.68±0.08△
0.47±0.08
0.59±0.1
0.75±0.11*
注：1.△：同组B1B1 VS B2B2 P<0.01 2.*：同组B1B1 VS B2B2 P<0.01
3 讨论
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本实验结果发现胆囊结石组CETP基因taqIB多态性B1B1基因型频率为28.8%、B1B2基因型频率占47%，B2B2基因型频率占24.2%，B1等位基因频率为52.3%，B2等位基因频率为47.7%与对照组比较胆囊结石组B1等位基因频率及B1B1基因型频率高于对照组(P*<0.01)，相反，胆囊结石组B2等位基因频率及B2B2基因型频率低于对照组(P*<0.01)。说明在胆囊结石组B1等位基因是主导基因，在对照组B2等位基因是主导基因。
流行病学的调查发现胆囊结石病患者脂代谢异常主要特点之一是HDL降低或相对降低。胆囊结石病患者有家族聚集性〔3〕。上述研究提示胆囊结石病成因既有代谢因素也有遗传因素参与。但从遗传学角度探讨胆囊结石病患者HDL-ch及亚型降低的原因报导很少。Juvonen晚近报告胆囊结石病患者CETP基因taqIB多态性B1等位基因与HDL-ch水平下降有联系。初步揭示西方胆囊结石病患者中CETP基因taqIB多态性与HDL-ch的关系〔6〕。本实验用中国汉族人作研究对象，发现B1等位基因及B1B1基因型与低水平HDL-ch、HDL2-ch的联系。有学者证实CETP基因taqIB多态性是影响HDL-ch、HDL2-ch代谢的独立因素〔5，7，8〕。证明遗传因素在影响HDL-ch及亚型代谢中的地位。本研究胆囊结石组B1等位基因频率及B1B1基因型频率高于对照组(P<0.01)。提示B1等位基因及B1B1基因型在胆囊结石组具优势作用。B1B1基因型脂代谢特征为血HDL-ch及HDL2-ch水平降低，而血HDL-ch及HDL2-ch水平降低是胆囊结石形成的高危因素。说明B1等位基因及B1B1基因型是是部分中国汉族人胆囊结石病患者的遗传因素。
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参考文献
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(1998-11-11收稿), 百拇医药