反相高效液相色谱法检测人血浆中环丙沙星浓度
作者：金鸣 吴贵宝 杨德隆
单位：金鸣(同济医科大学法医系化学教研室 武汉430030)；吴贵宝(同济医科大学法医系化学教研室 武汉430030)；杨德隆(同济医科大学法医系化学教研室 武汉430030)
关键词：高效液相色谱；环丙沙星
数理医药学杂志000332
摘 要 以三乙胺作为离子对试剂，建立了一个检测人血浆中环丙沙星浓度的高效液相色谱法，该方法在0.02～0.40μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数为r=0.9999，平均回收率为97.2%，最低检测限为0.2ng，最小检出浓度为0.015μg/ml，(S/N=3)8分钟内完成一次样品分析。测定方法简便，结果理想。
中图分类号：O 657.7+ 2 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1004-4337(2000)03-0240-02
环丙沙星(Ciprofloxacin)是化学合成的抗菌药，属氟喹诺酮类。该药具有广谱抗菌作用，尤以对肠杆菌科等革兰氏阴性菌具有高度的抗菌活性，在国内外广泛用于临床。经资料查证[1～4]，以高效液相色谱法对环丙沙星进行测定时，流动相中均须使用特殊试剂：四丁基氢氧化铵或四丁基溴化铵等，由于此类试剂较贵不易购置，使得文献报导的分析方法难以实施。本文以三乙胺为离子对试剂，对高效液相色谱分析方法进行了研究，建立起一个简便、快速、准确的分析方法，并应用该方法对8名健康受试者进行了24小时血浓度监测，为环丙沙星的药物分析、血药浓度监测提供了方便。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 日本岛津LC-1型高效液相色谱仪，FID-1荧光检测器，C-RIB数据处理机。
, 百拇医药
1.2 试剂 环丙沙星标准品由同济医科大学实验研究中心提供，甲醇、乙腈为色谱纯，三乙胺、磷酸二氢钾、二氯甲烷、高氯酸、柠檬酸、无水乙酸钠均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品处理 取人血浆1.0ml，置具塞试管中，加1.0ml磷酸缓冲液(PH=7.8)，再加二氯甲烷5ml萃取，振摇15分钟，离心10分钟(2500转/分钟)，吸出有机相，吹干定容。取20μl直接进样。
2.2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18 Φ4.6mm×200mm；
流动相：乙腈∶甲醇∶水=10∶1∶40,三乙胺加入量为0.12%(V/V)，柠檬酸0.2%(W/V)，无水乙酸钠0.2%(W/V)，高氯酸调PH=3.5，超声脱气5分钟备用；
, 百拇医药
流速：0.8ml/min；
荧光检测器：激发波长278nm,发射波长445nm；
进样量：20μl。
2.3 标准溶液配制
准确称取环丙沙星标准品10.00mg于50ml容量瓶中，以流动相溶解定容，作为标准储备液，浓度为0.2000mg/ml。
2.4 线性关系和检测限
取环丙沙星储备液配制成浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40μg/ml标准系列，在上述色谱条件下，依次吸取20μl进样(N=5)，以峰高为横坐标，浓度为纵坐标作线性回归，得到其回归方程为Y=-0.0029X-0.0082,相关系数r=0.9999，线性范围0.02～0.04μg/ml，最低检测限可达0.2ng(S/N=3)。
, 百拇医药
2.5 精密度测定
取浓度为0.05、0.20、0.30μg/ml三种环丙沙星标准溶液，在上述色谱条件下每样品重复进样4次，进样量20μl，连续测定两日，由峰高值计算标准偏差(SD)和变异系数(CV%)，测定结果见表1。
表1 精密度测定结果(N=4) 标准浓度
(μg/ml)
当日
(mm±SD)
CV%
次日
(mm±SD)
CV%
, 百拇医药
0.05
9.0±0.3
7.9
10.1±0.3
2.5
0.20
37.6±1.1
2.9
38.7±0.5
1.3
0.30
56.7±1.1
2.0
, 百拇医药
56.3±1.8
3.9
平均CV%±SD
4.3±3.2
2.3±1.0
以上结果表明精密度符合要求，方法可行。
2.6 回收率实验
取空白人血浆三份，每份1.0ml，加标准环丙沙星配成0.05,0.20,0.50μg/ml标准血样，按上述样品处理方法处理，定容后进样20μl。计算回收率，结果见表2。
表2 回收率实验结果(N=4) 加样浓度
(μg/ml)
, http://www.100md.com
检出浓度
(μg/ml±SD)
回收率
(
±SD)%
0.05
0.048±0.002
96.7±4.8
0.20
0.21±0.01
101.3±3.1
0.50
, 百拇医药
0.47±0.01
93.6±2.4
3 样品分析
对8名受试者在用药后24小时内分10个时间各抽取10个样本，用上述方法对血液中环丙沙星浓度进行测定，结果见表3及图1。
表3 环丙沙星浓度结果(μg/ml) 编
号
0
0.5
1
1.5
2
, http://www.100md.com
(hr)
3
6
10
15
24
1
0.0
3.57
4.86
4.18
2.91
2.13
, 百拇医药 0.85
0.49
0.22
0.04
2
0.0
2.50
5.13
5.02
3.69
2.44
1.35
0.69
, http://www.100md.com
0.36
0.09
3
0.0
2.88
4.12
3.99
3.15
2.13
0.92
0.39
0.17
0.04
, 百拇医药
4
0.0
1.25
2.56
3.51
3.64
2.37
1.16
0.76
0.32
0.10
5
0.0
, 百拇医药
2.14
4.77
5.86
5.32
3.34
1.33
0.75
0.34
0.09
6
0.0
3.22
4.72
, 百拇医药
4.96
4.18
3.04
1.00
0.75
0.25
0.12
7
0.0
3.73
5.80
6.34
5.98
, 百拇医药
3.05
1.74
0.87
0.46
0.14
8
0.0
6.82
5.98
4.60
3.82
2.56
1.14
, 百拇医药
0.62
0.31
0.10
a. 空白血浆 b. 空白血浆+标准品 c. 受试者服药后血样
图1 环丙沙星色谱图
4 讨论
本文对是否在流动相中添加三乙胺及其用量作了比较研究，认为流动相中加入三乙胺后色谱峰型好、分离效果理想，并且不受干扰。
对磷酸缓冲液(PH=7.8)—二氯甲烷与磷酸—乙腈—二氯甲烷两种样品处理方法进行了考察，认为两种处理方法对回收率影响不大，前者更为简便。
, 百拇医药
受试者的环丙沙星血浓度监测结果与文献[2]报导的各药代动力学参数极为接近，方法可靠。
本研究所建立的高效液相色谱法不需要贵重试剂，精密度、准确度均符合要求，可方便、快捷地用于临床监测、药物分析等研究。
参考文献
1，施耀国等.环丙沙星及其代谢物体液浓度的高效液相色谱测定法.中国抗生素杂志，1993，(3)：206～209.
2，李亚洲等.正常人一次口服国产环丙沙星药代动力学研究.中国临床药理学杂志，1992，8(4)：204～208.
3，INGRID NILSSON-EHLE, Assay of ciprofloxacin and norfloxacin in serum and urine by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography, 1987,416,207～211.
4，WALID M.AWNI, JAY CLARKSON and DAVID R.P.GUAY, Determination of ciprofloxacin and its 7-ethylenediamine metabolite in human serum and urine by highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography, 1987,419,414～420.
收稿日期：1999-12-20, 百拇医药
单位：金鸣(同济医科大学法医系化学教研室 武汉430030)；吴贵宝(同济医科大学法医系化学教研室 武汉430030)；杨德隆(同济医科大学法医系化学教研室 武汉430030)
关键词：高效液相色谱；环丙沙星
数理医药学杂志000332
摘 要 以三乙胺作为离子对试剂，建立了一个检测人血浆中环丙沙星浓度的高效液相色谱法，该方法在0.02～0.40μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数为r=0.9999，平均回收率为97.2%，最低检测限为0.2ng，最小检出浓度为0.015μg/ml，(S/N=3)8分钟内完成一次样品分析。测定方法简便，结果理想。
中图分类号：O 657.7+ 2 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1004-4337(2000)03-0240-02
环丙沙星(Ciprofloxacin)是化学合成的抗菌药，属氟喹诺酮类。该药具有广谱抗菌作用，尤以对肠杆菌科等革兰氏阴性菌具有高度的抗菌活性，在国内外广泛用于临床。经资料查证[1～4]，以高效液相色谱法对环丙沙星进行测定时，流动相中均须使用特殊试剂：四丁基氢氧化铵或四丁基溴化铵等，由于此类试剂较贵不易购置，使得文献报导的分析方法难以实施。本文以三乙胺为离子对试剂，对高效液相色谱分析方法进行了研究，建立起一个简便、快速、准确的分析方法，并应用该方法对8名健康受试者进行了24小时血浓度监测，为环丙沙星的药物分析、血药浓度监测提供了方便。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 日本岛津LC-1型高效液相色谱仪，FID-1荧光检测器，C-RIB数据处理机。
, 百拇医药
1.2 试剂 环丙沙星标准品由同济医科大学实验研究中心提供，甲醇、乙腈为色谱纯，三乙胺、磷酸二氢钾、二氯甲烷、高氯酸、柠檬酸、无水乙酸钠均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品处理 取人血浆1.0ml，置具塞试管中，加1.0ml磷酸缓冲液(PH=7.8)，再加二氯甲烷5ml萃取，振摇15分钟，离心10分钟(2500转/分钟)，吸出有机相，吹干定容。取20μl直接进样。
2.2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18 Φ4.6mm×200mm；
流动相：乙腈∶甲醇∶水=10∶1∶40,三乙胺加入量为0.12%(V/V)，柠檬酸0.2%(W/V)，无水乙酸钠0.2%(W/V)，高氯酸调PH=3.5，超声脱气5分钟备用；
, 百拇医药
流速：0.8ml/min；
荧光检测器：激发波长278nm,发射波长445nm；
进样量：20μl。
2.3 标准溶液配制
准确称取环丙沙星标准品10.00mg于50ml容量瓶中，以流动相溶解定容，作为标准储备液，浓度为0.2000mg/ml。
2.4 线性关系和检测限
取环丙沙星储备液配制成浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40μg/ml标准系列，在上述色谱条件下，依次吸取20μl进样(N=5)，以峰高为横坐标，浓度为纵坐标作线性回归，得到其回归方程为Y=-0.0029X-0.0082,相关系数r=0.9999，线性范围0.02～0.04μg/ml，最低检测限可达0.2ng(S/N=3)。
, 百拇医药
2.5 精密度测定
取浓度为0.05、0.20、0.30μg/ml三种环丙沙星标准溶液，在上述色谱条件下每样品重复进样4次，进样量20μl，连续测定两日，由峰高值计算标准偏差(SD)和变异系数(CV%)，测定结果见表1。
表1 精密度测定结果(N=4) 标准浓度
(μg/ml)
当日
(mm±SD)
CV%
次日
(mm±SD)
CV%
, 百拇医药
0.05
9.0±0.3
7.9
10.1±0.3
2.5
0.20
37.6±1.1
2.9
38.7±0.5
1.3
0.30
56.7±1.1
2.0
, 百拇医药
56.3±1.8
3.9
平均CV%±SD
4.3±3.2
2.3±1.0
以上结果表明精密度符合要求，方法可行。
2.6 回收率实验
取空白人血浆三份，每份1.0ml，加标准环丙沙星配成0.05,0.20,0.50μg/ml标准血样，按上述样品处理方法处理，定容后进样20μl。计算回收率，结果见表2。
表2 回收率实验结果(N=4) 加样浓度
(μg/ml)
, http://www.100md.com
检出浓度
(μg/ml±SD)
回收率
(
±SD)%0.05
0.048±0.002
96.7±4.8
0.20
0.21±0.01
101.3±3.1
0.50
, 百拇医药
0.47±0.01
93.6±2.4
3 样品分析
对8名受试者在用药后24小时内分10个时间各抽取10个样本，用上述方法对血液中环丙沙星浓度进行测定，结果见表3及图1。
表3 环丙沙星浓度结果(μg/ml) 编
号
0
0.5
1
1.5
2
, http://www.100md.com
(hr)
3
6
10
15
24
1
0.0
3.57
4.86
4.18
2.91
2.13
, 百拇医药 0.85
0.49
0.22
0.04
2
0.0
2.50
5.13
5.02
3.69
2.44
1.35
0.69
, http://www.100md.com
0.36
0.09
3
0.0
2.88
4.12
3.99
3.15
2.13
0.92
0.39
0.17
0.04
, 百拇医药
4
0.0
1.25
2.56
3.51
3.64
2.37
1.16
0.76
0.32
0.10
5
0.0
, 百拇医药
2.14
4.77
5.86
5.32
3.34
1.33
0.75
0.34
0.09
6
0.0
3.22
4.72
, 百拇医药
4.96
4.18
3.04
1.00
0.75
0.25
0.12
7
0.0
3.73
5.80
6.34
5.98
, 百拇医药
3.05
1.74
0.87
0.46
0.14
8
0.0
6.82
5.98
4.60
3.82
2.56
1.14
, 百拇医药
0.62
0.31
0.10
a. 空白血浆 b. 空白血浆+标准品 c. 受试者服药后血样
图1 环丙沙星色谱图
4 讨论
本文对是否在流动相中添加三乙胺及其用量作了比较研究，认为流动相中加入三乙胺后色谱峰型好、分离效果理想，并且不受干扰。
对磷酸缓冲液(PH=7.8)—二氯甲烷与磷酸—乙腈—二氯甲烷两种样品处理方法进行了考察，认为两种处理方法对回收率影响不大，前者更为简便。
, 百拇医药
受试者的环丙沙星血浓度监测结果与文献[2]报导的各药代动力学参数极为接近，方法可靠。
本研究所建立的高效液相色谱法不需要贵重试剂，精密度、准确度均符合要求，可方便、快捷地用于临床监测、药物分析等研究。
参考文献
1，施耀国等.环丙沙星及其代谢物体液浓度的高效液相色谱测定法.中国抗生素杂志，1993，(3)：206～209.
2，李亚洲等.正常人一次口服国产环丙沙星药代动力学研究.中国临床药理学杂志，1992，8(4)：204～208.
3，INGRID NILSSON-EHLE, Assay of ciprofloxacin and norfloxacin in serum and urine by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography, 1987,416,207～211.
4，WALID M.AWNI, JAY CLARKSON and DAVID R.P.GUAY, Determination of ciprofloxacin and its 7-ethylenediamine metabolite in human serum and urine by highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography, 1987,419,414～420.
收稿日期：1999-12-20, 百拇医药