大黄素、川芎嗪对中分子物质损伤人胚大脑皮层神经元影响的实验研究
作者：马琼英 高 鸣 王小琴 何 萍 张建军 晏雪生
单位：马琼英 高 鸣 王小琴 何 萍 湖北中医学院附属医院肾内科 430061； 张建军 晏雪生 湖北中医学院脏象研究所
关键词：大黄素；川芎嗪；@中分子物质；尿毒症；并发症；脑病
湖北中医学院学报/990123 摘要 目的 研究大黄素、川芎嗪对中分子物质引起大脑皮层神经元损伤的保护作用。方法 在人胚大脑皮层神经元培养体系中，加入不同浓度的大黄素、川芎嗪及主要中分子物质损伤组份(MMSⅢ)进行四唑嗅蓝(MTT)快速自动微显比色分析测A值及自动速率法测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量实验。结果 ①10μg/ml浓度的大黄素、川芎嗪加入体外培养的人胚大脑皮层神经元后，A值与LDH漏出量均与对照组无显著性差异，此浓度对神经元无损伤作用。②10μg/ml浓度的大黄素与MMSⅢ共同加入体外培养的人胚大脑皮层神经元，A值与LDH漏出量均与损伤对照组有显著差异，川芎嗪则无显著差异。 结论 大黄素对大脑皮层神经元有免受MMSⅢ损伤而具保护作用，川芎嗪则无保护作用。
, 百拇医药
中国图书分类号 R285.6
Experimental Study of Influence of Emodin and Tetramethy Lpyragine on Human Embryonic Cerebral Cortex Neuron Damaged by MMS
Ma Qiongying,Gao Ming,Wang Xiaoqin,et al.
Department of Nephrology,Hubei.Traditional Chinese Medicine Hospital,Wuhan 430061.
Abstract: To study the effect of emodin and tetramethy lpyragine on protecting human embryonic cerebral cortex neuron from being damaged by MMS.Methods: we add the emodin,tetramethy lpyragine of different concentrations and MMS Ⅲ to the cerebral cortex neuron.The A value and leak amount of LDH were detected by the rapid automated colorimetric microassay(MTT)and automatic rate method.Results: ①Emodin and tetramethy lpyragine of 10ug/ml density were added to human embryonic cerebral cortex neuron.The A and LDH value had no difference with that of control group.This density can not damage neuron.②Emodia of 10ug/ml density and MMS Ⅲwere added to human embryonic cerebral cortex neuron.The A、LDH value were distinctly different from that of MMS Ⅲgroup.But tetramethy lpyragine had no difference.Conclusion: Emodin can protect the human embryonic cerebral cortex neuron from injured by MMS Ⅲ. But tetramethy lpyragine has not this kind of function.
, 百拇医药
Key words: Emodin Tetramethy lpyragine @Middle molecular substance Uremia Complication Encephalopathy
大量临床及实验研究证明尿毒症脑病与中分子物质(Middle Molecular Substance MMS)相关。我们研究发现，从尿毒症患者血液透析超滤液中提取并分离的中分子物质组分Ⅲ(MMSⅢ1090-1800dal)对体外培养的大脑皮层神经元有损伤作用。大黄素、川芎嗪是治疗尿毒症及其并发症中药大黄、川芎的主要药物成分，本实验首先观察大黄素、川芎嗪对体外培养的大脑皮层神经元的影响，其次研究大黄素、川芎嗪对MMSⅢ参加的体外培养的大脑皮层神经元的作用，以寻求尿毒症脑病的有效治疗方法(或药物)。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 自制的并由相差显微镜、尼氏体染色证实的相对单一的人胚大脑皮层神经元培养体系(方法略)。
1.1.2 仪器及试剂：聚乙烯读数板，EP管，ELISA自动分析仪、752-紫外分光光度计(上海仪器分析厂)，全自动生化分析仪(日本Olympus公司)，按马琼英方法制备且已被证实对大脑皮层
神经元有损伤作用的MMS Ⅲ(1090～1800dal)，大黄素、川芎嗪(中国药品检定所)，1.5mg/ml MTT溶液(用MEM培养液配制)，0.08mol/ml盐酸-异丙醇溶液，LDH试剂盒(北京中生生物工程公司)。
1.2 方法
1.2.1 第一部分
(1)分组 培养3天或7天的神经元，分以下四组，对照组：加等量MEM培养液；大黄素组、川芎嗪组、大黄素加川芎嗪组：加10μg/ml、40μg/ml、160μg/ml的大黄素、川芎嗪、大黄素加川芎嗪。每药物每一浓度各分为二组分别用于测A值与LDH值，各孔培养条件相同。
, 百拇医药
(2)加药方法 MTT试验：培养3天的人胚大脑皮层神经元，按以上分组方法加入不同浓度的不同物质，培养20小时后，每孔加20μlMTT液，继续培养。4小时后，培养孔内产生蓝色沉淀，用吸管反复吹打，使蓝色产物充分溶解，吸取上清液，置于96孔读数板上，用ELISA自动分析仪测吸光度(A值)。LDH漏出值测定：培养7天的神经元，按以上分组方式加药，24小时后，吸出培养液置于不同编号的EP管中，按LDH试剂盒上方法，将样品和试剂安装至全自动生化分析仪上，用速率法测培养液中LDH值。反应体积比为样品：试剂=1∶50。
1.2.2 第二部分
(1)分组 培养3天或7天的神经元，分以下五组，正常对照组：加等量MEM培养液，损伤对照组加MMS Ⅲ(50μl/ml)，大黄素、川芎嗪、大黄素加川芎嗪保护组加MMS Ⅲ(50μl/ml)大黄素、川芎嗪、大黄素加川芎嗪(均10μg/ml)。
(2)加药方法 MTT实验，LDH漏出量测定实验加药方法、测定方法均与前相同。
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(3)统计方法 每实验组均为6个样品，求其均值，实验数据用
±S表示。对数据进行F及q检验。
2 结果
2.1 第一部分
2.1.1 MTT实验将10μg/ml、40μg/ml、160μg/ml浓度下测得A值经方差分析，结果显示P10<0.01、P40<0.01、0.01160<0.05，各浓度下组间均有差异，继续进行两两比较的q检验，在三种浓度下，大黄素、川芎嗪与对照组无明显差异，大黄素加川芎嗪与对照组间有显著差异。可见大黄素、川芎嗪单用对体外培养大脑皮层神经元发育期无明显影响，并以10μg/ml为实验用药浓度，而两药合用有明显抑制作用。(表1)
表1 不同浓度川芎嗪、大黄素对大脑皮层神经元A值的影响(-+SD)
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对照组
川芎嗪
大黄素
大黄素+川芎嗪
P值
10μg/ml
0.62±0.016
0.64±0.0158
0.68±0.0149
0.82±0.01329※※
<0.01
40μg/ml
, 百拇医药
0.72±0.0294△
0.82±0.0193
0.85±0.0315※△
0.89±0.0708※
<0.01
160μg/ml
0.83±0.0708△
0.89±0.0338
0.96±0.0414※△
1.16±0.0505※
0.01
与对照组比较 ：※0.01
2.1.2 LDH漏出量测定实验 将三种浓度下测得LDH漏出量经方差分析，结果显示P10>0.05、P40>0.05各组间无差异，P160<0.01各组间有显著差异。q检验大黄素、川芎嗪与对照组比较有明显差异，大黄素加川芎嗪组与对照组有显著差异。大黄素、川芎嗪与大黄素加川芎嗪组有显著差异。(表2)
表2 不同浓度大黄素、川芎嗪对大脑皮层神经元LDH漏出量的影响(+SD)
对照组
川芎嗪
, 百拇医药 大黄素
大黄素+川芎嗪
P值
10μg/ml
34.8±0.58
37.2±1.59
95.6±0.98
38.6±1.07
>0.05
40μg/ml
36.0±0.71
37.2±0.86
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37.8±0.71
40.8±1.11
>0.05
160μg/ml
42.8±1.39
54.6±1.33※△△
52.0±1.52※△△
72.2±3.22※※
<0.01
与对照组比较：※0.01
2.2 第二部分
, 百拇医药
2.2.1 MTT实验 测得A值经方差分析，P<0.01，继续进行q检验，大黄素保护组与MMS Ⅲ损伤组有显著差异，与正常组无明显差异。大黄素加川芎嗪保护组与MMS Ⅲ损伤组有明显差异，与正常组有差异。川芎嗪与损伤组无显著差异，与正常组有显著差异。(表3)
表3 10μg/ml大黄素、川芎嗪对MMS Ⅲ损伤大脑皮层神经元的保护作用(A值)(-+SD) 正常对照组
大黄素
大黄素加川芎嗪
川芎嗪
损伤对照组
0.38±0.034△△
, 百拇医药
0.44±0.0326△△
0.62±0.0269※※△
0.70±0.0262※※
0.83±0.0412※※
与正常相比较：※※P<0.01 与损伤对照组比较：△0.01
2.2.2 LDH漏出量测定 各损伤组内两两比较显示，大黄素保护组、大黄素加川芎嗪保护组与损伤对照组有显著差异，说明这两组对神经元有保护作用，大黄素保护组与大黄素加川芎嗪保护组比较无明显差异，即二组保护作用相似，各组与正常组对照大黄素保护组与之无明显差异，其余各组均与之有明显差异，可见大黄素较大黄素加川芎嗪组的保护作用强，川芎嗪组对MMS Ⅲ损伤成熟期神经元有明显保护作用。(表4)
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表4 大黄素、川芎嗪对MMS Ⅲ损伤成熟期的神经元的保护作用(LDH漏出量值)(X-±SD) MMSⅢ损伤组
川芎嗪
大黄素加川芎嗪
大黄素
正常对照组
48.33±1.58※※
46.33±1.73※※
39.67±1.74△△※※
36.83±1.35△△
33.25±0.96△△
与正常组对照：※※P<0.01 与损伤组对照：△△P<0.01
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从上述结果看出：①10μg/ml大黄素、川芎嗪对体外培养的大脑皮层神经元无损伤作用。②大黄素对神经元有损伤作用的MMS Ⅲ有拮抗作用，而起到保护神经元的作用。
3 讨论
3.1 关于实验
3.1.1 中分子物质提取和制备以及人胚大脑皮层神经元培养技术已在本课题系列实验的前面部分完成，且中分子物质制备技术已获得鉴定，在此不再论述。
3.1.2 MTT法是检测各种因子或药物作用下细胞活性的良好方法，MTT的化学本质为3-(4，5二甲基噻唑-2-YLD)-2，5-二甲基一四唑溴蓝，是显示线粒体脱氢酶的试剂。该实验反应原理：MTT在琥珀酸脱氢酶的还原作用下，在细胞内形成不溶性的蓝色沉淀物-甲颗粒。蓝色产物的多少与细胞生存数量和活力呈线性正相关，蓝色产物溶于HCL-异丙醇或二甲亚砜，在570nm下有较强的吸收，A值与蓝色产物呈负相关。因此，A值与细胞活力和数量呈负相关关系。速率法测LDH量是用自动生化分析仪自动测量预处理好的溶液内LDH含量的方法，其反应原理：L-乳酸+NAD+
丙酮酸+NADH+H+。NADH在340nm波长有最大的吸收。在碱性条件下，反应向右进行，NAD+还原成NADH的速率与LDH的活力成正比，在340nm下，测NADH上和升速率，即吸光度增加的速度，就可测出LDH活力。当细胞膜受损时，该酶从细胞中释放出来，使培养液内LDH量增加。因此，LDH漏出量的测定可作为反映细胞膜受损，细胞活力下降的指标。
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3.2 中医对尿毒症脑病和中分子物质的认识
尿毒症脑病病情危重，临床表现复杂，在祖国医籍中未有专门论述，但根据其发病、症状、演变规律，类似中医学中的“关格”、“肾劳”、“癃闭”、“溺毒”、“肾风”等病。其病因认识概括有如下四方面：①外邪侵袭、元气亏虚；②思虑过度、房室不节；③素有脾肾亏损、复感外邪；④饮食不节、七情内伤[1]。其病位涉及心、肝、肺、肾诸脏。其病机不外乎脾肾衰竭为本，湿浊邪毒蒙蔽清窍为标。肾与脑通过物质、功能，经络密切相关，故肾病可以影响到脑。随病情发展，或阴损及阳，或阳损及阴，致阴阳俱损、气血两亏、脾肾衰微、升降失常，成痰生瘀，化热动风，上扰清窍。表现为头痛、头昏、抽搐、癫狂厥症，与现代医学中的“尿毒症脑病”类似。其病理因素之湿浊邪毒，包括现代医学中的“中分子物质、小分子物质(肌酐、尿素氮)”等。中医对MMS的专门研究很少，有人研究过，MMS与“上火”、“痰症”、“苔黄”及慢性肾炎的不同证型有关，并且已见到中药降低MMS水平的临床探讨。
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3.3 大黄素、川芎嗪与尿毒症脑病
目前认为大黄素有防止慢性肾功能衰竭进展及其并发症的作用。大黄素是大黄的主要药物成分，有人已经分别从临床、体外细胞培养及动物实验方面进行了深入研究。①临床研究：短期疗效包括降低BUN水平和BUN/Scr的比值，改善尿毒症症状，长期的随访研究显示，慢性肾功衰的进展被控制而营养状态和生活质量得到改善。②细胞培养：大黄素可抑制肾小球系膜、肾小管上皮细胞生长，抑制系膜细胞纤维连接蛋白的产生，从而减少了基质的产生，抑制肾小管系膜细胞c-myc原癌基因的过度表达，及抑制系膜细胞增殖核抗原的表达，其S-期细胞数明显减少，抑制巨噬细胞核细胞产生多种细胞因子的作用。③动物实验：大黄能够降低实验动物的BUN和Scr水平，减少尿蛋白的排泄，保护肾功能，改善脂质紊乱，降低残余肾组织的耗氧量以及抑制其肾单位的肥大[2]。
另一味中药川芎亦受到重视，川芎嗪是其主要化学成分之一。味辛、微苦，性温，有活血化瘀、理气止痛作用。其药理作用包括：通过调节循环中TXA2/PGI2平衡而有效的抑制组织缺血时血小板聚集与激活[3]，可使血和脑脊液中DynA1-3合成与释放减少，改善神经系统障碍[4]，可降低全血和血浆粘度及红细胞压积，减少血浆纤维蛋白的产生，可降低血浆脂质过氧化物，血SOD等[5]。
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3.4 机制探讨
通过对大黄素、川芎嗪的研究，我们发现大黄素能够保护神经元免受MMS Ⅲ损伤。由于以上探讨的MMS Ⅲ损伤神经元的机制大多不可逆，因此，我们推测大黄素的这种保护机制有可能是直接作用于MMS Ⅲ，降解MMS Ⅲ或者与MMS Ⅲ结合，从而破坏MMS Ⅲ的活性。另一方面，大黄素对神经元病理改变的条件下表现出的作用，刚好与MMS Ⅲ的损伤神经元机制相反。另有资料可间接阐明这种保护机制，如大黄能调节cAMP/cGMP比值，使之趋于正常，能够调节脂质过氧化功能，调节线粒体电子传递系统[6]。由于大黄素是一种双向调节药物，可能在上述三种调节功能所发挥的作用，正好是抗MMS Ⅲ损伤神经元的机制。实际上有关川芎嗪与神经系统的研究远远多于大黄素，它能兴奋神经β一肾上腺受体，抑制自发运动，阻止Ca2+内流等，但这些作用与MMS损伤神经元的机制一致或无关。因此，川芎嗪没有表现保护作用。我们考虑川芎嗪在临床上改善尿毒症脑病症状的机理是通过前面所述的抑制血小板聚集，降低血浆粘度及血浆脂质过氧化物等机制，待以后的实验进一步证实。
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参 考 文 献
1.张文龙.中医辨证治疗慢性肾功能衰竭近况.中医杂志，1991，32(3)：182
2.黎磊石.大黄延缓慢性肾衰的临床及实验研究.中西医结合杂志，1991，11(6)∶392
3.刘众等.川芎对急性实验性脑缺血大白兔血浆中β-TG、PF4及TXB2、6-酮-PGF1α含量的影响.中西医结合杂志，1990，10(8)∶543
4.刘众等.川芎对急性实验性脑缺血大白兔血浆和脑脊液中强啡呔A1-13含量的影响.中西医结合杂志，1990，10(3)∶160
5.夏正远等.川芎嗪注射液对家兔失血性休克再灌注损伤的防治作用.中国中西医结合杂志，1992，12(4)∶543
6.王智松.我国大黄临床研究概况和大黄素的药理作用.实用中西医结合杂志，1989，2(5)∶16
湖北省教委资助科研课题
作者简介：马琼英，女，1946年生，副主任医师。武钢一医院肾内科
收稿日期：1999-01-25, http://www.100md.com
单位：马琼英 高 鸣 王小琴 何 萍 湖北中医学院附属医院肾内科 430061； 张建军 晏雪生 湖北中医学院脏象研究所
关键词：大黄素；川芎嗪；@中分子物质；尿毒症；并发症；脑病
湖北中医学院学报/990123 摘要 目的 研究大黄素、川芎嗪对中分子物质引起大脑皮层神经元损伤的保护作用。方法 在人胚大脑皮层神经元培养体系中，加入不同浓度的大黄素、川芎嗪及主要中分子物质损伤组份(MMSⅢ)进行四唑嗅蓝(MTT)快速自动微显比色分析测A值及自动速率法测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量实验。结果 ①10μg/ml浓度的大黄素、川芎嗪加入体外培养的人胚大脑皮层神经元后，A值与LDH漏出量均与对照组无显著性差异，此浓度对神经元无损伤作用。②10μg/ml浓度的大黄素与MMSⅢ共同加入体外培养的人胚大脑皮层神经元，A值与LDH漏出量均与损伤对照组有显著差异，川芎嗪则无显著差异。 结论 大黄素对大脑皮层神经元有免受MMSⅢ损伤而具保护作用，川芎嗪则无保护作用。
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中国图书分类号 R285.6
Experimental Study of Influence of Emodin and Tetramethy Lpyragine on Human Embryonic Cerebral Cortex Neuron Damaged by MMS
Ma Qiongying,Gao Ming,Wang Xiaoqin,et al.
Department of Nephrology,Hubei.Traditional Chinese Medicine Hospital,Wuhan 430061.
Abstract: To study the effect of emodin and tetramethy lpyragine on protecting human embryonic cerebral cortex neuron from being damaged by MMS.Methods: we add the emodin,tetramethy lpyragine of different concentrations and MMS Ⅲ to the cerebral cortex neuron.The A value and leak amount of LDH were detected by the rapid automated colorimetric microassay(MTT)and automatic rate method.Results: ①Emodin and tetramethy lpyragine of 10ug/ml density were added to human embryonic cerebral cortex neuron.The A and LDH value had no difference with that of control group.This density can not damage neuron.②Emodia of 10ug/ml density and MMS Ⅲwere added to human embryonic cerebral cortex neuron.The A、LDH value were distinctly different from that of MMS Ⅲgroup.But tetramethy lpyragine had no difference.Conclusion: Emodin can protect the human embryonic cerebral cortex neuron from injured by MMS Ⅲ. But tetramethy lpyragine has not this kind of function.
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Key words: Emodin Tetramethy lpyragine @Middle molecular substance Uremia Complication Encephalopathy
大量临床及实验研究证明尿毒症脑病与中分子物质(Middle Molecular Substance MMS)相关。我们研究发现，从尿毒症患者血液透析超滤液中提取并分离的中分子物质组分Ⅲ(MMSⅢ1090-1800dal)对体外培养的大脑皮层神经元有损伤作用。大黄素、川芎嗪是治疗尿毒症及其并发症中药大黄、川芎的主要药物成分，本实验首先观察大黄素、川芎嗪对体外培养的大脑皮层神经元的影响，其次研究大黄素、川芎嗪对MMSⅢ参加的体外培养的大脑皮层神经元的作用，以寻求尿毒症脑病的有效治疗方法(或药物)。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 自制的并由相差显微镜、尼氏体染色证实的相对单一的人胚大脑皮层神经元培养体系(方法略)。
1.1.2 仪器及试剂：聚乙烯读数板，EP管，ELISA自动分析仪、752-紫外分光光度计(上海仪器分析厂)，全自动生化分析仪(日本Olympus公司)，按马琼英方法制备且已被证实对大脑皮层
神经元有损伤作用的MMS Ⅲ(1090～1800dal)，大黄素、川芎嗪(中国药品检定所)，1.5mg/ml MTT溶液(用MEM培养液配制)，0.08mol/ml盐酸-异丙醇溶液，LDH试剂盒(北京中生生物工程公司)。
1.2 方法
1.2.1 第一部分
(1)分组 培养3天或7天的神经元，分以下四组，对照组：加等量MEM培养液；大黄素组、川芎嗪组、大黄素加川芎嗪组：加10μg/ml、40μg/ml、160μg/ml的大黄素、川芎嗪、大黄素加川芎嗪。每药物每一浓度各分为二组分别用于测A值与LDH值，各孔培养条件相同。
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(2)加药方法 MTT试验：培养3天的人胚大脑皮层神经元，按以上分组方法加入不同浓度的不同物质，培养20小时后，每孔加20μlMTT液，继续培养。4小时后，培养孔内产生蓝色沉淀，用吸管反复吹打，使蓝色产物充分溶解，吸取上清液，置于96孔读数板上，用ELISA自动分析仪测吸光度(A值)。LDH漏出值测定：培养7天的神经元，按以上分组方式加药，24小时后，吸出培养液置于不同编号的EP管中，按LDH试剂盒上方法，将样品和试剂安装至全自动生化分析仪上，用速率法测培养液中LDH值。反应体积比为样品：试剂=1∶50。
1.2.2 第二部分
(1)分组 培养3天或7天的神经元，分以下五组，正常对照组：加等量MEM培养液，损伤对照组加MMS Ⅲ(50μl/ml)，大黄素、川芎嗪、大黄素加川芎嗪保护组加MMS Ⅲ(50μl/ml)大黄素、川芎嗪、大黄素加川芎嗪(均10μg/ml)。
(2)加药方法 MTT实验，LDH漏出量测定实验加药方法、测定方法均与前相同。
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(3)统计方法 每实验组均为6个样品，求其均值，实验数据用
±S表示。对数据进行F及q检验。2 结果
2.1 第一部分
2.1.1 MTT实验将10μg/ml、40μg/ml、160μg/ml浓度下测得A值经方差分析，结果显示P10<0.01、P40<0.01、0.01
表1 不同浓度川芎嗪、大黄素对大脑皮层神经元A值的影响(
-+SD), 百拇医药
对照组
川芎嗪
大黄素
大黄素+川芎嗪
P值
10μg/ml
0.62±0.016
0.64±0.0158
0.68±0.0149
0.82±0.01329※※
<0.01
40μg/ml
, 百拇医药
0.72±0.0294△
0.82±0.0193
0.85±0.0315※△
0.89±0.0708※
<0.01
160μg/ml
0.83±0.0708△
0.89±0.0338
0.96±0.0414※△
1.16±0.0505※
0.01
与对照组比较 ：※0.01
2.1.2 LDH漏出量测定实验 将三种浓度下测得LDH漏出量经方差分析，结果显示P10>0.05、P40>0.05各组间无差异，P160<0.01各组间有显著差异。q检验大黄素、川芎嗪与对照组比较有明显差异，大黄素加川芎嗪组与对照组有显著差异。大黄素、川芎嗪与大黄素加川芎嗪组有显著差异。(表2)
表2 不同浓度大黄素、川芎嗪对大脑皮层神经元LDH漏出量的影响(
+SD)对照组
川芎嗪
, 百拇医药 大黄素
大黄素+川芎嗪
P值
10μg/ml
34.8±0.58
37.2±1.59
95.6±0.98
38.6±1.07
>0.05
40μg/ml
36.0±0.71
37.2±0.86
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37.8±0.71
40.8±1.11
>0.05
160μg/ml
42.8±1.39
54.6±1.33※△△
52.0±1.52※△△
72.2±3.22※※
<0.01
与对照组比较：※0.01
2.2 第二部分
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2.2.1 MTT实验 测得A值经方差分析，P<0.01，继续进行q检验，大黄素保护组与MMS Ⅲ损伤组有显著差异，与正常组无明显差异。大黄素加川芎嗪保护组与MMS Ⅲ损伤组有明显差异，与正常组有差异。川芎嗪与损伤组无显著差异，与正常组有显著差异。(表3)
表3 10μg/ml大黄素、川芎嗪对MMS Ⅲ损伤大脑皮层神经元的保护作用(A值)(
-+SD) 正常对照组大黄素
大黄素加川芎嗪
川芎嗪
损伤对照组
0.38±0.034△△
, 百拇医药
0.44±0.0326△△
0.62±0.0269※※△
0.70±0.0262※※
0.83±0.0412※※
与正常相比较：※※P<0.01 与损伤对照组比较：△0.01
2.2.2 LDH漏出量测定 各损伤组内两两比较显示，大黄素保护组、大黄素加川芎嗪保护组与损伤对照组有显著差异，说明这两组对神经元有保护作用，大黄素保护组与大黄素加川芎嗪保护组比较无明显差异，即二组保护作用相似，各组与正常组对照大黄素保护组与之无明显差异，其余各组均与之有明显差异，可见大黄素较大黄素加川芎嗪组的保护作用强，川芎嗪组对MMS Ⅲ损伤成熟期神经元有明显保护作用。(表4)
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表4 大黄素、川芎嗪对MMS Ⅲ损伤成熟期的神经元的保护作用(LDH漏出量值)(X-±SD) MMSⅢ损伤组
川芎嗪
大黄素加川芎嗪
大黄素
正常对照组
48.33±1.58※※
46.33±1.73※※
39.67±1.74△△※※
36.83±1.35△△
33.25±0.96△△
与正常组对照：※※P<0.01 与损伤组对照：△△P<0.01
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从上述结果看出：①10μg/ml大黄素、川芎嗪对体外培养的大脑皮层神经元无损伤作用。②大黄素对神经元有损伤作用的MMS Ⅲ有拮抗作用，而起到保护神经元的作用。
3 讨论
3.1 关于实验
3.1.1 中分子物质提取和制备以及人胚大脑皮层神经元培养技术已在本课题系列实验的前面部分完成，且中分子物质制备技术已获得鉴定，在此不再论述。
3.1.2 MTT法是检测各种因子或药物作用下细胞活性的良好方法，MTT的化学本质为3-(4，5二甲基噻唑-2-YLD)-2，5-二甲基一四唑溴蓝，是显示线粒体脱氢酶的试剂。该实验反应原理：MTT在琥珀酸脱氢酶的还原作用下，在细胞内形成不溶性的蓝色沉淀物-甲颗粒。蓝色产物的多少与细胞生存数量和活力呈线性正相关，蓝色产物溶于HCL-异丙醇或二甲亚砜，在570nm下有较强的吸收，A值与蓝色产物呈负相关。因此，A值与细胞活力和数量呈负相关关系。速率法测LDH量是用自动生化分析仪自动测量预处理好的溶液内LDH含量的方法，其反应原理：L-乳酸+NAD+
丙酮酸+NADH+H+。NADH在340nm波长有最大的吸收。在碱性条件下，反应向右进行，NAD+还原成NADH的速率与LDH的活力成正比，在340nm下，测NADH上和升速率，即吸光度增加的速度，就可测出LDH活力。当细胞膜受损时，该酶从细胞中释放出来，使培养液内LDH量增加。因此，LDH漏出量的测定可作为反映细胞膜受损，细胞活力下降的指标。, 百拇医药
3.2 中医对尿毒症脑病和中分子物质的认识
尿毒症脑病病情危重，临床表现复杂，在祖国医籍中未有专门论述，但根据其发病、症状、演变规律，类似中医学中的“关格”、“肾劳”、“癃闭”、“溺毒”、“肾风”等病。其病因认识概括有如下四方面：①外邪侵袭、元气亏虚；②思虑过度、房室不节；③素有脾肾亏损、复感外邪；④饮食不节、七情内伤[1]。其病位涉及心、肝、肺、肾诸脏。其病机不外乎脾肾衰竭为本，湿浊邪毒蒙蔽清窍为标。肾与脑通过物质、功能，经络密切相关，故肾病可以影响到脑。随病情发展，或阴损及阳，或阳损及阴，致阴阳俱损、气血两亏、脾肾衰微、升降失常，成痰生瘀，化热动风，上扰清窍。表现为头痛、头昏、抽搐、癫狂厥症，与现代医学中的“尿毒症脑病”类似。其病理因素之湿浊邪毒，包括现代医学中的“中分子物质、小分子物质(肌酐、尿素氮)”等。中医对MMS的专门研究很少，有人研究过，MMS与“上火”、“痰症”、“苔黄”及慢性肾炎的不同证型有关，并且已见到中药降低MMS水平的临床探讨。
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3.3 大黄素、川芎嗪与尿毒症脑病
目前认为大黄素有防止慢性肾功能衰竭进展及其并发症的作用。大黄素是大黄的主要药物成分，有人已经分别从临床、体外细胞培养及动物实验方面进行了深入研究。①临床研究：短期疗效包括降低BUN水平和BUN/Scr的比值，改善尿毒症症状，长期的随访研究显示，慢性肾功衰的进展被控制而营养状态和生活质量得到改善。②细胞培养：大黄素可抑制肾小球系膜、肾小管上皮细胞生长，抑制系膜细胞纤维连接蛋白的产生，从而减少了基质的产生，抑制肾小管系膜细胞c-myc原癌基因的过度表达，及抑制系膜细胞增殖核抗原的表达，其S-期细胞数明显减少，抑制巨噬细胞核细胞产生多种细胞因子的作用。③动物实验：大黄能够降低实验动物的BUN和Scr水平，减少尿蛋白的排泄，保护肾功能，改善脂质紊乱，降低残余肾组织的耗氧量以及抑制其肾单位的肥大[2]。
另一味中药川芎亦受到重视，川芎嗪是其主要化学成分之一。味辛、微苦，性温，有活血化瘀、理气止痛作用。其药理作用包括：通过调节循环中TXA2/PGI2平衡而有效的抑制组织缺血时血小板聚集与激活[3]，可使血和脑脊液中DynA1-3合成与释放减少，改善神经系统障碍[4]，可降低全血和血浆粘度及红细胞压积，减少血浆纤维蛋白的产生，可降低血浆脂质过氧化物，血SOD等[5]。
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3.4 机制探讨
通过对大黄素、川芎嗪的研究，我们发现大黄素能够保护神经元免受MMS Ⅲ损伤。由于以上探讨的MMS Ⅲ损伤神经元的机制大多不可逆，因此，我们推测大黄素的这种保护机制有可能是直接作用于MMS Ⅲ，降解MMS Ⅲ或者与MMS Ⅲ结合，从而破坏MMS Ⅲ的活性。另一方面，大黄素对神经元病理改变的条件下表现出的作用，刚好与MMS Ⅲ的损伤神经元机制相反。另有资料可间接阐明这种保护机制，如大黄能调节cAMP/cGMP比值，使之趋于正常，能够调节脂质过氧化功能，调节线粒体电子传递系统[6]。由于大黄素是一种双向调节药物，可能在上述三种调节功能所发挥的作用，正好是抗MMS Ⅲ损伤神经元的机制。实际上有关川芎嗪与神经系统的研究远远多于大黄素，它能兴奋神经β一肾上腺受体，抑制自发运动，阻止Ca2+内流等，但这些作用与MMS损伤神经元的机制一致或无关。因此，川芎嗪没有表现保护作用。我们考虑川芎嗪在临床上改善尿毒症脑病症状的机理是通过前面所述的抑制血小板聚集，降低血浆粘度及血浆脂质过氧化物等机制，待以后的实验进一步证实。
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参 考 文 献
1.张文龙.中医辨证治疗慢性肾功能衰竭近况.中医杂志，1991，32(3)：182
2.黎磊石.大黄延缓慢性肾衰的临床及实验研究.中西医结合杂志，1991，11(6)∶392
3.刘众等.川芎对急性实验性脑缺血大白兔血浆中β-TG、PF4及TXB2、6-酮-PGF1α含量的影响.中西医结合杂志，1990，10(8)∶543
4.刘众等.川芎对急性实验性脑缺血大白兔血浆和脑脊液中强啡呔A1-13含量的影响.中西医结合杂志，1990，10(3)∶160
5.夏正远等.川芎嗪注射液对家兔失血性休克再灌注损伤的防治作用.中国中西医结合杂志，1992，12(4)∶543
6.王智松.我国大黄临床研究概况和大黄素的药理作用.实用中西医结合杂志，1989，2(5)∶16
湖北省教委资助科研课题
作者简介：马琼英，女，1946年生，副主任医师。武钢一医院肾内科
收稿日期：1999-01-25, http://www.100md.com