病理性瘢痕成纤维细胞的增殖调控及Fas基因突变的筛选
作者：鲁峰 高建华 黎小间
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院整形外科
关键词：病理性瘢痕；p53；Fas；基因突变
中华医学杂志000925 【摘要】 目的 从细胞生物学及基因水平探讨正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩周边部和中央部不同生长特性及瘢痕疙瘩发生的可能机制。方法 (1) 取手术切除的正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例为标本，通过细胞培养6～10代后，应用流式细胞仪、粘附式细胞仪检测不同来源的成纤维细胞p53蛋白的表达和细胞周期的分布。(2) 取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本，聚合酶链式反应(PCR)特异性扩增Fas分子外显子9的编码区，扩增产物经银染SSCP(单链构象多态性检测)筛选，最后可疑阳性的PCR样本进行DNA测序。结果 (1) 正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期(G0、G1期)且p53蛋白的表达最高；增生性瘢痕成纤维细胞p53蛋白的表达最低，大量细胞处于增殖状态(G2期、S期和M期)；瘢痕疙瘩周边部较中央部，成纤维细胞大量分布于增殖期，p53蛋白表达也较低；(2) 经PCR-SSCP检测，20%(2/10)的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，经DNA测序证实这两例突变均为位于Fas cDNA的755 bp处的“A”缺失而导致的移码突变。结论 (1) 成纤维细胞细胞周期的分布及p53蛋白表达的差异可能是导致正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中央部及周边部呈现不同生长特性的细胞生物学机理之一。(2) 编码Fas分子死亡域结构基因的移码突变可能导致Fas受体功能丧失，从而导致成纤维细胞的凋亡异常。
, 百拇医药
The distrubution of cell cycle on fibrolasts derived from the pathlogical scars and analysis of Fas gene mutations in keloids using polymerse chain Reaction-based single-strand conformation polymorphism
LU Feng
(Department of Plastic Surgery, Nanfang Hospital of the First Military Medical University. Guangzhou 510515, China)
GAO jianhua
(Department of Plastic Surgery, Nanfang Hospital of the First Military Medical University. Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
LI Xiaojian.
(Department of Plastic Surgery, Nanfang Hospital of the First Military Medical University. Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To explore the concrete mechanism which accounts for the different growth characteristics of normal skins and pathlogical scars and to identify if the mutations of Fas gene exist. Methods Six samples of normal skin, hypertrophic scars and keloids were collected. The means of cell culture was used, and only 6-10 passages fibroblasts were selected for experiment. The distribution of cell cycle and expression of protein p53 were analysed with flow cytometry, adherant cell analysis and sorting interactive laser coytometry (ACAS 570). Keloids and hypertrophic scar tissue and the peripheral blood of each patient were collected. After DNA was isolated from the samples, we used the single-stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis and DNA sequencing to examine the structure of Fas gene. Results The expression of p53 protein on the fibroblasts derived from normal skin was significantly elevated in comparison to the hypertrophic scars with lowest propagative fibroblasts. A large percent of fibroblasts derived from the peripherial areas of keloids distributed in G2, S and M periods with low levels of p53 protein. On the other hand, fibroblasts derived from the central areas of keloids distributed mostly in G0 and G1 periods with higher expression of p53 protein. Mutation in Fas gene was identified and confirmed in keloid tissue of 20% (2/10) of keloid patient, which may cause loss of function and contribute to the pathogenesis of keloid. A deletion of the nucleotide “A” at the same position was found, which caused a frameshift mutation in exon 9. Conclusion The difference of the distributions of cell cycle and expression of protein p53 may account for the different growth characteristics in pathlogical scar and normal skin. Mutations in Fas gene may lead to abnormal apoptosis of fibroblasts in keloids, and may contribute to the pathogenesis and progression of keloids.
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【Key words】 Pathogical Scar； p53； Fas； Gene mutation
瘢痕增生是组织创伤后的异常修复。过度增殖的成纤维细胞和沉积的胶原导致局部瘢痕组织明显增生，瘢痕疙瘩甚至呈现出“蟹足样”的浸润生长[1]。临床观察还发现：瘢痕疙瘩的不同部位具有不同的生长特性：周边部表现出较强的增殖能力，局部隆起明显；中央部变平，色泽较淡且增生不明显。据此，有学者[2]将瘢痕疙瘩分为浸润部、增生部和老化部。导致病理性瘢痕成纤维细胞过度增生的主要原因可能是增殖-凋亡调控的失衡。那么，这种异常的增殖-凋亡又是由哪些基因来调控的呢?目前仍缺乏这方面的研究。我们试图通过分析不同来源成纤维细胞的细胞周期分布及主要周期调控基因p53的表达，旨在从增殖调控水平初步探讨导致病理性瘢痕形成的细胞生物学机理。
并通过对编码瘢痕疙瘩成纤维细胞“死亡域”的基因结构的研究来探讨导致这种无功能Fas分子的可能机制。
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对象和方法
一、对象
1.本实验所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方医院整形外科手术患者，均经临床及病理诊断证实。瘢痕疙瘩患者10例，男女各半，病变部位分别为耳垂及前胸；直视下区分中央部和周边部，瘢痕组织中央部分较平且色淡的区域为中央部，周围明显隆起呈暗红色区域为周边区(包括浸润部和增生部)[2]。增生性瘢痕患者12例，男8例，女4例，病变部位分别位于足背和肘部；患者年龄界于22-28岁间；同时以正常皮肤及自愿者外周血为正常对照。
2.DMEM培养基：美国Gibco公司产品，p53单克隆抗体为美国santa cruze公司产品，胎牛血清为美国Hyclone公司产品，碘化丙啶(propidium odide，PI)荧光染料为美国Sigma公司产品。
3.引物设计(由上海生工合成)。
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Fas Exon 9 (bp 697-bp 1012)[3]Forward: 5′ATC ACC ACT ATT GCT GGA GTC 3′Reverse:5′CAC TCT AGA CCA AGA TTT GGA 3′。
二、方法
1.成纤维细胞的培养：将手术切下的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1 mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95%空气，5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下培养6～8 h，使组织块牢固地粘附在瓶壁上，然后加入含15%胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s modified minimal essential medium，美国GIBCO生产)培养基适量，继续培养，3～4 d换液1次，2～3周后，原代细胞生长成单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例传代培养，此后每2～3 d换液1次，每4～5 d分种传代1次，实验用第6～10代细胞。
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2.外周血DNA的提取、新鲜组织中DNA的提取及PCR扩增及电泳检测、SSCP分析参见文献[4]。
3.流式细胞仪检测病理性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞细胞周期的分布参见文献[5]。
4.流式细胞仪检测病理性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞内p53蛋白的表达参见文献[5]。
5.粘附式细胞仪检测病理性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞内p53蛋白的表达参见文献[5]。
6.统计学分析：所得数据用均数±标准差表示，统计处理应用SPSS软件，采用方差分析检验进行比较分析。
结果
1.流式细胞仪细胞周期分析：正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期(G0、G1期)，处于增殖期的细胞占细胞总数的28%；增生性瘢痕成纤维细胞多数细胞处于增殖状态(G2期、S期和M期)，处于增殖期的细胞占细胞总数的70%；瘢痕疙瘩周边部成纤维细胞大量分布于G2期、S期和M期，约占细胞总数60%；而瘢痕疙瘩中央部成纤维细胞主要分布在G1、G0期，处于增殖期的细胞占细胞总数的34%。从周期分布的规律我们可以看出正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中央部和周边部成纤维细胞的增殖能力和生长状况是有差别的(表1)。
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表1 瘢痕疙瘩不同部位细胞周期的分布及
p53蛋白的表达(
±s) 部 位
增殖期细胞
百分率(%)
(G2+S+M)
p53蛋白的阳性
表达率(%)
(流式细胞仪)
p53蛋白的阳性
表达强度(荧光值)
(粘附式细胞仪)
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正常皮肤
28.0±2.4
70.6±8.4
2 168±421
增生性瘢痕
70.6±5.2
17.2±2.4
926±124
瘢痕疙瘩中央部
34.0±6.2
58.9±6.2
1 960±348
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瘢痕疙瘩周边部
60.6±4.5
26.4±2.8
1 230±244
2.正常皮肤成纤维细胞p53蛋白的阳性表达率最高(70%)，增生性瘢痕成纤维细胞的阳性表达率最低(仅为17%)；瘢痕疙瘩中央部较周边部，其成纤维细胞p53蛋白阳性表达率较高，各组间差异有显著意义(P<0.01)(表1)。
3.粘附式细胞仪实验结果与流式细胞仪检测结果吻合，即正常皮肤及瘢痕疙瘩中央部单个成纤维细胞p53蛋白阳性强度较高，而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩周边部单个成纤维细胞的p53蛋白阳性强度较低。见表1。可见，正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中央部和周边部成纤维细胞的增殖能力和生长状况的差别可能是由不同表达强度的p53基因调控的结果。
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4.琼脂糖凝胶电泳分析：所有样品DNA经PCR扩增后，均可以得到相应大小片段的目的DNA。在EB的作用下，紫外灯下可见PCR扩增出来的相应DNA片段大小(316 bp)的荧光带，即为待检产物见图1。
M：DNA标准品；2～4：分别为正常人，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩患者的外周血标本；5～7(8～10)：分别为正常人，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩患者的组织标本结果显示PCR扩增出来的产物含316 bp(bp 697 to bp 1 012)[3]，琼脂糖电泳未见异常电泳带
图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析
5.SSCP分析：PCR扩增出来的产物经变性后变成单链，经SSCP凝胶电泳后，如果出现单链带的异常，即认为该样本的Fas基因存在突变见图2。
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1～3：分别为瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者，正常人的组织标本；4～6：分别为瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者，正常人的外周血标本；结果显示：SSCP分析可见仅在瘢痕疙瘩组织标本中存在异常电泳带，异常的电泳带图中用“↑”表示
图2 PCR产物(Fas分子的exon 9)的SSCP分析
经PCR-SSCP检测，20%(2/10)的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，在瘢痕疙瘩组中的外周血标本中未见异常。在正常皮肤对照组及增生性瘢痕组中，无论是在组织标本还是在外周血标本中均未见Fas基因突变的存在。
6.DNA序列分析：两例可疑突变的PCR样本经纯化后测序，DNA测序证实两例突变均为位于Fas cDNA 755 bp处的“A”缺失而导致的移码突变。
讨论
细胞周期的分布可以直观地反应细胞群体的增殖状况，因此我们选择细胞周期作为观测指标对不同部位成纤维细胞增殖能力进行分析。增殖期细胞内存在活跃的DNA的合成，因此胞内DNA含量大于两倍体细胞。此类细胞群包括G2期、S期和M期细胞。非增殖期细胞一般处于G1、G0期，因胞内DNA未复制，因此为典型的两倍体细胞群。因此，应用PI染料标记细胞内DNA后，流式细胞仪可对每个细胞内的DNA进行记录分析。结果经过统计后，可以见到两倍体的G1峰、四倍体的G2峰及两者间的S期细胞。经过电脑分析就可以了解一个细胞群体中增殖期及静止期细胞的百分率。
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本实验研究表明，正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期；增生性瘢痕成纤维细胞多数处于增殖状态；瘢痕疙瘩周边部成纤维细胞大量分布于G2期、S期和M期，约占细胞总数的65%；而瘢痕疙瘩中央部成纤维细胞主要分布在G1、G0期，处于增殖期的细胞占细胞总数的34%。从周期分布的规律我们可以看出正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中央部和周边部成纤维细胞的增殖能力和生长状况是有差别的。
p53基因是参与细胞增殖调节的重要基因之一，在凋亡调控过程中也起着重要作用，它包括野生型和突变型两种不同的存在形式[6，7]。关于p53蛋白在调控细胞增殖机理方面的研究证实[8，9]：p53蛋白能阻断细胞从G1进入S期，使细胞停滞在G1期，从而抑制细胞的增殖过程。当p53蛋白含量减少或基因突变后，细胞可大量进入S期，分裂增殖加剧，从而导致增殖-凋亡的失衡。
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本实验研究发现，正常皮肤及瘢痕疙瘩中央部单个成纤维细胞p53蛋白阳性强度较高，而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩周边部单个成纤维细胞的p53蛋白阳性强度较低。此结果与细胞周期分布结果吻合，说明在瘢痕疙瘩形成过程中，p53蛋白的调控是细胞增殖调控最重要的方式之一。p53蛋白表达的减少，导致细胞大量进入增殖期，导致细胞增殖-凋亡的失衡。
有研究发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞在自然状况下不易凋亡[10]，而Fas介导的死亡信号传递还被认为是介导病理性瘢痕成纤维细胞凋亡的最主要通道[11]。因此，我们的实验研究发现：瘢痕疙瘩成纤维细胞虽然有高表达的Fas受体但在FasMcab作用下不能正常凋亡，同时通过研究其Fas介导的死亡信号传递。据此，我们认为瘢痕疙瘩成纤维细胞的Fas受体可能处于无功能状态。
导致这种无功能状态的Fas分子的机制可能是因为其蛋白编码区基因结构的改变。Fas基因组由8个内含子和9个外显子组成[12]。外显子9编码胞内“死亡域”，它的基因突变也是Fas基因突变的最常见部位[8]。编码“死亡域”的基因突变将直接影响“死亡信号诱导复合物”的形成从而阻断细胞的凋亡；因此，我们试图应用PCR/SSCP研究Fas分子的“死亡域”基因结构。
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本实验结果发现，20%(2/10)的瘢痕疙瘩组织在SSCP分析中出现异常电泳带，提示瘢痕疙瘩组织中可能存在Fas分子死亡域基因结构的改变。两例可疑突变的PCR样本经纯化后测序，DNA测序证实这两例突变均为位于Fas cDNA的755 bp处的“A”缺失而导致的移码突变。增生性瘢痕、正常皮肤及所有样本的外周血标本均未发现异常。
Fas分子死亡域的移码突变将导致其下游氨基酸序列的完全改变，将可能导致Fas分子的功能缺失。Fas分子的功能障碍也将阻断成纤维细胞的凋亡，导致成纤维细胞的增殖-凋亡失衡，从而出现病变部位成纤维细胞的聚集，最终诱发瘢痕疙瘩的形成。
有关p53蛋白在病理性瘢痕形成过程中参与增殖调控的具体模式如何?病理性瘢痕形成过程中还有哪些基因参与了它的增殖调控?本研究从基因水平初步揭示了瘢痕疙瘩发生的机理，进一步的研究需要进一步探讨瘢痕疙瘩的发生与Fas分子基因结构改变之间的联系。研究的进一步深入必将有助于我们从一个新的角度来认识病理性瘢痕成纤维细胞增殖-凋亡失衡的机制。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870807)
参考文献
1，汪良能，高学书.整形外科学.北京：人民卫生出版社，1989.324-332.
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4，卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术，北京：高等教育出版社，1993.
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11，Peters AM, Kohfink B, Martin H, et al. Defective apoptosis due to a point mutation in the death domain of CD95 associated with autoimmune lymphoproliferative syndrome, T-cell lymphoma, and Hodgkin′s disease. Exp Hematol, 1999, 27:868-874.
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(收稿日期：1999-09-16), 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院整形外科
关键词：病理性瘢痕；p53；Fas；基因突变
中华医学杂志000925 【摘要】 目的 从细胞生物学及基因水平探讨正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩周边部和中央部不同生长特性及瘢痕疙瘩发生的可能机制。方法 (1) 取手术切除的正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例为标本，通过细胞培养6～10代后，应用流式细胞仪、粘附式细胞仪检测不同来源的成纤维细胞p53蛋白的表达和细胞周期的分布。(2) 取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本，聚合酶链式反应(PCR)特异性扩增Fas分子外显子9的编码区，扩增产物经银染SSCP(单链构象多态性检测)筛选，最后可疑阳性的PCR样本进行DNA测序。结果 (1) 正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期(G0、G1期)且p53蛋白的表达最高；增生性瘢痕成纤维细胞p53蛋白的表达最低，大量细胞处于增殖状态(G2期、S期和M期)；瘢痕疙瘩周边部较中央部，成纤维细胞大量分布于增殖期，p53蛋白表达也较低；(2) 经PCR-SSCP检测，20%(2/10)的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，经DNA测序证实这两例突变均为位于Fas cDNA的755 bp处的“A”缺失而导致的移码突变。结论 (1) 成纤维细胞细胞周期的分布及p53蛋白表达的差异可能是导致正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中央部及周边部呈现不同生长特性的细胞生物学机理之一。(2) 编码Fas分子死亡域结构基因的移码突变可能导致Fas受体功能丧失，从而导致成纤维细胞的凋亡异常。
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The distrubution of cell cycle on fibrolasts derived from the pathlogical scars and analysis of Fas gene mutations in keloids using polymerse chain Reaction-based single-strand conformation polymorphism
LU Feng
(Department of Plastic Surgery, Nanfang Hospital of the First Military Medical University. Guangzhou 510515, China)
GAO jianhua
(Department of Plastic Surgery, Nanfang Hospital of the First Military Medical University. Guangzhou 510515, China)
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LI Xiaojian.
(Department of Plastic Surgery, Nanfang Hospital of the First Military Medical University. Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To explore the concrete mechanism which accounts for the different growth characteristics of normal skins and pathlogical scars and to identify if the mutations of Fas gene exist. Methods Six samples of normal skin, hypertrophic scars and keloids were collected. The means of cell culture was used, and only 6-10 passages fibroblasts were selected for experiment. The distribution of cell cycle and expression of protein p53 were analysed with flow cytometry, adherant cell analysis and sorting interactive laser coytometry (ACAS 570). Keloids and hypertrophic scar tissue and the peripheral blood of each patient were collected. After DNA was isolated from the samples, we used the single-stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis and DNA sequencing to examine the structure of Fas gene. Results The expression of p53 protein on the fibroblasts derived from normal skin was significantly elevated in comparison to the hypertrophic scars with lowest propagative fibroblasts. A large percent of fibroblasts derived from the peripherial areas of keloids distributed in G2, S and M periods with low levels of p53 protein. On the other hand, fibroblasts derived from the central areas of keloids distributed mostly in G0 and G1 periods with higher expression of p53 protein. Mutation in Fas gene was identified and confirmed in keloid tissue of 20% (2/10) of keloid patient, which may cause loss of function and contribute to the pathogenesis of keloid. A deletion of the nucleotide “A” at the same position was found, which caused a frameshift mutation in exon 9. Conclusion The difference of the distributions of cell cycle and expression of protein p53 may account for the different growth characteristics in pathlogical scar and normal skin. Mutations in Fas gene may lead to abnormal apoptosis of fibroblasts in keloids, and may contribute to the pathogenesis and progression of keloids.
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【Key words】 Pathogical Scar； p53； Fas； Gene mutation
瘢痕增生是组织创伤后的异常修复。过度增殖的成纤维细胞和沉积的胶原导致局部瘢痕组织明显增生，瘢痕疙瘩甚至呈现出“蟹足样”的浸润生长[1]。临床观察还发现：瘢痕疙瘩的不同部位具有不同的生长特性：周边部表现出较强的增殖能力，局部隆起明显；中央部变平，色泽较淡且增生不明显。据此，有学者[2]将瘢痕疙瘩分为浸润部、增生部和老化部。导致病理性瘢痕成纤维细胞过度增生的主要原因可能是增殖-凋亡调控的失衡。那么，这种异常的增殖-凋亡又是由哪些基因来调控的呢?目前仍缺乏这方面的研究。我们试图通过分析不同来源成纤维细胞的细胞周期分布及主要周期调控基因p53的表达，旨在从增殖调控水平初步探讨导致病理性瘢痕形成的细胞生物学机理。
并通过对编码瘢痕疙瘩成纤维细胞“死亡域”的基因结构的研究来探讨导致这种无功能Fas分子的可能机制。
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对象和方法
一、对象
1.本实验所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方医院整形外科手术患者，均经临床及病理诊断证实。瘢痕疙瘩患者10例，男女各半，病变部位分别为耳垂及前胸；直视下区分中央部和周边部，瘢痕组织中央部分较平且色淡的区域为中央部，周围明显隆起呈暗红色区域为周边区(包括浸润部和增生部)[2]。增生性瘢痕患者12例，男8例，女4例，病变部位分别位于足背和肘部；患者年龄界于22-28岁间；同时以正常皮肤及自愿者外周血为正常对照。
2.DMEM培养基：美国Gibco公司产品，p53单克隆抗体为美国santa cruze公司产品，胎牛血清为美国Hyclone公司产品，碘化丙啶(propidium odide，PI)荧光染料为美国Sigma公司产品。
3.引物设计(由上海生工合成)。
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Fas Exon 9 (bp 697-bp 1012)[3]Forward: 5′ATC ACC ACT ATT GCT GGA GTC 3′Reverse:5′CAC TCT AGA CCA AGA TTT GGA 3′。
二、方法
1.成纤维细胞的培养：将手术切下的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1 mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95%空气，5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下培养6～8 h，使组织块牢固地粘附在瓶壁上，然后加入含15%胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s modified minimal essential medium，美国GIBCO生产)培养基适量，继续培养，3～4 d换液1次，2～3周后，原代细胞生长成单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例传代培养，此后每2～3 d换液1次，每4～5 d分种传代1次，实验用第6～10代细胞。
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2.外周血DNA的提取、新鲜组织中DNA的提取及PCR扩增及电泳检测、SSCP分析参见文献[4]。
3.流式细胞仪检测病理性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞细胞周期的分布参见文献[5]。
4.流式细胞仪检测病理性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞内p53蛋白的表达参见文献[5]。
5.粘附式细胞仪检测病理性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞内p53蛋白的表达参见文献[5]。
6.统计学分析：所得数据用均数±标准差表示，统计处理应用SPSS软件，采用方差分析检验进行比较分析。
结果
1.流式细胞仪细胞周期分析：正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期(G0、G1期)，处于增殖期的细胞占细胞总数的28%；增生性瘢痕成纤维细胞多数细胞处于增殖状态(G2期、S期和M期)，处于增殖期的细胞占细胞总数的70%；瘢痕疙瘩周边部成纤维细胞大量分布于G2期、S期和M期，约占细胞总数60%；而瘢痕疙瘩中央部成纤维细胞主要分布在G1、G0期，处于增殖期的细胞占细胞总数的34%。从周期分布的规律我们可以看出正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中央部和周边部成纤维细胞的增殖能力和生长状况是有差别的(表1)。
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表1 瘢痕疙瘩不同部位细胞周期的分布及
p53蛋白的表达(
±s) 部 位增殖期细胞
百分率(%)
(G2+S+M)
p53蛋白的阳性
表达率(%)
(流式细胞仪)
p53蛋白的阳性
表达强度(荧光值)
(粘附式细胞仪)
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正常皮肤
28.0±2.4
70.6±8.4
2 168±421
增生性瘢痕
70.6±5.2
17.2±2.4
926±124
瘢痕疙瘩中央部
34.0±6.2
58.9±6.2
1 960±348
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瘢痕疙瘩周边部
60.6±4.5
26.4±2.8
1 230±244
2.正常皮肤成纤维细胞p53蛋白的阳性表达率最高(70%)，增生性瘢痕成纤维细胞的阳性表达率最低(仅为17%)；瘢痕疙瘩中央部较周边部，其成纤维细胞p53蛋白阳性表达率较高，各组间差异有显著意义(P<0.01)(表1)。
3.粘附式细胞仪实验结果与流式细胞仪检测结果吻合，即正常皮肤及瘢痕疙瘩中央部单个成纤维细胞p53蛋白阳性强度较高，而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩周边部单个成纤维细胞的p53蛋白阳性强度较低。见表1。可见，正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中央部和周边部成纤维细胞的增殖能力和生长状况的差别可能是由不同表达强度的p53基因调控的结果。
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4.琼脂糖凝胶电泳分析：所有样品DNA经PCR扩增后，均可以得到相应大小片段的目的DNA。在EB的作用下，紫外灯下可见PCR扩增出来的相应DNA片段大小(316 bp)的荧光带，即为待检产物见图1。
M：DNA标准品；2～4：分别为正常人，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩患者的外周血标本；5～7(8～10)：分别为正常人，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩患者的组织标本结果显示PCR扩增出来的产物含316 bp(bp 697 to bp 1 012)[3]，琼脂糖电泳未见异常电泳带
图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析
5.SSCP分析：PCR扩增出来的产物经变性后变成单链，经SSCP凝胶电泳后，如果出现单链带的异常，即认为该样本的Fas基因存在突变见图2。
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1～3：分别为瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者，正常人的组织标本；4～6：分别为瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者，正常人的外周血标本；结果显示：SSCP分析可见仅在瘢痕疙瘩组织标本中存在异常电泳带，异常的电泳带图中用“↑”表示
图2 PCR产物(Fas分子的exon 9)的SSCP分析
经PCR-SSCP检测，20%(2/10)的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，在瘢痕疙瘩组中的外周血标本中未见异常。在正常皮肤对照组及增生性瘢痕组中，无论是在组织标本还是在外周血标本中均未见Fas基因突变的存在。
6.DNA序列分析：两例可疑突变的PCR样本经纯化后测序，DNA测序证实两例突变均为位于Fas cDNA 755 bp处的“A”缺失而导致的移码突变。
讨论
细胞周期的分布可以直观地反应细胞群体的增殖状况，因此我们选择细胞周期作为观测指标对不同部位成纤维细胞增殖能力进行分析。增殖期细胞内存在活跃的DNA的合成，因此胞内DNA含量大于两倍体细胞。此类细胞群包括G2期、S期和M期细胞。非增殖期细胞一般处于G1、G0期，因胞内DNA未复制，因此为典型的两倍体细胞群。因此，应用PI染料标记细胞内DNA后，流式细胞仪可对每个细胞内的DNA进行记录分析。结果经过统计后，可以见到两倍体的G1峰、四倍体的G2峰及两者间的S期细胞。经过电脑分析就可以了解一个细胞群体中增殖期及静止期细胞的百分率。
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本实验研究表明，正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期；增生性瘢痕成纤维细胞多数处于增殖状态；瘢痕疙瘩周边部成纤维细胞大量分布于G2期、S期和M期，约占细胞总数的65%；而瘢痕疙瘩中央部成纤维细胞主要分布在G1、G0期，处于增殖期的细胞占细胞总数的34%。从周期分布的规律我们可以看出正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中央部和周边部成纤维细胞的增殖能力和生长状况是有差别的。
p53基因是参与细胞增殖调节的重要基因之一，在凋亡调控过程中也起着重要作用，它包括野生型和突变型两种不同的存在形式[6，7]。关于p53蛋白在调控细胞增殖机理方面的研究证实[8，9]：p53蛋白能阻断细胞从G1进入S期，使细胞停滞在G1期，从而抑制细胞的增殖过程。当p53蛋白含量减少或基因突变后，细胞可大量进入S期，分裂增殖加剧，从而导致增殖-凋亡的失衡。
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本实验研究发现，正常皮肤及瘢痕疙瘩中央部单个成纤维细胞p53蛋白阳性强度较高，而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩周边部单个成纤维细胞的p53蛋白阳性强度较低。此结果与细胞周期分布结果吻合，说明在瘢痕疙瘩形成过程中，p53蛋白的调控是细胞增殖调控最重要的方式之一。p53蛋白表达的减少，导致细胞大量进入增殖期，导致细胞增殖-凋亡的失衡。
有研究发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞在自然状况下不易凋亡[10]，而Fas介导的死亡信号传递还被认为是介导病理性瘢痕成纤维细胞凋亡的最主要通道[11]。因此，我们的实验研究发现：瘢痕疙瘩成纤维细胞虽然有高表达的Fas受体但在FasMcab作用下不能正常凋亡，同时通过研究其Fas介导的死亡信号传递。据此，我们认为瘢痕疙瘩成纤维细胞的Fas受体可能处于无功能状态。
导致这种无功能状态的Fas分子的机制可能是因为其蛋白编码区基因结构的改变。Fas基因组由8个内含子和9个外显子组成[12]。外显子9编码胞内“死亡域”，它的基因突变也是Fas基因突变的最常见部位[8]。编码“死亡域”的基因突变将直接影响“死亡信号诱导复合物”的形成从而阻断细胞的凋亡；因此，我们试图应用PCR/SSCP研究Fas分子的“死亡域”基因结构。
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本实验结果发现，20%(2/10)的瘢痕疙瘩组织在SSCP分析中出现异常电泳带，提示瘢痕疙瘩组织中可能存在Fas分子死亡域基因结构的改变。两例可疑突变的PCR样本经纯化后测序，DNA测序证实这两例突变均为位于Fas cDNA的755 bp处的“A”缺失而导致的移码突变。增生性瘢痕、正常皮肤及所有样本的外周血标本均未发现异常。
Fas分子死亡域的移码突变将导致其下游氨基酸序列的完全改变，将可能导致Fas分子的功能缺失。Fas分子的功能障碍也将阻断成纤维细胞的凋亡，导致成纤维细胞的增殖-凋亡失衡，从而出现病变部位成纤维细胞的聚集，最终诱发瘢痕疙瘩的形成。
有关p53蛋白在病理性瘢痕形成过程中参与增殖调控的具体模式如何?病理性瘢痕形成过程中还有哪些基因参与了它的增殖调控?本研究从基因水平初步揭示了瘢痕疙瘩发生的机理，进一步的研究需要进一步探讨瘢痕疙瘩的发生与Fas分子基因结构改变之间的联系。研究的进一步深入必将有助于我们从一个新的角度来认识病理性瘢痕成纤维细胞增殖-凋亡失衡的机制。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870807)
参考文献
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(收稿日期：1999-09-16), 百拇医药