抗TORCH-IgM型抗体检测中类风湿因子RF清除的实验研究
作者：黄镇华 况二胜 温淑娟 何祥旺 刘剑雄
单位：黄镇华(第一军医大学南方医院基因技术中心，广东 广州510515)；况二胜(湖北省医学检验研究中心，湖北 武汉 430060)；温淑娟(第一军医大学南方医院基因技术中心，广东 广州510515)；何祥旺(湖北省医学检验研究中心，湖北 武汉 430060)；刘剑雄(湖北省医学检验研究中心，湖北 武汉 430060)
关键词：TORCH-IgM；类风湿因子
第一军医大学学报000228 摘要: 目的 探讨在抗TORCH-IgM型抗体检测中排除RF和特异IgG产生的假阳性和假阴性结果的方法。方法 在抗TORCH-IgM型ELISA试剂的研究过程中，用羊抗人IgG(γ特异)抗血清消除RF干扰。结果 弱阳性OD450下降不超过50%而非特异性下降约80%左右的情况下有效地消除了RF和特异IgG的干扰。结论 在调整好特异性和敏感性关系的前提下，用羊抗人IgG(γ特异)抗血清，能有效地消除RF和特异IgG的干扰，使弱阳性不漏检而假阳性被剔除。
, 百拇医药
中图分类号：R71 文献标识码：B
文章编号：1000-2588(2000)02-0185-02
Experimental studies on rheumatoid factor absorbent in the detection of anti-TORCH-IgM
HUANG Zhen-hua，WEN Shu-juan
(Centre of Genetics, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
KUANG Er-sheng，HE Xiang-wang，LIU Jian-xiong
, 百拇医药
(Hubei Provincial Research Center for Medical Laboratories, Wuhan 430060, China)Abstract: Objective To prevent false negative and false positive IgM test results caused by the presence of rheumatoid factor(RF) and specific IgG in some specimens. Methods Sheep-anti-Human IgG (γ chain-specific) antibody was used to resolve interference by RF and specific IgG. Results and Conclusion The method can efficiently eliminate RF and specific IgG interference, decreasing OD450 of low positivity by 41.9% and non-specificity by 78.8%. False positive result was ruled out and low level of IgM can be tested.
, 百拇医药
Key words: TORCH-IgM; rheumatoid factor
IgM型抗体的检测，在不同程度上受到特异IgG和类风湿因子(RF)的干扰。特别是在孕期TORCH系列(弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱诊病毒等)IgM抗体检测中，由于存在较多IgG和类风湿因子，IgM的检测更易受到干扰。因此采用有效方法消除类风湿因子干扰，对IgM型抗体检测的准确性至关重要。有人用G蛋白吸收、高速离心分离IgM和IgG，再加入羊抗人IgG以及使用含尿素的洗涤液等方法[1]消除IgM检测中类风湿因子等的非特异性干扰。我们对比了几种方法，在兼顾特异性和灵敏度的基础上制备稀释液应用于TORCH-IgM间接法检测中，取得了满意效果，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 G蛋白、抗人全血清(不含IgG、M、IgA)S4893购自Sigma；羊抗人IgG(γ链)抗体(SAH IgG)购自华美公司；抗TORCH-IgM型试剂自制，标准试剂购自美国HOPE公司和德国Human公司；类风湿因子胶乳购自军事医学科学院动物中心。
, 百拇医药
1.1.2 血清 在临床检测中收集TORCH-IgM阳性血清，并通过两种标准试剂确证或阻断试验确定；阴性血清为献血员标本，通过两种标准试剂检测确定；RF阳性血清为临床检测中收集；国际弱阳性标准品由同济医科大学寄生虫教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 以含相应TORCH抗原(排除TORCH-IgM阳性)的生理盐水稀释RF阳性血清，检测筛选出8份干扰血清供以下实验使用，其中97#为强干扰。
1.2.2 比较试验 以含工作浓度的SAH IgG、蛋白G等稀释液稀释1.2.1标本(分别设为A、B组)，37℃放置30 min后按常规操作，并将含0.5 mol/L尿素洗涤液与常规洗涤液PBS比较(分别设为C、D组)。
1.2.3 样品稀释液最佳配方选择 主要成份为SAH IgG，协同S4893等其它成份，由方阵滴定选定最适工作浓度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 4种方法去除RF的效果比较
SAH IgG、G蛋白、致敏乳胶、尿素洗涤液等都能有效地清除RF干扰，但效果有差别(表1)。后两种方法对RF弱干扰并不能彻底清除，对强干扰97#标本效果也不佳。G蛋白用量为25 mg/ml。相比之下，SAH IgG是最有效的方法，本实验即选用SAH IgG制备样品稀释液。
2.2 样品稀释液配方选择
将阳性血清适当稀释使OD450值为0.3～0.4，比较磷酸缓冲液PBS和样品稀释液，统计分析确定最佳配方和最佳血清稀释度为1/100，该样品稀释液稀释阳性和RF干扰血清(44份次)，结果如表2。
2.3 结果判断标准的制定和依据
, 百拇医药
样品稀释液能大大降低非特异性显色，但对不能完全去除高滴度的RF阳性干扰血清，44份次干扰血清测定中5份次大于由正常血清多次检测制定的判断标准Cut-off(P/N≥2.1)：0.161、0.194、0.205、0.194、0.173。调节稀释液中有效成分的用量虽能将其去除，但弱阳性下降严重，达88.1%(0.046/0.386)。为解决特异性和灵敏度的矛盾，我们对稀释液处理的RF血清显色值进行统计学处理(不干扰标本除外)，根据干扰显色测定的A值，确定相应的临界值Cut-off，使所测得的干扰A(x)+ SD小于Cut-off，所测得的非特异显色A(x)+SD=0.185+0.018，由此可确定Cut-off=Nx+0.15，由48份正常血清制备的阴性参照Nx±SD=0.080±0.026。
表1 4种方法消除非特异性干扰效果比较(%)
Tab.1 Comparison between 4 methods for removing non-specific RF interference(%) Non-specific sample
, 百拇医药
Method A
Method B
Method C
Method D
PBS SAHIgG
PBS Protein G
PBS Latex
PBS Urea
1#
0.3240.058(82.1)
0.1960.084(57.1)
, 百拇医药 0.3560.182(48.9)
0.4200.216(48.5)
2#
1.0750.197(81.7)
0.6310.175(72.3)
0.9800.853(13.0)
0.9650.601(37.7)
表2 样品稀释效果
Tab.2 Effect of sample dilution
Positive sera A
, 百拇医药
Non-specific samples A
1#
2#
3#
4#
1#
2#
3#
PBS
0.257
0.356
0.473
0.754
, http://www.100md.com
0.296
0.781
0.368
Sample diluent
0.104
0.207
0.313
0.523
0.043
0.178
0.078
Decline(%)
, 百拇医药
59.5
41.9
33.8
30.6
85.5
77.2
78.8
表3 样品稀释液的灵敏度
Tab.3 Sensitivity of sample diluent Sera
PBS
sample diluent
1#
, 百拇医药
1:3200
1:1600
2#
1:400
1:200
low positive control
1:100
1:60
2.4 样品稀释液的临床检测结果
40份阴性标本检测全部为阴性，选强阳性、阳性和标准血清各1份于弓形虫IgM 检测中作灵敏度比较(表3)。对临床门诊标本(育龄妇女)进行TORCH-IgM抗体检测发现，所有阳性都经阻断试验或标准试剂确诊，TORCH系列IgM 4项检查未发现有多项交叉现象，显示末有RF干扰产生的假阳性出现。该结果的阳性检出率与屈新中等[2～4]的调查结果相似，显示试剂的灵敏度和特异性最佳。
, 百拇医药
表4 临床检测结果
Tab.4 Result of clinical detection of TORCH-IgM Project
total
positive
positive rate(%)
Tox
126
7
5.56
CMV
256
, http://www.100md.com
27
10.5
RuV
46
1
2.17
HSV
51
1
1.96
3 讨论
IgM抗体分子较大，与抗原结合较慢，易受到特异IgG和RF等因素干扰，因此在IgM检测时应对血清进行处理，去除特异IgG和RF。目前国内外同类产品都使用了吸附剂，但都不能完全消除干扰。
, 百拇医药
我们在对比了几种方法后发现，G蛋白等方法虽能取得较好效果，但它们都是通过去除 IgG抗体而起作用，并不能直接去除类风湿因子。我们采用以SAHIgG消除特异IgG为主，辅以去除RF的方法。SAHIgG与IgG结合可以抑制IgG与抗原、RF与IgG的结合，同时SAH IgG与IgG结合的免疫复合物又能与RF结合，从而有效消除RF和IgG的干扰。但是同时IgM也受到相当影响，弱阳性、阳性受到一定损失，OD450下降30%～40%。尽管如此，由于IgG基本被彻底除去，使IgG与IgM的比例向有利于IgM的方向变化，可以有效避免IgG占位作用和RF产生的假阳性。在研究过程中，我们体会到在抗TORCH-IgM间接法检测中，特异性和灵敏度呈负相关，加强对非特异性IgG的去除效果则影响灵敏度，因而调和二者关系对IgM检测的准确性相当重要。经过调整选定以对弱阳性破坏为41.9%而非特异性显色能降低78.8%的条件并结合所制定的判断标准，可以保证假阳性被剔除而弱阳性不被漏检，从而使检测的准确性达到最佳水平。
作者简介：黄镇华(1964-)，男，广东中山人，1997毕业于第一军医大学，技师，电话：85141044
, 百拇医药
参考文献
1，陈 志, 郭建平，王 茜等. 丙型肝炎IgM抗体检测及其意义[J]. 中华医学检验杂志, 1995, 18(5):292～4.
2，屈新中, 王新阳, 钟英琦等. 西安地区孕妇TORCH感染的血清学检测[J]. 西安医科大学学报, 1997, 18(1):101～3.
3，杨连娣, 吴炽煦, 陈昌源等. 武汉地区医院病人弓形虫感染情况调查[J].中华寄生虫病防治杂志, 1996, 19(4):297～8.
4，吕绳敏, 刘兰青, 徐倏森等. 孕妇巨细胞病毒感染对胎儿影响的前瞻性研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1997, 11(2):156～9.
收稿日期：1999-04-15, http://www.100md.com
单位：黄镇华(第一军医大学南方医院基因技术中心，广东 广州510515)；况二胜(湖北省医学检验研究中心，湖北 武汉 430060)；温淑娟(第一军医大学南方医院基因技术中心，广东 广州510515)；何祥旺(湖北省医学检验研究中心，湖北 武汉 430060)；刘剑雄(湖北省医学检验研究中心，湖北 武汉 430060)
关键词：TORCH-IgM；类风湿因子
第一军医大学学报000228 摘要: 目的 探讨在抗TORCH-IgM型抗体检测中排除RF和特异IgG产生的假阳性和假阴性结果的方法。方法 在抗TORCH-IgM型ELISA试剂的研究过程中，用羊抗人IgG(γ特异)抗血清消除RF干扰。结果 弱阳性OD450下降不超过50%而非特异性下降约80%左右的情况下有效地消除了RF和特异IgG的干扰。结论 在调整好特异性和敏感性关系的前提下，用羊抗人IgG(γ特异)抗血清，能有效地消除RF和特异IgG的干扰，使弱阳性不漏检而假阳性被剔除。
, 百拇医药
中图分类号：R71 文献标识码：B
文章编号：1000-2588(2000)02-0185-02
Experimental studies on rheumatoid factor absorbent in the detection of anti-TORCH-IgM
HUANG Zhen-hua，WEN Shu-juan
(Centre of Genetics, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
KUANG Er-sheng，HE Xiang-wang，LIU Jian-xiong
, 百拇医药
(Hubei Provincial Research Center for Medical Laboratories, Wuhan 430060, China)Abstract: Objective To prevent false negative and false positive IgM test results caused by the presence of rheumatoid factor(RF) and specific IgG in some specimens. Methods Sheep-anti-Human IgG (γ chain-specific) antibody was used to resolve interference by RF and specific IgG. Results and Conclusion The method can efficiently eliminate RF and specific IgG interference, decreasing OD450 of low positivity by 41.9% and non-specificity by 78.8%. False positive result was ruled out and low level of IgM can be tested.
, 百拇医药
Key words: TORCH-IgM; rheumatoid factor
IgM型抗体的检测，在不同程度上受到特异IgG和类风湿因子(RF)的干扰。特别是在孕期TORCH系列(弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱诊病毒等)IgM抗体检测中，由于存在较多IgG和类风湿因子，IgM的检测更易受到干扰。因此采用有效方法消除类风湿因子干扰，对IgM型抗体检测的准确性至关重要。有人用G蛋白吸收、高速离心分离IgM和IgG，再加入羊抗人IgG以及使用含尿素的洗涤液等方法[1]消除IgM检测中类风湿因子等的非特异性干扰。我们对比了几种方法，在兼顾特异性和灵敏度的基础上制备稀释液应用于TORCH-IgM间接法检测中，取得了满意效果，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 G蛋白、抗人全血清(不含IgG、M、IgA)S4893购自Sigma；羊抗人IgG(γ链)抗体(SAH IgG)购自华美公司；抗TORCH-IgM型试剂自制，标准试剂购自美国HOPE公司和德国Human公司；类风湿因子胶乳购自军事医学科学院动物中心。
, 百拇医药
1.1.2 血清 在临床检测中收集TORCH-IgM阳性血清，并通过两种标准试剂确证或阻断试验确定；阴性血清为献血员标本，通过两种标准试剂检测确定；RF阳性血清为临床检测中收集；国际弱阳性标准品由同济医科大学寄生虫教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 以含相应TORCH抗原(排除TORCH-IgM阳性)的生理盐水稀释RF阳性血清，检测筛选出8份干扰血清供以下实验使用，其中97#为强干扰。
1.2.2 比较试验 以含工作浓度的SAH IgG、蛋白G等稀释液稀释1.2.1标本(分别设为A、B组)，37℃放置30 min后按常规操作，并将含0.5 mol/L尿素洗涤液与常规洗涤液PBS比较(分别设为C、D组)。
1.2.3 样品稀释液最佳配方选择 主要成份为SAH IgG，协同S4893等其它成份，由方阵滴定选定最适工作浓度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 4种方法去除RF的效果比较
SAH IgG、G蛋白、致敏乳胶、尿素洗涤液等都能有效地清除RF干扰，但效果有差别(表1)。后两种方法对RF弱干扰并不能彻底清除，对强干扰97#标本效果也不佳。G蛋白用量为25 mg/ml。相比之下，SAH IgG是最有效的方法，本实验即选用SAH IgG制备样品稀释液。
2.2 样品稀释液配方选择
将阳性血清适当稀释使OD450值为0.3～0.4，比较磷酸缓冲液PBS和样品稀释液，统计分析确定最佳配方和最佳血清稀释度为1/100，该样品稀释液稀释阳性和RF干扰血清(44份次)，结果如表2。
2.3 结果判断标准的制定和依据
, 百拇医药
样品稀释液能大大降低非特异性显色，但对不能完全去除高滴度的RF阳性干扰血清，44份次干扰血清测定中5份次大于由正常血清多次检测制定的判断标准Cut-off(P/N≥2.1)：0.161、0.194、0.205、0.194、0.173。调节稀释液中有效成分的用量虽能将其去除，但弱阳性下降严重，达88.1%(0.046/0.386)。为解决特异性和灵敏度的矛盾，我们对稀释液处理的RF血清显色值进行统计学处理(不干扰标本除外)，根据干扰显色测定的A值，确定相应的临界值Cut-off，使所测得的干扰A(x)+ SD小于Cut-off，所测得的非特异显色A(x)+SD=0.185+0.018，由此可确定Cut-off=Nx+0.15，由48份正常血清制备的阴性参照Nx±SD=0.080±0.026。
表1 4种方法消除非特异性干扰效果比较(%)
Tab.1 Comparison between 4 methods for removing non-specific RF interference(%) Non-specific sample
, 百拇医药
Method A
Method B
Method C
Method D
PBS SAHIgG
PBS Protein G
PBS Latex
PBS Urea
1#
0.3240.058(82.1)
0.1960.084(57.1)
, 百拇医药 0.3560.182(48.9)
0.4200.216(48.5)
2#
1.0750.197(81.7)
0.6310.175(72.3)
0.9800.853(13.0)
0.9650.601(37.7)
表2 样品稀释效果
Tab.2 Effect of sample dilution
Positive sera A
, 百拇医药
Non-specific samples A
1#
2#
3#
4#
1#
2#
3#
PBS
0.257
0.356
0.473
0.754
, http://www.100md.com
0.296
0.781
0.368
Sample diluent
0.104
0.207
0.313
0.523
0.043
0.178
0.078
Decline(%)
, 百拇医药
59.5
41.9
33.8
30.6
85.5
77.2
78.8
表3 样品稀释液的灵敏度
Tab.3 Sensitivity of sample diluent Sera
PBS
sample diluent
1#
, 百拇医药
1:3200
1:1600
2#
1:400
1:200
low positive control
1:100
1:60
2.4 样品稀释液的临床检测结果
40份阴性标本检测全部为阴性，选强阳性、阳性和标准血清各1份于弓形虫IgM 检测中作灵敏度比较(表3)。对临床门诊标本(育龄妇女)进行TORCH-IgM抗体检测发现，所有阳性都经阻断试验或标准试剂确诊，TORCH系列IgM 4项检查未发现有多项交叉现象，显示末有RF干扰产生的假阳性出现。该结果的阳性检出率与屈新中等[2～4]的调查结果相似，显示试剂的灵敏度和特异性最佳。
, 百拇医药
表4 临床检测结果
Tab.4 Result of clinical detection of TORCH-IgM Project
total
positive
positive rate(%)
Tox
126
7
5.56
CMV
256
, http://www.100md.com
27
10.5
RuV
46
1
2.17
HSV
51
1
1.96
3 讨论
IgM抗体分子较大，与抗原结合较慢，易受到特异IgG和RF等因素干扰，因此在IgM检测时应对血清进行处理，去除特异IgG和RF。目前国内外同类产品都使用了吸附剂，但都不能完全消除干扰。
, 百拇医药
我们在对比了几种方法后发现，G蛋白等方法虽能取得较好效果，但它们都是通过去除 IgG抗体而起作用，并不能直接去除类风湿因子。我们采用以SAHIgG消除特异IgG为主，辅以去除RF的方法。SAHIgG与IgG结合可以抑制IgG与抗原、RF与IgG的结合，同时SAH IgG与IgG结合的免疫复合物又能与RF结合，从而有效消除RF和IgG的干扰。但是同时IgM也受到相当影响，弱阳性、阳性受到一定损失，OD450下降30%～40%。尽管如此，由于IgG基本被彻底除去，使IgG与IgM的比例向有利于IgM的方向变化，可以有效避免IgG占位作用和RF产生的假阳性。在研究过程中，我们体会到在抗TORCH-IgM间接法检测中，特异性和灵敏度呈负相关，加强对非特异性IgG的去除效果则影响灵敏度，因而调和二者关系对IgM检测的准确性相当重要。经过调整选定以对弱阳性破坏为41.9%而非特异性显色能降低78.8%的条件并结合所制定的判断标准，可以保证假阳性被剔除而弱阳性不被漏检，从而使检测的准确性达到最佳水平。
作者简介：黄镇华(1964-)，男，广东中山人，1997毕业于第一军医大学，技师，电话：85141044
, 百拇医药
参考文献
1，陈 志, 郭建平，王 茜等. 丙型肝炎IgM抗体检测及其意义[J]. 中华医学检验杂志, 1995, 18(5):292～4.
2，屈新中, 王新阳, 钟英琦等. 西安地区孕妇TORCH感染的血清学检测[J]. 西安医科大学学报, 1997, 18(1):101～3.
3，杨连娣, 吴炽煦, 陈昌源等. 武汉地区医院病人弓形虫感染情况调查[J].中华寄生虫病防治杂志, 1996, 19(4):297～8.
4，吕绳敏, 刘兰青, 徐倏森等. 孕妇巨细胞病毒感染对胎儿影响的前瞻性研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1997, 11(2):156～9.
收稿日期：1999-04-15, http://www.100md.com