用反义策略研究hMMS2基因在人细胞分裂增殖中的作用
作者：陈建明 余应年
单位：浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010174
目的：hMMS2是人细胞中新发现的基因，其酵母同源基因MMS2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立hMMS2基因表达阻断细胞系，以分析hMMS2基因的功能。方法：1.hMMS2反义RNA表达质粒构建：用PstI酶从pBS-hMMS2上切出837 bp长hMMS2 cDNA片断，两端切平后分别连上Sal I连接子，Sal I酶切后，将比目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的切点上，通过酶切图谱分析筛选hMMS2反义RNA表达重组子；2.细胞转染及筛选：反向表达重组子用改良的磷酸钙法转染入FL细胞，通过G418筛选抗性集落，同时转染空质粒建立质粒对照细胞系；3.反义RNA转录检测：分别提取诱导培养后的FL-hMMS2及对照FL、FL-MAMneo细胞总RNA，用正义引物作为逆转录反应引物各自进行RT-PCR扩增，同时分别进行不加逆转录酶的直接PCR扩增反应以分析总RNA中有无DNA污染。4.RT-PCR产物克隆及测序：FL-hMMS2细胞系RT-PCR扩增条带回收后克隆到pGEM-T载体上，酶切筛选重组质粒，并测定重组质粒中插入片断的序列。5.细胞生长速率测定：将FL-hMMS2及对照FL、FL-MANneo细胞分别以3×104 cells/孔种于24孔板，诱导培养24 h后第2 d开始每天计数，共计6 d。结果：构建好的重组质粒经NheI、BstXI双酶切其中的一个出现553 bp及8.7 kb二条带，说明此质粒就是hMMS2反义RNA表达重组子。反向表达重组子及空质粒分别转染FL细胞后筛选培养3周各得到10多个抗性集落，进一步分别扩大培养成系。研究发现诱导后FL-hMMS2细胞经RT-PCR扩增得到一560 bp靶带，而对照细胞系及同时进行的直接PCR扩增产物都没有出现靶带。扩增条带克隆后经BstXI酶切可得一333 bp条带，序列测定结果发现该扩增条带的序列与hMMS2反义RNA序列完全一致，可见地塞米松可诱导FL-hMMS2细胞系中转染的反向表达重组子转录出hMMS2反义RNA。FL-hMMS2细胞系地塞米松诱导后其生长速率要明显慢于对照FL-MAMneo及FL细胞系(P<0.001)。结论：1.本研究成功地建立了hMMS2基因表达阻断的FL-hMMS2细胞系；2.本研究结果提示hMMS2基因可能是细胞生长所必需基因。
国家自然科学基金重点资助项目(No.39830210), http://www.100md.com
单位：浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010174
目的：hMMS2是人细胞中新发现的基因，其酵母同源基因MMS2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立hMMS2基因表达阻断细胞系，以分析hMMS2基因的功能。方法：1.hMMS2反义RNA表达质粒构建：用PstI酶从pBS-hMMS2上切出837 bp长hMMS2 cDNA片断，两端切平后分别连上Sal I连接子，Sal I酶切后，将比目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的切点上，通过酶切图谱分析筛选hMMS2反义RNA表达重组子；2.细胞转染及筛选：反向表达重组子用改良的磷酸钙法转染入FL细胞，通过G418筛选抗性集落，同时转染空质粒建立质粒对照细胞系；3.反义RNA转录检测：分别提取诱导培养后的FL-hMMS2及对照FL、FL-MAMneo细胞总RNA，用正义引物作为逆转录反应引物各自进行RT-PCR扩增，同时分别进行不加逆转录酶的直接PCR扩增反应以分析总RNA中有无DNA污染。4.RT-PCR产物克隆及测序：FL-hMMS2细胞系RT-PCR扩增条带回收后克隆到pGEM-T载体上，酶切筛选重组质粒，并测定重组质粒中插入片断的序列。5.细胞生长速率测定：将FL-hMMS2及对照FL、FL-MANneo细胞分别以3×104 cells/孔种于24孔板，诱导培养24 h后第2 d开始每天计数，共计6 d。结果：构建好的重组质粒经NheI、BstXI双酶切其中的一个出现553 bp及8.7 kb二条带，说明此质粒就是hMMS2反义RNA表达重组子。反向表达重组子及空质粒分别转染FL细胞后筛选培养3周各得到10多个抗性集落，进一步分别扩大培养成系。研究发现诱导后FL-hMMS2细胞经RT-PCR扩增得到一560 bp靶带，而对照细胞系及同时进行的直接PCR扩增产物都没有出现靶带。扩增条带克隆后经BstXI酶切可得一333 bp条带，序列测定结果发现该扩增条带的序列与hMMS2反义RNA序列完全一致，可见地塞米松可诱导FL-hMMS2细胞系中转染的反向表达重组子转录出hMMS2反义RNA。FL-hMMS2细胞系地塞米松诱导后其生长速率要明显慢于对照FL-MAMneo及FL细胞系(P<0.001)。结论：1.本研究成功地建立了hMMS2基因表达阻断的FL-hMMS2细胞系；2.本研究结果提示hMMS2基因可能是细胞生长所必需基因。
国家自然科学基金重点资助项目(No.39830210), http://www.100md.com