高效液相色谱法测定氟马西尼的含量
作者：王玉川 孙秀燕 王立群 程卯生
单位：程卯生 王玉川(银川市第二人民医院，银川 750000)；王立群 孙秀燕(沈阳药科大学分析测试中心，沈阳 110015)
关键词：氟马西尼；有关物质；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报00zk11 摘 要 采用高效液相色谱法，对氟马西尼及其合成过程中产生的中间产物以及有关杂质进行分离测定.结果表明：对照品进样量在2～10 μg范围内有良好线性关系，且分离时间短，重复性好，含量测定结果令人满意.
分类号 R917.1
Determination of the Content of Flumazenil by HPLC
Wang Yuchuan, Sun Xiuyan, Wang Liqun, Cheng Maosheng
, 百拇医药
(The Second People′s Hospital of Yinchuan,Yinchuan 750000)
Abstract In this paper,flumazenil,intermediates and impurities were separated and determined quantitatively by highperformance liquid chromatography with the C18 column.The mobile phase was acetonitrile and water(V∶V=22∶78).The linear ranges of the standard sample were 2～10 μg.By the method,the short retention time was readily achieved with satisfactary results.
, 百拇医药
Key words flumazenil;impurities;high performance liquid chromatography(HPLC)
氟马西尼(flumazenil)为苯二氮受体选择性拮抗剂，临床上用于终止由苯二氮类药物诱导维持的全身麻醉，以及该类药物中毒的急救.沈阳药科大学合成室经大量实验，筛选出氟马西尼的最佳合成路线.作者采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水(V∶V=22∶78)为流动相，氟羟肟作内标物测定氟马西尼的含量，在该色谱条件下，与主峰及杂质峰均能很好分离，且分离时间短，重复性好，含量测定结果令人满意.
1 仪器与试药
日本岛津LC-10A液相色谱仪，CLASS-LC10工作站，SPD-M10A二极管阵列检测器，CTO-10A柱恒温箱，意大利产Carlo Erba 1106型元素分析仪；乙腈为色谱纯，水为二次重蒸水；氟马西尼和氟羟肟对照品及样品由沈阳药科大学合成室提供.
, 百拇医药
2 色谱条件
2.1 检测波长的选择
分别测定样品和内标物的紫外光谱，氟马西尼的最大吸收波长为243 nm，氟羟肟的最大吸收波长为275 nm，两者的最大吸收波长相距较远，因此选择两者吸收均较强的波长220 nm为测定波长.
2.2 对照品纯度检查
将样品称在锡箔的容器内，再放入进样器中.样品在1 050℃燃烧管内催化燃烧，以稳定氮气流作载气，C、H、N分别转化为CO2、H2O、N2.该混合组分进到色谱柱，分离N2、CO2、H2O.各组分与载气一起流过热导池，产生电信号，经积分仪和计算机处理，有关元素分析数据见表1.
, 百拇医药 Tab.1 The results of elementary analysis% Element
C
H
O
N
F
Theory value
59.40
4.65
13.85
15.85
6.26
, http://www.100md.com
Practical value
59.50
4.85
13.73
15.80
6.15
在上述色谱条件下测得氟马西尼对照品的纯度为99.7%，RSD为0.96%(n=5).
3 方法与结果
3.1 线性范围考察
称取氟马西尼对照品约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制备氟马西尼对照品溶液.
, 百拇医药
称取氟羟肟对照品约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得内标物溶液.
分别精密吸取氟马西尼对照品溶液1,2,3,4,5 mL置10 mL量瓶中，每个量瓶均加入3 mL内标物溶液，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.取20 μL注入液相色谱仪，分别测得对照品的峰面积(Ai)和内标物的峰面积(As)值，有关数据见表2.
以对照品进样量为横坐标，氟马西尼对照品峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归得回归方程：C=0.009 31A+3.18，相关系数r=0.999 9.由此可见，氟马西尼进样量在2～10 μg范围内线性关系良好.
Tab.2 The linear relationship No.
Amount of standard sample
, 百拇医药
/μg
Ai
As
Ai/As
Average value of
Ai/As
1
1.904
6733036
21828601
0.308 4
0.308 5
, 百拇医药 6751434
21879520
0.308 6
2
3.808
13340769
22026443
0.605 7
0.606 5
13494769
22222792
0.607 2
, http://www.100md.com
3
5.712
20306802
22266642
0.912 0
0.912 3
20238642
22176817
0.912 6
4
7.616
25342712
, http://www.100md.com
20991629
1.207 3
1.208 0
25098347
20764397
1.208 7
5
9.520
33302574
22122456
1.505 8
1.506 0
, 百拇医药
33152533
22011101
1.506 2
3.2 供试品溶液的制备
取氟马西尼样品约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.精密取该溶液3 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.
3.3 稳定性考察
精密吸取同一供试品溶液，按0，2，4，6，8，10 h时间间隔，分别测定供试品峰面积(Ai)和内标物峰面积(As)值，测定结果见表3.
实验结果表明：供试品溶液在制备后10 h内测定，色谱峰面积无明显变化，说明在此时间内测定，供试品化学性质稳定.Tab.3 The results of the stability observation t/h
, 百拇医药
Ai
As
Ai/As
Sample content/g*L-1
RSD/%
0
19602959
22236161
0.881 6
0.275 2
2
19608817
, 百拇医药
22232634
0.882 3
0.275 4
4
19356163
21991813
0.880 2
0.274 7
0.2
6
19468412
22088780
, 百拇医药
0.881 4
0.275 1
8
19535530
22132293
0.882 6
0.275 5
10
19413831
22113877
0.877 9
0.274 0
, http://www.100md.com
3.4 重现性考察 制备6份同一批号的供试品溶液，分别按上述色谱条件测定，测定结果见表4.
Tab.4 The results of precision tests No.
Ai
As
Ai/As
RSD/%
1
19356163
21991813
0.880 2
2
, http://www.100md.com
19468412
22088780
0.881 4
3
19535530
22132293
0.882 7
0.87
4
19413931
22113877
0.887 9
, 百拇医药
5
19836764
22058207
0.899 3
6
19495236
22059393
0.883 8
3.5 样品的测定
测定3批样品，测定结果见表5.氟马西尼对照品的浓度为0.952 g/L.Tab.5 The measuremental results of the sample contents No.
, 百拇医药
Sample concentration
/g。L-1
Ai
As
Ai/As
Average value of
Ai/As
Content/%
1
0.989
20939724
, 百拇医药
22173321
0.944 4
0.943 5
99.2
21035001
22316770
0.942 6
2
0.952
19836764
22058207
0.899 3
, http://www.100md.com
0.898 4
98.1
19796316
22057100
0.897 5
3
0.968
20251277
22070245
0.917 6
0.9166
98.5
, http://www.100md.com
20246904
22111612
0.915 7
Fig.1 Chromatograms of flumazenil and its intermediates
4 讨论
4.1 中间产物的分离
在氟马西尼的工艺合成过程中，产生氟羟肟、5-氟靛红、6-氟靛红酸酐及杂二酮4种重要的中间产物.经大量实验，流动相为乙腈-水(V∶V=22∶78)能将这5种物质完全分离，分离图谱见图1.
4.2 内标物的选择
, http://www.100md.com
用氟马西尼母液作系统适应性试验，得知保留时间17 min为氟马西尼，保留时间4 min和9 min为有关物质峰.在9 min到17 min之间或17 min之后，可以插入内标物的峰.氟羟肟的保留时间为13 min，与氟马西尼峰的分离度很好，因此以氟羟肟作为氟马西尼的内标物.
4.3 样品中有关物质的定性定量分析
氟马西尼HPLC色谱图中，保留时间为4 min的杂质峰经与中间体的保留时间对照，推测其为杂
二酮.通过加入适量的杂二酮对照品，观察到4 min的色谱峰明显增大，证实了该杂质确实是杂二酮.经外标法测定，该杂质含量小于0.5%.
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：人民卫生出版社，1995.附录25～26
2，彭震云，祁超.氟马西尼的合成.中国医药工业杂志，1994，25(1)：3～4
收稿日期:2000-03-22, 百拇医药
单位：程卯生 王玉川(银川市第二人民医院，银川 750000)；王立群 孙秀燕(沈阳药科大学分析测试中心，沈阳 110015)
关键词：氟马西尼；有关物质；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报00zk11 摘 要 采用高效液相色谱法，对氟马西尼及其合成过程中产生的中间产物以及有关杂质进行分离测定.结果表明：对照品进样量在2～10 μg范围内有良好线性关系，且分离时间短，重复性好，含量测定结果令人满意.
分类号 R917.1
Determination of the Content of Flumazenil by HPLC
Wang Yuchuan, Sun Xiuyan, Wang Liqun, Cheng Maosheng
, 百拇医药
(The Second People′s Hospital of Yinchuan,Yinchuan 750000)
Abstract In this paper,flumazenil,intermediates and impurities were separated and determined quantitatively by highperformance liquid chromatography with the C18 column.The mobile phase was acetonitrile and water(V∶V=22∶78).The linear ranges of the standard sample were 2～10 μg.By the method,the short retention time was readily achieved with satisfactary results.
, 百拇医药
Key words flumazenil;impurities;high performance liquid chromatography(HPLC)
氟马西尼(flumazenil)为苯二氮受体选择性拮抗剂，临床上用于终止由苯二氮类药物诱导维持的全身麻醉，以及该类药物中毒的急救.沈阳药科大学合成室经大量实验，筛选出氟马西尼的最佳合成路线.作者采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水(V∶V=22∶78)为流动相，氟羟肟作内标物测定氟马西尼的含量，在该色谱条件下，与主峰及杂质峰均能很好分离，且分离时间短，重复性好，含量测定结果令人满意.
1 仪器与试药
日本岛津LC-10A液相色谱仪，CLASS-LC10工作站，SPD-M10A二极管阵列检测器，CTO-10A柱恒温箱，意大利产Carlo Erba 1106型元素分析仪；乙腈为色谱纯，水为二次重蒸水；氟马西尼和氟羟肟对照品及样品由沈阳药科大学合成室提供.
, 百拇医药
2 色谱条件
2.1 检测波长的选择
分别测定样品和内标物的紫外光谱，氟马西尼的最大吸收波长为243 nm，氟羟肟的最大吸收波长为275 nm，两者的最大吸收波长相距较远，因此选择两者吸收均较强的波长220 nm为测定波长.
2.2 对照品纯度检查
将样品称在锡箔的容器内，再放入进样器中.样品在1 050℃燃烧管内催化燃烧，以稳定氮气流作载气，C、H、N分别转化为CO2、H2O、N2.该混合组分进到色谱柱，分离N2、CO2、H2O.各组分与载气一起流过热导池，产生电信号，经积分仪和计算机处理，有关元素分析数据见表1.
, 百拇医药 Tab.1 The results of elementary analysis% Element
C
H
O
N
F
Theory value
59.40
4.65
13.85
15.85
6.26
, http://www.100md.com
Practical value
59.50
4.85
13.73
15.80
6.15
在上述色谱条件下测得氟马西尼对照品的纯度为99.7%，RSD为0.96%(n=5).
3 方法与结果
3.1 线性范围考察
称取氟马西尼对照品约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制备氟马西尼对照品溶液.
, 百拇医药
称取氟羟肟对照品约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得内标物溶液.
分别精密吸取氟马西尼对照品溶液1,2,3,4,5 mL置10 mL量瓶中，每个量瓶均加入3 mL内标物溶液，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.取20 μL注入液相色谱仪，分别测得对照品的峰面积(Ai)和内标物的峰面积(As)值，有关数据见表2.
以对照品进样量为横坐标，氟马西尼对照品峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归得回归方程：C=0.009 31A+3.18，相关系数r=0.999 9.由此可见，氟马西尼进样量在2～10 μg范围内线性关系良好.
Tab.2 The linear relationship No.
Amount of standard sample
, 百拇医药
/μg
Ai
As
Ai/As
Average value of
Ai/As
1
1.904
6733036
21828601
0.308 4
0.308 5
, 百拇医药 6751434
21879520
0.308 6
2
3.808
13340769
22026443
0.605 7
0.606 5
13494769
22222792
0.607 2
, http://www.100md.com
3
5.712
20306802
22266642
0.912 0
0.912 3
20238642
22176817
0.912 6
4
7.616
25342712
, http://www.100md.com
20991629
1.207 3
1.208 0
25098347
20764397
1.208 7
5
9.520
33302574
22122456
1.505 8
1.506 0
, 百拇医药
33152533
22011101
1.506 2
3.2 供试品溶液的制备
取氟马西尼样品约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.精密取该溶液3 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.
3.3 稳定性考察
精密吸取同一供试品溶液，按0，2，4，6，8，10 h时间间隔，分别测定供试品峰面积(Ai)和内标物峰面积(As)值，测定结果见表3.
实验结果表明：供试品溶液在制备后10 h内测定，色谱峰面积无明显变化，说明在此时间内测定，供试品化学性质稳定.Tab.3 The results of the stability observation t/h
, 百拇医药
Ai
As
Ai/As
Sample content/g*L-1
RSD/%
0
19602959
22236161
0.881 6
0.275 2
2
19608817
, 百拇医药
22232634
0.882 3
0.275 4
4
19356163
21991813
0.880 2
0.274 7
0.2
6
19468412
22088780
, 百拇医药
0.881 4
0.275 1
8
19535530
22132293
0.882 6
0.275 5
10
19413831
22113877
0.877 9
0.274 0
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3.4 重现性考察 制备6份同一批号的供试品溶液，分别按上述色谱条件测定，测定结果见表4.
Tab.4 The results of precision tests No.
Ai
As
Ai/As
RSD/%
1
19356163
21991813
0.880 2
2
, http://www.100md.com
19468412
22088780
0.881 4
3
19535530
22132293
0.882 7
0.87
4
19413931
22113877
0.887 9
, 百拇医药
5
19836764
22058207
0.899 3
6
19495236
22059393
0.883 8
3.5 样品的测定
测定3批样品，测定结果见表5.氟马西尼对照品的浓度为0.952 g/L.Tab.5 The measuremental results of the sample contents No.
, 百拇医药
Sample concentration
/g。L-1
Ai
As
Ai/As
Average value of
Ai/As
Content/%
1
0.989
20939724
, 百拇医药
22173321
0.944 4
0.943 5
99.2
21035001
22316770
0.942 6
2
0.952
19836764
22058207
0.899 3
, http://www.100md.com
0.898 4
98.1
19796316
22057100
0.897 5
3
0.968
20251277
22070245
0.917 6
0.9166
98.5
, http://www.100md.com
20246904
22111612
0.915 7
Fig.1 Chromatograms of flumazenil and its intermediates
4 讨论
4.1 中间产物的分离
在氟马西尼的工艺合成过程中，产生氟羟肟、5-氟靛红、6-氟靛红酸酐及杂二酮4种重要的中间产物.经大量实验，流动相为乙腈-水(V∶V=22∶78)能将这5种物质完全分离，分离图谱见图1.
4.2 内标物的选择
, http://www.100md.com
用氟马西尼母液作系统适应性试验，得知保留时间17 min为氟马西尼，保留时间4 min和9 min为有关物质峰.在9 min到17 min之间或17 min之后，可以插入内标物的峰.氟羟肟的保留时间为13 min，与氟马西尼峰的分离度很好，因此以氟羟肟作为氟马西尼的内标物.
4.3 样品中有关物质的定性定量分析
氟马西尼HPLC色谱图中，保留时间为4 min的杂质峰经与中间体的保留时间对照，推测其为杂
二酮.通过加入适量的杂二酮对照品，观察到4 min的色谱峰明显增大，证实了该杂质确实是杂二酮.经外标法测定，该杂质含量小于0.5%.参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：人民卫生出版社，1995.附录25～26
2，彭震云，祁超.氟马西尼的合成.中国医药工业杂志，1994，25(1)：3～4
收稿日期:2000-03-22, 百拇医药