5-氨基水杨酸微球的制备和体外控释性质
作者：刘锐玲 全红 王满元 李青山 赵正保
单位：刘锐玲(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；全红(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；王满元(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；李青山(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；赵正保(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)
关键词：氨基水杨酸类；结肠炎；微球体；大鼠
山西医科大学学报000117 摘要： 以多氨基酸共聚法，将 L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸合成低分子的聚合物。在酸性条件下将抗溃疡性结肠炎(IBD)药物 5-氨基水杨酸(5-ASA)同聚合物制成控释剂微球。控释剂药物的释放对溶液的 pH 值有强烈的依赖性。紫外分光光度法测定，在酸性条件下，6 h 内，仅有不到 10% 的 5-ASA 被释放出来。当 pH 7.2 时，在 3 h 内，约有 94% 的药物被释放出来。实验结果显示，控释剂微球对抗 IBD 具有良好的靶向作用。
, 百拇医药
中图分类号： R944.2+7 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0037-03
Preparation of 5-aminosalicylic acid microsphere and its controlled-release properties in vitro
Liu Ruiling, Quan Hong, Wang Manyuan, et al
(Dept. of Pharmaceutical Chemistry，Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
Abstract： Oligomers consisting of L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-tyrosine and L-phenylalanine were synthesized through the corresponding amino acid. These oligomers can spontaneously encapsulate 5-aminosalicylic acid(5-ASA) and form microsphere under acid condition. The stability of the micorosphere was strongly pH dependent.At low pH, <10% of 5-ASA was released from microsphere in the 6 hours; and at pH 7.2, 94% of 5-ASA was dissolved in the 3 hours. The results suggest that this microsphere has a superior directional and therapeutic effect on inflammation.
, 百拇医药
Key words： aminosalicylic acids； colitis,ulcerative; microspheres; rats
5-ASA 可以阻止前列腺素，脂肪氧合酶的合成以及干扰抗体的合成[1]，它可以抑制或还原 IBD 病变部位黄嘌呤氧化酶或白细胞介导的氧自由基形成，如 HOCl 和 ROS[2]。因此 5-ASA 具有抗 IBD 的作用。当 5-ASA 口服给药时，它容易在胃和小肠部分吸收、乙酰化，而由尿液排出，难以达到病变的结肠部位，产生理想的抗炎效果[3]。故有必要发展一种 5-ASA 的载体或控释剂，传递药物到大肠的病变部位，在那里释放出 5-ASA，使之在病变部位的局部达到理想的药物浓度。本文利用氨基酸在低的 pH 值条件下可以交叉缩聚，同时将 5-ASA 包埋在缩聚的微球中，而缩聚的药物微球可以在中性和碱性水溶液中溶解而释放出 5-ASA。考虑到 IBD 患者的胃液和小肠粘液显酸性，病变部位大肠部分显碱性，从而使 5-ASA 尽可能少的在胃和小肠中释放，而在碱性的大肠部分溶解释放出 5-ASA， 达到靶向作用。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器和材料 UV-260 分光光度计(日本岛津)；恒温培养箱(上海医疗器械厂)；GS 12 型电子搅拌器(上海沪南科学仪器厂)。L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和 L-苯丙氨酸由 Fisher 公司购买，直接使用。5-ASA 北京精细化工厂生产，化学纯(95%)，经纯化使用。
1.2 5-ASA 多氨基酸共聚微球的制备 将通过 Yang[4]法制备的 L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和 L-酪氨酸的低聚物，溶解在蒸馏水中(10% W/W)，溶液用 0.2 μm 的滤膜过滤；溶解 5-ASA 在6.5% 的柠檬酸水溶液中，配成含 5-ASA 1.5 mol/L 的柠檬酸溶液，且加入适量乳化剂吐温-80。药物溶液在氮气保护下加热至 40 ℃，然后与相同温度的聚合物水溶液在剧烈搅拌下混合。混合后的乳浊液 pH＝3～3.5，在氮气气氛下，搅拌 30 min 自然冷却，将冷至室温的混合液过滤收集微球。
, 百拇医药
1.3 微球中药物含量的测定 将恒重的 5-ASA 原料药配制成不同浓度的溶液，用紫外分光光度法测定在 320 nm 处的吸光度，标准曲线方程为 C=44.633 a+0.998 3(C为浓度 mg/L，a为吸光度)，r2=0.999 3。精密称取 5-ASA 的氨基酸共聚物微球 10 mg，用 pH 9 的 NH3.H2O-NH4Cl 缓冲溶液溶解，置于 10 ml 的容量瓶中，加缓冲溶液至刻度。以空白氨基酸共聚物微球平行处理做为对照，在波长 320 nm 处测定吸光度计算 5-ASA 氨基酸共聚物中药物含量。
1.4 微球体外药物释放测定 将雄性大鼠乙醚麻醉，沿腹正中线切开，取出胃、小肠、大肠组织。用 pH 4.5 的乙酸钠(NaAC)-乙酸(HAC)缓冲溶液冲洗胃组织。用 pH 6.5 的磷酸氢二钠(Na2HPO4)-磷酸(H3PO4)组成的缓冲溶液冲洗小肠部分。用 pH 7.2 Na2HPO4-磷酸二氢钠(NaH2PO4)缓冲溶液冲洗大肠部分。分别在 3 种溶液中加入 5-ASA 微球，使其浓度为 120 mg/L，将它们分别装入 3 支试管中，恒温 37 ℃ 培养 6 h，在一定的时间间隔，取部分样品抽滤，用 UV-260 分光光度计测其滤液在 320 nm 的吸光度，计算其 5-ASA 的释放率。
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2 结果和讨论
实验显示 L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸，当比例为 1∶1∶1∶1，pH 为 3.2 的条件下，可以同 5-ASA 形成很好的微球。1∶6.2 是 5-ASA 和载体的最佳投料比，在此投料比下微球的平均含药量约为 12 %，包封率为 81%。在模拟人体消化道的实验条件中，微球的药物释放测定结果显示，该控释剂对溶液的 pH 值有强烈的依赖关系。在类似与胃和小肠道的条件下 5-ASA 有低的释放率，在 6 h 内<10%。而在大肠条件中释放率随时间的延长迅速增大，3 h 之内可达 94%。本制剂有望成为用 5-ASA 治疗 IBD 的良好口服控释剂型。
实验过程中发现，在酸性条件下，当天冬氨酸、谷氨基、苯丙氨酸、酪氨酸之间的摩尔比为 1∶1∶1∶1 时，可很好的形成共聚微球。这可能是由于酰胺键之间的氢键键合作用，以及支链上憎水基之间的相互作用。在本实验中天门冬氨酸和谷氨酸是聚合物中亲水的和可离子化部分，而含有苯基的苯丙氨酸和酪氨酸是憎水氨基酸。当投料摩尔比为 1∶1∶1∶1 时，亲水基和增水基达到平衡。微球在酸性条件下形成，而在中性和碱性水溶液中溶解，是由于羧酸和它的碱金属盐有非常不同的水溶性，在碱性条件下羧酸基可离子化而溶解。所以改变 pH 值能够有效地改变微球的形成和溶解。
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3 批微球的药物含量及包封率的测定结果显示在表1。其微球平均含药量为(11.77±0.28)%，包封率为(81.15±2.0)%。在同样条件下，用空白实验对微球的载药量进行了回收实验，回收率为 97.35%。微球的载药量、包封率与 5-ASA 和氨基酸聚合物的比例密切相关。当 5-ASA 的聚合物<1∶6.2 时，微球的载药量随 5-ASA 投料的增加而增大，且有较高的包封率。当 5-ASA 和聚合物的比例>1∶6.2时，微球的载药量没有明显的变化。这表明载体的药量已达到平衡，而药物的包封率则随着 5-ASA 投入量的增加而迅速降低。
表1 5-ASA 聚氨基酸微球的药物含量及包封率(%) 编号
理论含约量
实验含药量
包封率
1
, 百拇医药
14.50
11.58
79.86
2
14.50
12.05
83.10
3
14.50
11.67
80.48
图1显示 5-ASA 微球的体外药物释放结果。由图1可见，在模拟人体胃液、小肠和大肠组织粘液条件下，药物 5-ASA 的微球释放结果显示，在 pH≤6.5 的缓冲溶液中 5-ASA 的释放非常缓慢，在 6 h 之内，药物的总释放率<10%。这意味着该控释剂对人体口服给药，在胃和小肠部分仅有少量释放。这部分的药物释放并不是由于氨基酸共聚物中羧基的成盐引起的，而是由胃和肠道细菌蛋白分解酶引起的，而在 pH 7.2 的 Na2HPO4-NaH2PO4 冲洗的大肠溶液中，5-ASA 释放率随时间的延长而明显的增长，3 h 之内 5-ASA 的释放率已达近 94%。这表明本实验制备的 5-ASA 控释剂对溶液的 pH 值有强烈的依赖关系，在碱性条件下，它可以迅速溶解游离出 5-ASA。这对多氨基酸共聚物做为治疗 IBD 药 5-ASA 的载体是非常重要的。它可以保证，5-ASA 通过胃和小肠道部分有尽可能少的释放，而在大肠部分则可以迅速释放。这使 5-ASA 在结肠的病变部位有高的药物浓度，起到良好的靶向作用，达到理想的治疗效果。
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—◆—表示在pH 4.5 NaAC-HAC冲洗的胃液中释放结果
—■—表示在pH 6.5 Na2HPO4-H3PO4冲洗的小肠粘液中释放结果
—▲—表示在pH 7.2 NaH2PO4-NaH2PO4冲洗的大肠粘液中释放结果
图1 5-ASA 氨基酸共聚微球的体外药物释放结果
作者简介： 刘锐玲，女,1959年7月生，大专，主管技师
参考文献：
[1] Milojevic S, Newton JM, Cummings JH, et al. Amylose as a coating for drug delivery to the colon. Preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets[J]. J Control Release, 1996, 38: 75.
, 百拇医药
[2] Goncalves E, Almeida LM， Dinis TCP.Antioxidant activity of 5-aminosalicylic acid against lipid peroxidation in the presence of vitamins C and E[J].Intern J Pharmac, 1998, 172: 219.
[3] Brzezinski A, Rankin GB,Seidner DL, et al.Use of old and new oral 5-aminosalicylic acid formulations in inflammatory bowel disease[J].Clevel Clin J Med, 1995， 42 (5): 317.
[4] Yang JZ, Antoun S, Ottenbrite RM.Synthesis of oligo (amino acids)via NCAs and their microsphere formation[J]. J Bioact Comp Polym, 1996, 11: 219.
[收稿日期： 1999-07-16], http://www.100md.com
单位：刘锐玲(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；全红(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；王满元(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；李青山(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)；赵正保(山西医科大学药物化学教研室 太原 030001)
关键词：氨基水杨酸类；结肠炎；微球体；大鼠
山西医科大学学报000117 摘要： 以多氨基酸共聚法，将 L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸合成低分子的聚合物。在酸性条件下将抗溃疡性结肠炎(IBD)药物 5-氨基水杨酸(5-ASA)同聚合物制成控释剂微球。控释剂药物的释放对溶液的 pH 值有强烈的依赖性。紫外分光光度法测定，在酸性条件下，6 h 内，仅有不到 10% 的 5-ASA 被释放出来。当 pH 7.2 时，在 3 h 内，约有 94% 的药物被释放出来。实验结果显示，控释剂微球对抗 IBD 具有良好的靶向作用。
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中图分类号： R944.2+7 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0037-03
Preparation of 5-aminosalicylic acid microsphere and its controlled-release properties in vitro
Liu Ruiling, Quan Hong, Wang Manyuan, et al
(Dept. of Pharmaceutical Chemistry，Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
Abstract： Oligomers consisting of L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-tyrosine and L-phenylalanine were synthesized through the corresponding amino acid. These oligomers can spontaneously encapsulate 5-aminosalicylic acid(5-ASA) and form microsphere under acid condition. The stability of the micorosphere was strongly pH dependent.At low pH, <10% of 5-ASA was released from microsphere in the 6 hours; and at pH 7.2, 94% of 5-ASA was dissolved in the 3 hours. The results suggest that this microsphere has a superior directional and therapeutic effect on inflammation.
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Key words： aminosalicylic acids； colitis,ulcerative; microspheres; rats
5-ASA 可以阻止前列腺素，脂肪氧合酶的合成以及干扰抗体的合成[1]，它可以抑制或还原 IBD 病变部位黄嘌呤氧化酶或白细胞介导的氧自由基形成，如 HOCl 和 ROS[2]。因此 5-ASA 具有抗 IBD 的作用。当 5-ASA 口服给药时，它容易在胃和小肠部分吸收、乙酰化，而由尿液排出，难以达到病变的结肠部位，产生理想的抗炎效果[3]。故有必要发展一种 5-ASA 的载体或控释剂，传递药物到大肠的病变部位，在那里释放出 5-ASA，使之在病变部位的局部达到理想的药物浓度。本文利用氨基酸在低的 pH 值条件下可以交叉缩聚，同时将 5-ASA 包埋在缩聚的微球中，而缩聚的药物微球可以在中性和碱性水溶液中溶解而释放出 5-ASA。考虑到 IBD 患者的胃液和小肠粘液显酸性，病变部位大肠部分显碱性，从而使 5-ASA 尽可能少的在胃和小肠中释放，而在碱性的大肠部分溶解释放出 5-ASA， 达到靶向作用。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器和材料 UV-260 分光光度计(日本岛津)；恒温培养箱(上海医疗器械厂)；GS 12 型电子搅拌器(上海沪南科学仪器厂)。L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和 L-苯丙氨酸由 Fisher 公司购买，直接使用。5-ASA 北京精细化工厂生产，化学纯(95%)，经纯化使用。
1.2 5-ASA 多氨基酸共聚微球的制备 将通过 Yang[4]法制备的 L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和 L-酪氨酸的低聚物，溶解在蒸馏水中(10% W/W)，溶液用 0.2 μm 的滤膜过滤；溶解 5-ASA 在6.5% 的柠檬酸水溶液中，配成含 5-ASA 1.5 mol/L 的柠檬酸溶液，且加入适量乳化剂吐温-80。药物溶液在氮气保护下加热至 40 ℃，然后与相同温度的聚合物水溶液在剧烈搅拌下混合。混合后的乳浊液 pH＝3～3.5，在氮气气氛下，搅拌 30 min 自然冷却，将冷至室温的混合液过滤收集微球。
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1.3 微球中药物含量的测定 将恒重的 5-ASA 原料药配制成不同浓度的溶液，用紫外分光光度法测定在 320 nm 处的吸光度，标准曲线方程为 C=44.633 a+0.998 3(C为浓度 mg/L，a为吸光度)，r2=0.999 3。精密称取 5-ASA 的氨基酸共聚物微球 10 mg，用 pH 9 的 NH3.H2O-NH4Cl 缓冲溶液溶解，置于 10 ml 的容量瓶中，加缓冲溶液至刻度。以空白氨基酸共聚物微球平行处理做为对照，在波长 320 nm 处测定吸光度计算 5-ASA 氨基酸共聚物中药物含量。
1.4 微球体外药物释放测定 将雄性大鼠乙醚麻醉，沿腹正中线切开，取出胃、小肠、大肠组织。用 pH 4.5 的乙酸钠(NaAC)-乙酸(HAC)缓冲溶液冲洗胃组织。用 pH 6.5 的磷酸氢二钠(Na2HPO4)-磷酸(H3PO4)组成的缓冲溶液冲洗小肠部分。用 pH 7.2 Na2HPO4-磷酸二氢钠(NaH2PO4)缓冲溶液冲洗大肠部分。分别在 3 种溶液中加入 5-ASA 微球，使其浓度为 120 mg/L，将它们分别装入 3 支试管中，恒温 37 ℃ 培养 6 h，在一定的时间间隔，取部分样品抽滤，用 UV-260 分光光度计测其滤液在 320 nm 的吸光度，计算其 5-ASA 的释放率。
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2 结果和讨论
实验显示 L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸，当比例为 1∶1∶1∶1，pH 为 3.2 的条件下，可以同 5-ASA 形成很好的微球。1∶6.2 是 5-ASA 和载体的最佳投料比，在此投料比下微球的平均含药量约为 12 %，包封率为 81%。在模拟人体消化道的实验条件中，微球的药物释放测定结果显示，该控释剂对溶液的 pH 值有强烈的依赖关系。在类似与胃和小肠道的条件下 5-ASA 有低的释放率，在 6 h 内<10%。而在大肠条件中释放率随时间的延长迅速增大，3 h 之内可达 94%。本制剂有望成为用 5-ASA 治疗 IBD 的良好口服控释剂型。
实验过程中发现，在酸性条件下，当天冬氨酸、谷氨基、苯丙氨酸、酪氨酸之间的摩尔比为 1∶1∶1∶1 时，可很好的形成共聚微球。这可能是由于酰胺键之间的氢键键合作用，以及支链上憎水基之间的相互作用。在本实验中天门冬氨酸和谷氨酸是聚合物中亲水的和可离子化部分，而含有苯基的苯丙氨酸和酪氨酸是憎水氨基酸。当投料摩尔比为 1∶1∶1∶1 时，亲水基和增水基达到平衡。微球在酸性条件下形成，而在中性和碱性水溶液中溶解，是由于羧酸和它的碱金属盐有非常不同的水溶性，在碱性条件下羧酸基可离子化而溶解。所以改变 pH 值能够有效地改变微球的形成和溶解。
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3 批微球的药物含量及包封率的测定结果显示在表1。其微球平均含药量为(11.77±0.28)%，包封率为(81.15±2.0)%。在同样条件下，用空白实验对微球的载药量进行了回收实验，回收率为 97.35%。微球的载药量、包封率与 5-ASA 和氨基酸聚合物的比例密切相关。当 5-ASA 的聚合物<1∶6.2 时，微球的载药量随 5-ASA 投料的增加而增大，且有较高的包封率。当 5-ASA 和聚合物的比例>1∶6.2时，微球的载药量没有明显的变化。这表明载体的药量已达到平衡，而药物的包封率则随着 5-ASA 投入量的增加而迅速降低。
表1 5-ASA 聚氨基酸微球的药物含量及包封率(%) 编号
理论含约量
实验含药量
包封率
1
, 百拇医药
14.50
11.58
79.86
2
14.50
12.05
83.10
3
14.50
11.67
80.48
图1显示 5-ASA 微球的体外药物释放结果。由图1可见，在模拟人体胃液、小肠和大肠组织粘液条件下，药物 5-ASA 的微球释放结果显示，在 pH≤6.5 的缓冲溶液中 5-ASA 的释放非常缓慢，在 6 h 之内，药物的总释放率<10%。这意味着该控释剂对人体口服给药，在胃和小肠部分仅有少量释放。这部分的药物释放并不是由于氨基酸共聚物中羧基的成盐引起的，而是由胃和肠道细菌蛋白分解酶引起的，而在 pH 7.2 的 Na2HPO4-NaH2PO4 冲洗的大肠溶液中，5-ASA 释放率随时间的延长而明显的增长，3 h 之内 5-ASA 的释放率已达近 94%。这表明本实验制备的 5-ASA 控释剂对溶液的 pH 值有强烈的依赖关系，在碱性条件下，它可以迅速溶解游离出 5-ASA。这对多氨基酸共聚物做为治疗 IBD 药 5-ASA 的载体是非常重要的。它可以保证，5-ASA 通过胃和小肠道部分有尽可能少的释放，而在大肠部分则可以迅速释放。这使 5-ASA 在结肠的病变部位有高的药物浓度，起到良好的靶向作用，达到理想的治疗效果。
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—◆—表示在pH 4.5 NaAC-HAC冲洗的胃液中释放结果
—■—表示在pH 6.5 Na2HPO4-H3PO4冲洗的小肠粘液中释放结果
—▲—表示在pH 7.2 NaH2PO4-NaH2PO4冲洗的大肠粘液中释放结果
图1 5-ASA 氨基酸共聚微球的体外药物释放结果
作者简介： 刘锐玲，女,1959年7月生，大专，主管技师
参考文献：
[1] Milojevic S, Newton JM, Cummings JH, et al. Amylose as a coating for drug delivery to the colon. Preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets[J]. J Control Release, 1996, 38: 75.
, 百拇医药
[2] Goncalves E, Almeida LM， Dinis TCP.Antioxidant activity of 5-aminosalicylic acid against lipid peroxidation in the presence of vitamins C and E[J].Intern J Pharmac, 1998, 172: 219.
[3] Brzezinski A, Rankin GB,Seidner DL, et al.Use of old and new oral 5-aminosalicylic acid formulations in inflammatory bowel disease[J].Clevel Clin J Med, 1995， 42 (5): 317.
[4] Yang JZ, Antoun S, Ottenbrite RM.Synthesis of oligo (amino acids)via NCAs and their microsphere formation[J]. J Bioact Comp Polym, 1996, 11: 219.
[收稿日期： 1999-07-16], http://www.100md.com