茶多酚复合物抑癌及对细胞免疫功能的影响
作者：曹明富 邵惠琴
单位：曹明富(杭州师范学院，杭州310036)；邵惠琴(1浙江省药品检验所，杭州310004)
关键词：茶多酚；抑癌作用；免疫功能；钻瘤作用
摘 要 为探明茶叶提取物
摘 要 为探明茶叶提取物——茶多酚复合物(TPP)抗肿瘤作用及其机理；采用脱咖啡碱的高纯度TPP进行动物体内外抑瘤作用和对细胞免疫功能影响的实验测定。结果表明：EAC或S180鼠分别ig40，80和120mg/(kg.d)的TPP，对EAC的抑制率分别为65.3%，51.0%和48.7%；对S180的抑制率为66.3%，68.5%和59.8%；EAC鼠的胸腺指数比对照组分别提高50.7%，40.6%和19.8%；脾指数提高34.4%，31.1%和20.0%；S180鼠的胸腺指数也分别提高了66.2%，47.2%和48.1%；脾指数也略有增高。离体细胞培养测定TPP对致敏T淋巴细胞的粘瘤和钻瘤活性，结果显示：各TPP组EAC鼠的胸腺或脾淋巴细胞对自体瘤细胞的ATI和ETI均明显高于对照组(P<0.01)。正常小鼠ig60mg/(kg.d)的TPP，连续给药12d后，腹腔M
吞噬CRBC的百分率和吞噬指数比对照组分别增加69.6%和68.7%。因此认为TPP不仅具有明显抑制肿瘤的生长，而且还能增强和调节机体的非特异性免疫功能。
, 百拇医药
Effect of Green Tea Polyphenols on Cellular
Immune Function and Their Antitumor Activity
Cao Mingfu, Shao Huiqin1
(Department of Biology, Hangzhou Teachers College, Hangzhou 310036；
1Institute for Drug Control of Zhejiang Province, Hangzhou 310004)
Abstract The dynamic changes of celluar immune function and anticancer effect of tea polyphenols (TPP) in the mice bearing EAC and S180 tumor were investigat ed. The results showed that at the doses of 40，80 and 120mg/kg.d-1 by ig admin istration for 10 days in the mice bearing tumor, the TPP can inhibit the EAC and S180 tumor growth, markedly increase their thymus and splenic lymphocytes adhe ring to tumor cell and emperipolesis index in vitro cultures (P<0.01). The experi mental results also indicated that the TPP could increase the phagocytosis of macrophage, at adose of 60mg/kg by igadministration for 12 days in no rmal mice. It suggested that anticarcinogenic mechanism of TPP possibly included both cellular immune function and inhibition of tumor growth.
, 百拇医药
Key Words Tea polyphenols, Antitumor effect, Immunologic function , Emperipolesis
近年来，对茶叶及其提取物抗肿瘤作用的研究已取得了较大进展[1]，动物体内外实验结果均已证明：茶叶中含有抗肿瘤作用的活性成份。据报道茶叶及其提取物的抑癌作用除消除体内过量自由基，阻断致癌过程和直接杀死癌细胞外，还可能是通过增强机体免疫功能来抑制体内癌细胞的增长[2]。为进一步探明绿茶提取物中抗肿瘤作用的主要有效活性组分及其可能机制，本研究采用脱咖啡碱的高纯度绿茶多酚类化合物进行动物体内外的抑癌作用和对细胞免疫功能影响的实验测定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 NIH小白鼠由浙江省中医药研究院动物室提供，体重18±1g，雌雄兼用，鼠龄7～8wk。
, 百拇医药
1.1.2 茶多酚复合物(Tea Polyphenols, TPP) 由浙江农业大学茶学系采用专利工艺(CN1043730A)制备。为浅褐色粉末，多酚类化合物含量>95%，对小白鼠的LD50为2496±326mg/kg。
1.1.3 肿瘤模型 Ehrlich Ascitic Carinomai(EAC)和Sarcoma180(S180)均由浙江省医学科学院肿瘤研究室提供，按移植性实验肿瘤研究法给供试动物接种。
1.1.4 细胞培养液 在RPMI1640培养基中加入4mmol/LL-谷氨酰胺，25mmol/LHepes，5×10-5β-巯基乙醇，即为基础液；按Martin[2]方法制备条件液，在10%小牛血清中加20%条件液的基础液，即为工作培养液，内含conA5μg/ml。
1.1.5 5%鸡红细胞(CRBC)悬浮液 从公鸡静脉抽取血液，与Alsever's液混均匀，置冰箱中保存，临用前，用无菌生理盐水离心洗涤后，配制成5%的CRBC悬浮液。
, 百拇医药
1.1.6 试剂 阿氏液(Alesever'ssol)，汉氏液(Hank'ssol),Giemsa-Wright染液，甲醇，台酚蓝，生理盐水等，按文献[5]制备。
1.2 方 法
1.2.1 动物体内抑瘤试验 按移植性肿瘤实验方法给小鼠接种肿瘤，24h后称体重，随机分成四组，每组12只小鼠，分设1个对照组和3个TPP给药组，给药Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ组分别ig40，80和120mg/(kg.d)剂量的TPP，对照组ig等体积的生理盐水，连续给药10d，停药24h后，解剖出肿瘤组织，称瘤重；测定每克瘤的细胞数，然后算出各TPP给药组的抑瘤率。
1.2.2 免疫器官重量及细胞数的测定 荷瘤小鼠给药方式和剂量同“抑瘤试验”，停药24h后，称体重，在测抑瘤作用的同时，解剖出瘤鼠胸腺和脾脏，称湿重。按文献[5]的方法，计算胸腺指数、脾指数，并测出每克免疫器官的细胞数。
, 百拇医药
1.2.3 致敏T淋巴细胞钻瘤作用的测定 小鼠移植腹水型肿瘤EAC24h后，随机分成四组，每组5只小鼠，即1个对照组和3个TPP给药组，给药Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ组分别ig40，80和120mg/(kg.d)剂量的TPP，对照组ig生理盐水，给药10d后，在无菌操作下，解剖出荷瘤鼠的胸腺、脾脏和EAC，用工作培养液分别制成细胞悬浮液，预培养4h，除去巨噬细胞，调细胞浓度为5×106细胞/ml(免疫细胞)和5×105细胞/ml(EAC)。将胸腺或脾淋巴细胞分别与EAC等体积混合，分装于培养瓶内(2ml/瓶)，置37℃下边培养边观察，每隔1h计数200个以上的瘤细胞和淋巴细胞粘着及钻入瘤细胞数，按下列公式计算出粘瘤指数(Adhension Tumor Cell Index，简称ATI)和钻瘤指数(Emperipolesis Tumor Cell Index，简称ETI)。
粘(钻)瘤指数(%)=
, 百拇医药
1.2.4 腹腔巨噬细胞(M)吞噬功能的测定 将小鼠随机分2组，每组5只，即1个对照组和1个TPP给药组，给药组ig60mg/(kg.d)的TPP，对照组ig生理盐水，连续给药12d，在收集小鼠腹腔M前12h，ip5%CRBC0.2ml/只，处死小鼠前ip2.5ml/只汉氏液，然后处死小鼠吸取腹腔细胞液，置于载玻片上，置37℃孵育3min，用生理盐水冲洗载片，干燥后用甲醇固定，Giemsa-Wright液染色，玻片标本干燥后，镜检，计数M总数和其中吞噬CRBC的M数，并按下列公式计算巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数：
, 百拇医药
吞噬百分率=吞噬CRBC的M数/100个M数
吞噬指数=100个M所吞噬CRBC的总数/100
2 结果与分析
2.1 TPP的抑瘤作用
EAC鼠或S180鼠，连续igTPP10d后，对腹水型肿瘤EAC和实体型肿瘤S180均具有明显的抑制作用(如表1)，在3个剂量的TPP组中的瘤重比对照组(CK)明显降低(P<0.01)，其中对EAC的抑制率以40mg/(kg.d)的剂量组最为明显，而对S180的抑制作用以80mg/(kg.d)TPP剂量组为最佳。重复实验也说明，TPP对不同类型的肿瘤的抑制作用的最适剂量是有差异的。
, 百拇医药
Tab 1 The inhibition effect of TPP on growth of tumor in mice
Tumor
Groups
Dose of TPP
(mg/(kg.d))
No of mice
(Begin/End)
Weight of tumor
(
±s mg)
, 百拇医药
Inhibitory rate
(%)
EAC
CK
0
12/12
5.14±0.81
0
Ⅰ
40
12/12
1.79±0.67
65.2**
, http://www.100md.com
Ⅱ
80
12/11
2.52±0.74
51.0**
Ⅲ
120
12/10
2.64±0.82
48.7**
S180
CK
, 百拇医药
0
12/12
0.92±0.52
0
Ⅰ
40
12/12
0.31±0.26
66.3**
Ⅱ
80
12/12
0.28±0.09
, 百拇医药
68.5**
Ⅲ
120
12/11
0.39±0.13
59.8**
**P<0.01(Comparision with CK group)
对EAC细胞数测定结果(如表2)也表明：不同剂量的TPP对EAC的细胞增殖均具有明显的抑制 作用，3个TPP组的每克EAC的细胞数明显低于对照组(P<0.01)。
Tab 2 Inhibition effect of TPP on growth
, 百拇医药
of Ehrlich ascitic carinomai in mice
Groups
Dose of TPP
(mg/kg.d)
No. Of mice
(Begin/End)
No. Of EAC
(Cell/g)
Inhibitory rate
(%)
CK
, http://www.100md.com
0
12/12
23.26×107
0
Ⅰ
40
12/12
4.32×107
81.4**
Ⅱ
80
12/11
, 百拇医药
5.36×107
71.0**
Ⅲ
120
12/10
11.52×107
50.5**
**P<0.01(Comparision with CK group)
2.2 TPP对荷瘤小鼠免疫器官重量及细胞数的影响
小鼠荷瘤后，免疫器官逐渐萎缩，淋巴细胞减少。当荷瘤小鼠ig不同剂量的TPP后，免疫器官萎缩程度减慢，与病理对照组比较，荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数有明显提高(如表3)。EAC鼠ig40，80和120mg/(kg.d)TPP10d后，其胸腺指数分别提高50.7%，40.6%和19.8%；脾指数也分别提高34.4%，31.7%和21.0%。S180鼠胸腺指数分别提高66.2%，47.2%和48.1%；脾指数增加14.1%，6.67%和4.32%，EAC鼠和S180鼠的TPP给药组的每克胸腺细胞数和每克脾细胞数也比荷瘤鼠对照组均有明显提高(P<0.05)，这表明TPP具有促进免疫细胞增殖作用。
, 百拇医药
Tab 3 Effect of ig TPP on spleen and thymus weight
or number of immunocyte f rom tumor-bearing mice(n=12/group)
Tumor
-bearing
Dose of TPP
(mg/(kg.d))
Relative Wt.
(±s mg/10g.b.w)
, http://www.100md.com
No. of Cell
(±s×108/g)
Thymus
Spleen
Thymus
Spleen
EAC
Mice
0
20.7±2.3
, 百拇医药
67.4±6.4
5.6 ±0.82
9.6±0.86
40×10
31.2±4.2*
79.0±5.1
19.5±0.96*
10.9±1.10*
80×10
29.1±2.6
75.2±4.3
, 百拇医药
9.5±0.78*
15.5±1.32*
120×10
24.8±2.1*
74. 3±6.2
8.1±0.64*
11.8 ±0.92*
S180
Mice
0
23.1±3.4
, http://www.100md.com
78.0 ±5.2
4.29±0.83
9.2±0.76*
40×10
38.4±2.3*
89.0±3.0*
12.9±1.21*
12.1±0.52*
80×10
34.0±4.2*
, 百拇医药
83.2 ±4.1
7.46±0.67*
11.8±0.41*
120×10
34.2±2.6*
81 .3±5.3
10.21±1.34*
10.8 ±0.56*
* P<0.05 ** P<0.01 (Comparis ion with control group)
, 百拇医药
2.3 TPP对荷瘤小鼠胸腺淋巴细胞钻瘤作用的影响
荷瘤小鼠的胸腺淋巴细胞和自体瘤细胞混合培养1h后，在光镜下可观察到被致敏的淋巴细胞主动向瘤细胞移动，并包围瘤细胞，一个瘤细胞可与一个或多个淋巴细胞相互粘连在一起形成紧密的结合体或使瘤细胞表面形成不规则突起或向内凹陷，随着培养时间延长，皱缩趋向严重，瘤细胞内出现大量颗粒，被致敏的T淋巴细胞钻入瘤细胞，使瘤细胞发生裂解。淋巴细胞的钻瘤或粘瘤指数随着培养时间的变化而改变。当培养到3h达到最高峰，EAC小鼠ig40，80和120mg/(kg.d)TPP，给药10d后，在体外细胞混合培养中，其胸腺淋巴细胞的ATI和ETI均明显高于对照组(如表4)。
Tab 4 Effect of TPP on ATI and ETI of thymus
lymphocytes from tumor-bearing mice(n=5/group)
, 百拇医药
Cultures time
(h)
ATI or ETI
(%)
Exp. Groups
CK
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
1
ATI
3.70±0.6
12.25±1.6**
, 百拇医药
10.75±1.4**
7.25±1.3**
ETI
1.75±0.4
7.10±1.2**
6.75±0.9**
5.00±0.8**
2
ATI
5.00±0.8
18.00±2.1**
, 百拇医药
11.25±1.2**
9.25±1.2**
ETI
2.75±0.5
17.75±1.6**
10.00±1.1**
6.75±0.7**
3
ATI
5.75±0.6
18.25±1.4**
, 百拇医药
12.10±1.2**
10.5±1.0**
ETI
3.00±0.7
18.50±1.8**
11.50±1.3**
7.75±0.9**
*P<0.05 ** P<0.01 (Comparision with CK group)
2.4 TPP对荷瘤小鼠脾淋巴细胞钻瘤作用的影响
, http://www.100md.com
荷瘤小鼠脾淋巴细胞对自体瘤的粘瘤和钻瘤行为与胸腺淋巴细胞是一致的，但脾淋巴细胞的钻瘤指数稍高于胸腺淋巴细胞，EAC鼠ig80mg/(kg*d)的TPP后，给药10d时，其脾淋巴细胞在体外与肿瘤(EAC)细胞混合培养1至3h内的ATI和ETI也均明显高于对照组(如表5)。
Tab5 Effect of TPP on ATI and ETI of Splenic
lymphocytes from tum or-bearing mice
Cultures
time
(h)
ATI or
ETI
, http://www.100md.com
(%)
Exp. Groups
Control group
TPP group
1
ATI
4.60±1.1
9.31±1.4*
ETI
2.53±0.7
7.12±0.8**
2
, 百拇医药
ATI
6.78±1.3
12.21±2.1*
ETI
5.43±1.4
15.32±2.3**
3
ATI
7.23±2.1
17.81±2.6*
ETI
6.13±1.8
, 百拇医药
18.60± 2.5**
*P<0.05 ** P<0.01 (Comparision with control group)
2.5 TPP对正常小鼠腹腔M吞噬功能的影响
正常小鼠ig60mg/(kg.d)的TPP，连续给药12d测得的腹腔M吞噬CRBC的吞噬百分率和吞噬指数均明显高于对照组(如表6)。第一次试验中TPP给药组的吞噬百分率比对照组提高73.0%，重复试验时，TPP组M吞噬百分率比对照组提高66.4%，吞噬指数提高70.1%。
, 百拇医药
Tab 6 Effect of TPP on the phagocytosis of macrophage in mice
Exp.
group
Dose of TPP
(mg/(kg.d))
phagocytosis (±s)
Percentage
(%)
, 百拇医药
Index
1
CK
0
34.36±2.47
0.89±0.21
TTP
60×12
59.40±7.13*
1.40±0.16*
2
CK
, http://www.100md.com
0
38.60±2.90
0.97 ± 0.38
TTP
60×12
64.23±4.46**
1.65±0.46*
*P<0.05 ** P<0.01(comparision with CK group)3 讨 论
小鼠在荷瘤后，其胸腺淋巴细胞增殖受损，胸腺萎缩，淋巴细胞转化率逐渐降低，当ig一定剂量的TPP后，其胸腺相对重量和每克胸腺的细胞数增加。这说明TPP具有延缓胸腺衰退，保护淋巴细胞受损、或能促进胸腺淋巴细胞增殖的活性。荷瘤小鼠的肿瘤细胞对脾脏也发生损害作用，随着肿瘤的增长，脾的相对重量和每克脾的细胞数均有下降，TPP试验组瘤鼠脾脏的相对重量和细胞数比对照组均有提高。脾脏是机体的免疫和造血器官，TPP对免疫功能的调整可能是通过脾脏造血组织中原始细胞向T细胞分化的结果。本研究中采用的三个剂量，分别为1/60LD50，1/30LD50和1/20LD50，经初试这三个剂量抑瘤效果明显，但实验中低剂量TPP对瘤鼠免疫功能增强作用比高剂量TPP组明显，这说明TPP抗肿瘤，提高机体免疫力有一最适作用剂量，高剂量TPP可能对正常细胞有不良作用[9]，有关TPP的最适作用剂量有待进一步实验。
, 百拇医药
肿瘤宿主自身具有抗肿瘤能力，其中体内被致敏的T淋巴细胞具有杀伤肿瘤细胞的作用，虞研原等报道致敏的T淋巴细胞在离体条件下与肿瘤细胞混合培养中，T淋巴细胞主动向瘤细胞移动，接着相互粘着，最后钻入瘤细胞内使瘤细胞解体[7]，而本实验结果也表明：TPP在体内外均有促进胸腺或脾淋巴细胞增殖或致敏作用，可以明显提高混合细胞培养中淋巴细胞的ATI和ETI。
动物的巨噬细胞(M)是一种多潜能细胞，它具有吞噬异物，处理抗原等多种功能，实验用CRBC作为一种异物注入小鼠腹腔后，M会将其吞噬并逐渐消化，这可反映机体非特异性免疫功能状态。小鼠每日ig60mg/kg剂量的TPP还可使腹腔M对CRBC的吞噬百分率及吞噬指数明显提高，因此，TPP中可能存在有非特异性因子能激活M，增强机体非特异性免疫功能。
, 百拇医药
实验结果揭示：TPP不仅具有明显的抗肿瘤活性，而且还是一种免疫增强剂，这与Sakanaga等报道的TPP可促进淋巴细胞增殖，增强机体免疫力的结果相一致的。因此，TPP作为茶叶防癌抗癌作用的主要活性成分，除清除过量自由基、阻断致癌反应、直接杀伤癌细胞和抑制癌细胞DNA合成外，还可能通过保护或调整机体免疫系统，促进免疫细胞增殖和生长，增强机体的细胞免疫功能来间接抑制体内癌细胞的增长。
致 谢 本试验在杭州大学虞研原教授、浙江农业大学杨贤强教授支持和帮助下进行，杭州师范学院生物系学生夏建荣、陈季颖等同学参加部分测定工作，谨此致谢!
浙江省高校科研启动基金资助项目
参考文献
1 章华雯.茶叶及其提取物防癌抗癌作用研究进展.国外医学肿瘤学分册，1998，25(4)：200
, http://www.100md.com
2 Martin G, Fredrik I, Antonio C. Regulation of T cell growth Factor producti on: Arrest of TCGF production after 18 hours in normal lection-stimulated mouse sp leen cell cultures. J Immunology, 1981, 127(2): 407
3 曹明富, 杨贤强, 虞研原. 绿茶多酚类化合物抗肿瘤作用研究. 科技通报， 1992，8(4)：203
4 Katiyar S K, Agarwa R, Wang Z Y .Epigallocatechin-3-gallate in Camellia sinensis lesves from Himalayan region of sikim: inhibitory effects against biochemical events and tumor initiation in SENCAR mouse skin. Nutri Cancer, 1992, 18(1):73
, 百拇医药
5 徐淑云主编. 药理学实验方法.北京:人民卫生出版社. 1982.
6 杨贤强，曹明富，沈生荣，等.茶多酚生物学活性的研究. 茶叶科学，1993，13(1)：51
7 虞研原.艾氏腹水癌细胞对胸腺淋巴细胞钻瘤作用的敏感性.中国免疫学杂志，1990, 6(1)：39
8 詹勇, 李进昌, 杨贤强.茶多酚(TP)对家禽免疫功能的研究.浙江农业大学学报，1992，18(4)：74
9 沈生荣，杨贤强，赵保路,等.茶多酚体外助氧化作用的自由基机理. 茶叶科学，1992，12(2)：145
10 Sakanaga S. Study of tea polyphenols in the immune responses of poulty. Agric Biol Chem,1989, 53(9): 2307
收稿日期：1999-2-12, http://www.100md.com
单位：曹明富(杭州师范学院，杭州310036)；邵惠琴(1浙江省药品检验所，杭州310004)
关键词：茶多酚；抑癌作用；免疫功能；钻瘤作用
摘 要 为探明茶叶提取物
摘 要 为探明茶叶提取物——茶多酚复合物(TPP)抗肿瘤作用及其机理；采用脱咖啡碱的高纯度TPP进行动物体内外抑瘤作用和对细胞免疫功能影响的实验测定。结果表明：EAC或S180鼠分别ig40，80和120mg/(kg.d)的TPP，对EAC的抑制率分别为65.3%，51.0%和48.7%；对S180的抑制率为66.3%，68.5%和59.8%；EAC鼠的胸腺指数比对照组分别提高50.7%，40.6%和19.8%；脾指数提高34.4%，31.1%和20.0%；S180鼠的胸腺指数也分别提高了66.2%，47.2%和48.1%；脾指数也略有增高。离体细胞培养测定TPP对致敏T淋巴细胞的粘瘤和钻瘤活性，结果显示：各TPP组EAC鼠的胸腺或脾淋巴细胞对自体瘤细胞的ATI和ETI均明显高于对照组(P<0.01)。正常小鼠ig60mg/(kg.d)的TPP，连续给药12d后，腹腔M
吞噬CRBC的百分率和吞噬指数比对照组分别增加69.6%和68.7%。因此认为TPP不仅具有明显抑制肿瘤的生长，而且还能增强和调节机体的非特异性免疫功能。, 百拇医药
Effect of Green Tea Polyphenols on Cellular
Immune Function and Their Antitumor Activity
Cao Mingfu, Shao Huiqin1
(Department of Biology, Hangzhou Teachers College, Hangzhou 310036；
1Institute for Drug Control of Zhejiang Province, Hangzhou 310004)
Abstract The dynamic changes of celluar immune function and anticancer effect of tea polyphenols (TPP) in the mice bearing EAC and S180 tumor were investigat ed. The results showed that at the doses of 40，80 and 120mg/kg.d-1 by ig admin istration for 10 days in the mice bearing tumor, the TPP can inhibit the EAC and S180 tumor growth, markedly increase their thymus and splenic lymphocytes adhe ring to tumor cell and emperipolesis index in vitro cultures (P<0.01). The experi mental results also indicated that the TPP could increase the phagocytosis of macrophage, at adose of 60mg/kg by igadministration for 12 days in no rmal mice. It suggested that anticarcinogenic mechanism of TPP possibly included both cellular immune function and inhibition of tumor growth.
, 百拇医药
Key Words Tea polyphenols, Antitumor effect, Immunologic function , Emperipolesis
近年来，对茶叶及其提取物抗肿瘤作用的研究已取得了较大进展[1]，动物体内外实验结果均已证明：茶叶中含有抗肿瘤作用的活性成份。据报道茶叶及其提取物的抑癌作用除消除体内过量自由基，阻断致癌过程和直接杀死癌细胞外，还可能是通过增强机体免疫功能来抑制体内癌细胞的增长[2]。为进一步探明绿茶提取物中抗肿瘤作用的主要有效活性组分及其可能机制，本研究采用脱咖啡碱的高纯度绿茶多酚类化合物进行动物体内外的抑癌作用和对细胞免疫功能影响的实验测定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 NIH小白鼠由浙江省中医药研究院动物室提供，体重18±1g，雌雄兼用，鼠龄7～8wk。
, 百拇医药
1.1.2 茶多酚复合物(Tea Polyphenols, TPP) 由浙江农业大学茶学系采用专利工艺(CN1043730A)制备。为浅褐色粉末，多酚类化合物含量>95%，对小白鼠的LD50为2496±326mg/kg。
1.1.3 肿瘤模型 Ehrlich Ascitic Carinomai(EAC)和Sarcoma180(S180)均由浙江省医学科学院肿瘤研究室提供，按移植性实验肿瘤研究法给供试动物接种。
1.1.4 细胞培养液 在RPMI1640培养基中加入4mmol/LL-谷氨酰胺，25mmol/LHepes，5×10-5β-巯基乙醇，即为基础液；按Martin[2]方法制备条件液，在10%小牛血清中加20%条件液的基础液，即为工作培养液，内含conA5μg/ml。
1.1.5 5%鸡红细胞(CRBC)悬浮液 从公鸡静脉抽取血液，与Alsever's液混均匀，置冰箱中保存，临用前，用无菌生理盐水离心洗涤后，配制成5%的CRBC悬浮液。
, 百拇医药
1.1.6 试剂 阿氏液(Alesever'ssol)，汉氏液(Hank'ssol),Giemsa-Wright染液，甲醇，台酚蓝，生理盐水等，按文献[5]制备。
1.2 方 法
1.2.1 动物体内抑瘤试验 按移植性肿瘤实验方法给小鼠接种肿瘤，24h后称体重，随机分成四组，每组12只小鼠，分设1个对照组和3个TPP给药组，给药Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ组分别ig40，80和120mg/(kg.d)剂量的TPP，对照组ig等体积的生理盐水，连续给药10d，停药24h后，解剖出肿瘤组织，称瘤重；测定每克瘤的细胞数，然后算出各TPP给药组的抑瘤率。
1.2.2 免疫器官重量及细胞数的测定 荷瘤小鼠给药方式和剂量同“抑瘤试验”，停药24h后，称体重，在测抑瘤作用的同时，解剖出瘤鼠胸腺和脾脏，称湿重。按文献[5]的方法，计算胸腺指数、脾指数，并测出每克免疫器官的细胞数。
, 百拇医药
1.2.3 致敏T淋巴细胞钻瘤作用的测定 小鼠移植腹水型肿瘤EAC24h后，随机分成四组，每组5只小鼠，即1个对照组和3个TPP给药组，给药Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ组分别ig40，80和120mg/(kg.d)剂量的TPP，对照组ig生理盐水，给药10d后，在无菌操作下，解剖出荷瘤鼠的胸腺、脾脏和EAC，用工作培养液分别制成细胞悬浮液，预培养4h，除去巨噬细胞，调细胞浓度为5×106细胞/ml(免疫细胞)和5×105细胞/ml(EAC)。将胸腺或脾淋巴细胞分别与EAC等体积混合，分装于培养瓶内(2ml/瓶)，置37℃下边培养边观察，每隔1h计数200个以上的瘤细胞和淋巴细胞粘着及钻入瘤细胞数，按下列公式计算出粘瘤指数(Adhension Tumor Cell Index，简称ATI)和钻瘤指数(Emperipolesis Tumor Cell Index，简称ETI)。
粘(钻)瘤指数(%)=
, 百拇医药
1.2.4 腹腔巨噬细胞(M
)吞噬功能的测定 将小鼠随机分2组，每组5只，即1个对照组和1个TPP给药组，给药组ig60mg/(kg.d)的TPP，对照组ig生理盐水，连续给药12d，在收集小鼠腹腔M前12h，ip5%CRBC0.2ml/只，处死小鼠前ip2.5ml/只汉氏液，然后处死小鼠吸取腹腔细胞液，置于载玻片上，置37℃孵育3min，用生理盐水冲洗载片，干燥后用甲醇固定，Giemsa-Wright液染色，玻片标本干燥后，镜检，计数M总数和其中吞噬CRBC的M数，并按下列公式计算巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数：, 百拇医药
吞噬百分率=吞噬CRBC的M
数/100个M数吞噬指数=100个M
所吞噬CRBC的总数/1002 结果与分析
2.1 TPP的抑瘤作用
EAC鼠或S180鼠，连续igTPP10d后，对腹水型肿瘤EAC和实体型肿瘤S180均具有明显的抑制作用(如表1)，在3个剂量的TPP组中的瘤重比对照组(CK)明显降低(P<0.01)，其中对EAC的抑制率以40mg/(kg.d)的剂量组最为明显，而对S180的抑制作用以80mg/(kg.d)TPP剂量组为最佳。重复实验也说明，TPP对不同类型的肿瘤的抑制作用的最适剂量是有差异的。
, 百拇医药
Tab 1 The inhibition effect of TPP on growth of tumor in mice
Tumor
Groups
Dose of TPP
(mg/(kg.d))
No of mice
(Begin/End)
Weight of tumor
(
±s mg), 百拇医药
Inhibitory rate
(%)
EAC
CK
0
12/12
5.14±0.81
0
Ⅰ
40
12/12
1.79±0.67
65.2**
, http://www.100md.com
Ⅱ
80
12/11
2.52±0.74
51.0**
Ⅲ
120
12/10
2.64±0.82
48.7**
S180
CK
, 百拇医药
0
12/12
0.92±0.52
0
Ⅰ
40
12/12
0.31±0.26
66.3**
Ⅱ
80
12/12
0.28±0.09
, 百拇医药
68.5**
Ⅲ
120
12/11
0.39±0.13
59.8**
**P<0.01(Comparision with CK group)
对EAC细胞数测定结果(如表2)也表明：不同剂量的TPP对EAC的细胞增殖均具有明显的抑制 作用，3个TPP组的每克EAC的细胞数明显低于对照组(P<0.01)。
Tab 2 Inhibition effect of TPP on growth
, 百拇医药
of Ehrlich ascitic carinomai in mice
Groups
Dose of TPP
(mg/kg.d)
No. Of mice
(Begin/End)
No. Of EAC
(Cell/g)
Inhibitory rate
(%)
CK
, http://www.100md.com
0
12/12
23.26×107
0
Ⅰ
40
12/12
4.32×107
81.4**
Ⅱ
80
12/11
, 百拇医药
5.36×107
71.0**
Ⅲ
120
12/10
11.52×107
50.5**
**P<0.01(Comparision with CK group)
2.2 TPP对荷瘤小鼠免疫器官重量及细胞数的影响
小鼠荷瘤后，免疫器官逐渐萎缩，淋巴细胞减少。当荷瘤小鼠ig不同剂量的TPP后，免疫器官萎缩程度减慢，与病理对照组比较，荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数有明显提高(如表3)。EAC鼠ig40，80和120mg/(kg.d)TPP10d后，其胸腺指数分别提高50.7%，40.6%和19.8%；脾指数也分别提高34.4%，31.7%和21.0%。S180鼠胸腺指数分别提高66.2%，47.2%和48.1%；脾指数增加14.1%，6.67%和4.32%，EAC鼠和S180鼠的TPP给药组的每克胸腺细胞数和每克脾细胞数也比荷瘤鼠对照组均有明显提高(P<0.05)，这表明TPP具有促进免疫细胞增殖作用。
, 百拇医药
Tab 3 Effect of ig TPP on spleen and thymus weight
or number of immunocyte f rom tumor-bearing mice(n=12/group)
Tumor
-bearing
Dose of TPP
(mg/(kg.d))
Relative Wt.
(
±s mg/10g.b.w), http://www.100md.com
No. of Cell
(
±s×108/g)Thymus
Spleen
Thymus
Spleen
EAC
Mice
0
20.7±2.3
, 百拇医药
67.4±6.4
5.6 ±0.82
9.6±0.86
40×10
31.2±4.2*
79.0±5.1
19.5±0.96*
10.9±1.10*
80×10
29.1±2.6
75.2±4.3
, 百拇医药
9.5±0.78*
15.5±1.32*
120×10
24.8±2.1*
74. 3±6.2
8.1±0.64*
11.8 ±0.92*
S180
Mice
0
23.1±3.4
, http://www.100md.com
78.0 ±5.2
4.29±0.83
9.2±0.76*
40×10
38.4±2.3*
89.0±3.0*
12.9±1.21*
12.1±0.52*
80×10
34.0±4.2*
, 百拇医药
83.2 ±4.1
7.46±0.67*
11.8±0.41*
120×10
34.2±2.6*
81 .3±5.3
10.21±1.34*
10.8 ±0.56*
* P<0.05 ** P<0.01 (Comparis ion with control group)
, 百拇医药
2.3 TPP对荷瘤小鼠胸腺淋巴细胞钻瘤作用的影响
荷瘤小鼠的胸腺淋巴细胞和自体瘤细胞混合培养1h后，在光镜下可观察到被致敏的淋巴细胞主动向瘤细胞移动，并包围瘤细胞，一个瘤细胞可与一个或多个淋巴细胞相互粘连在一起形成紧密的结合体或使瘤细胞表面形成不规则突起或向内凹陷，随着培养时间延长，皱缩趋向严重，瘤细胞内出现大量颗粒，被致敏的T淋巴细胞钻入瘤细胞，使瘤细胞发生裂解。淋巴细胞的钻瘤或粘瘤指数随着培养时间的变化而改变。当培养到3h达到最高峰，EAC小鼠ig40，80和120mg/(kg.d)TPP，给药10d后，在体外细胞混合培养中，其胸腺淋巴细胞的ATI和ETI均明显高于对照组(如表4)。
Tab 4 Effect of TPP on ATI and ETI of thymus
lymphocytes from tumor-bearing mice(n=5/group)
, 百拇医药
Cultures time
(h)
ATI or ETI
(%)
Exp. Groups
CK
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
1
ATI
3.70±0.6
12.25±1.6**
, 百拇医药
10.75±1.4**
7.25±1.3**
ETI
1.75±0.4
7.10±1.2**
6.75±0.9**
5.00±0.8**
2
ATI
5.00±0.8
18.00±2.1**
, 百拇医药
11.25±1.2**
9.25±1.2**
ETI
2.75±0.5
17.75±1.6**
10.00±1.1**
6.75±0.7**
3
ATI
5.75±0.6
18.25±1.4**
, 百拇医药
12.10±1.2**
10.5±1.0**
ETI
3.00±0.7
18.50±1.8**
11.50±1.3**
7.75±0.9**
*P<0.05 ** P<0.01 (Comparision with CK group)
2.4 TPP对荷瘤小鼠脾淋巴细胞钻瘤作用的影响
, http://www.100md.com
荷瘤小鼠脾淋巴细胞对自体瘤的粘瘤和钻瘤行为与胸腺淋巴细胞是一致的，但脾淋巴细胞的钻瘤指数稍高于胸腺淋巴细胞，EAC鼠ig80mg/(kg*d)的TPP后，给药10d时，其脾淋巴细胞在体外与肿瘤(EAC)细胞混合培养1至3h内的ATI和ETI也均明显高于对照组(如表5)。
Tab5 Effect of TPP on ATI and ETI of Splenic
lymphocytes from tum or-bearing mice
Cultures
time
(h)
ATI or
ETI
, http://www.100md.com
(%)
Exp. Groups
Control group
TPP group
1
ATI
4.60±1.1
9.31±1.4*
ETI
2.53±0.7
7.12±0.8**
2
, 百拇医药
ATI
6.78±1.3
12.21±2.1*
ETI
5.43±1.4
15.32±2.3**
3
ATI
7.23±2.1
17.81±2.6*
ETI
6.13±1.8
, 百拇医药
18.60± 2.5**
*P<0.05 ** P<0.01 (Comparision with control group)
2.5 TPP对正常小鼠腹腔M
吞噬功能的影响正常小鼠ig60mg/(kg.d)的TPP，连续给药12d测得的腹腔M
吞噬CRBC的吞噬百分率和吞噬指数均明显高于对照组(如表6)。第一次试验中TPP给药组的吞噬百分率比对照组提高73.0%，重复试验时，TPP组M吞噬百分率比对照组提高66.4%，吞噬指数提高70.1%。, 百拇医药
Tab 6 Effect of TPP on the phagocytosis of macrophage in mice
Exp.
group
Dose of TPP
(mg/(kg.d))
phagocytosis (
±s)Percentage
(%)
, 百拇医药
Index
1
CK
0
34.36±2.47
0.89±0.21
TTP
60×12
59.40±7.13*
1.40±0.16*
2
CK
, http://www.100md.com
0
38.60±2.90
0.97 ± 0.38
TTP
60×12
64.23±4.46**
1.65±0.46*
*P<0.05 ** P<0.01(comparision with CK group)3 讨 论
小鼠在荷瘤后，其胸腺淋巴细胞增殖受损，胸腺萎缩，淋巴细胞转化率逐渐降低，当ig一定剂量的TPP后，其胸腺相对重量和每克胸腺的细胞数增加。这说明TPP具有延缓胸腺衰退，保护淋巴细胞受损、或能促进胸腺淋巴细胞增殖的活性。荷瘤小鼠的肿瘤细胞对脾脏也发生损害作用，随着肿瘤的增长，脾的相对重量和每克脾的细胞数均有下降，TPP试验组瘤鼠脾脏的相对重量和细胞数比对照组均有提高。脾脏是机体的免疫和造血器官，TPP对免疫功能的调整可能是通过脾脏造血组织中原始细胞向T细胞分化的结果。本研究中采用的三个剂量，分别为1/60LD50，1/30LD50和1/20LD50，经初试这三个剂量抑瘤效果明显，但实验中低剂量TPP对瘤鼠免疫功能增强作用比高剂量TPP组明显，这说明TPP抗肿瘤，提高机体免疫力有一最适作用剂量，高剂量TPP可能对正常细胞有不良作用[9]，有关TPP的最适作用剂量有待进一步实验。
, 百拇医药
肿瘤宿主自身具有抗肿瘤能力，其中体内被致敏的T淋巴细胞具有杀伤肿瘤细胞的作用，虞研原等报道致敏的T淋巴细胞在离体条件下与肿瘤细胞混合培养中，T淋巴细胞主动向瘤细胞移动，接着相互粘着，最后钻入瘤细胞内使瘤细胞解体[7]，而本实验结果也表明：TPP在体内外均有促进胸腺或脾淋巴细胞增殖或致敏作用，可以明显提高混合细胞培养中淋巴细胞的ATI和ETI。
动物的巨噬细胞(M
)是一种多潜能细胞，它具有吞噬异物，处理抗原等多种功能，实验用CRBC作为一种异物注入小鼠腹腔后，M会将其吞噬并逐渐消化，这可反映机体非特异性免疫功能状态。小鼠每日ig60mg/kg剂量的TPP还可使腹腔M对CRBC的吞噬百分率及吞噬指数明显提高，因此，TPP中可能存在有非特异性因子能激活M，增强机体非特异性免疫功能。, 百拇医药
实验结果揭示：TPP不仅具有明显的抗肿瘤活性，而且还是一种免疫增强剂，这与Sakanaga等报道的TPP可促进淋巴细胞增殖，增强机体免疫力的结果相一致的。因此，TPP作为茶叶防癌抗癌作用的主要活性成分，除清除过量自由基、阻断致癌反应、直接杀伤癌细胞和抑制癌细胞DNA合成外，还可能通过保护或调整机体免疫系统，促进免疫细胞增殖和生长，增强机体的细胞免疫功能来间接抑制体内癌细胞的增长。
致 谢 本试验在杭州大学虞研原教授、浙江农业大学杨贤强教授支持和帮助下进行，杭州师范学院生物系学生夏建荣、陈季颖等同学参加部分测定工作，谨此致谢!
浙江省高校科研启动基金资助项目
参考文献
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, http://www.100md.com
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4 Katiyar S K, Agarwa R, Wang Z Y .Epigallocatechin-3-gallate in Camellia sinensis lesves from Himalayan region of sikim: inhibitory effects against biochemical events and tumor initiation in SENCAR mouse skin. Nutri Cancer, 1992, 18(1):73
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收稿日期：1999-2-12, http://www.100md.com