β地中海贫血多突变位点多聚酶链反应与反向斑点杂交基因分析
作者：龚五星 王骏 彭健 蔡月明
单位：519000 广东省珠海市，暨南大学医学院第三附属医院内科
关键词：β地中海贫血；基因；突变；杂交；聚合酶链反应
实用医学杂志000711 摘 要 目的：研究38例β地中海贫血(β地贫)基因突变类型以及与临床表型的相关性。方法：采用PCR/反向斑点杂交(PCR/RDB)技术同时检测11种β地贫基因突变位点，并对所有病例作血液学分析和临床资料收集对比。结果：本组病例共检出7种基因突变类型，涉及46个位点突变，包括4种常见类型(35/46，76.1%)，三种罕见类型(11/46，23.9%)。32例轻型β地贫中，30例为基因突变杂合子，2例是双重基因突变子；6例重型β地贫中，5例为基因双重突变子，1例是基因突变杂合子。结论：β地贫基因突变复杂多样，双重基因突变子多为重型β地贫，但亦见于少数轻型β地贫。多突变位点PCR/RDB基因技术快速、特异，适用于β地贫的基因诊断和研究。
, 百拇医药
β地中海贫血(β地贫)是一组由于β珠蛋白基因突变从而导致β珠蛋白肽链合成减少(β+)或缺乏(β-)为特征的遗传性血液病。β地贫在临床表现、血液学和生化指标以及基因突变类型方面呈现高度的异质性。重型β地贫贫血严重，常依靠反复输血维持，往往未成年即已夭折。而轻型β地贫可无临床症状，极易漏诊和误诊。β地贫分子遗传流行病学资料显示，其基因突变类型和频率具有明显的种族性和地域性差异[1]。我们采用多突变位点PCR/RDB基因分析技术，同时检测11种包含中国人常见和部分罕见的β地贫基因突变类型。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组共38例，男16例，女22例；年龄1～56岁，平均22.5岁，均为广东籍；所研究病例是通过婚孕检地贫筛查，以及地贫的先证者和其家系检测获得。38例β地贫患者中，轻型β地贫32例，无明显的临床表现；重型β地贫6例，临床上有不同程度的发育迟缓，轻、中度肝脾肿大和需要反复输血。所有研究病例均经Hb，平均红细胞容积(MCV)，血红蛋白A2(HbA2)，抗硷血红蛋白(HbF)，RBC脆性及Hb电泳检测证实。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 血液学、生化指标检测方法 利用CELL-DYN-1700型血细胞自动分析仪检测Hb和RBC参数，HbF采用1 min碱变性法，RBC脆性采用比色一管法(正常参考值：>60%)，Hb电泳和HbA2采用血红蛋白自动电泳扫描分析仪(BECKMAN)检测。
1.2.2 β地贫基因突变分析方法 外周血白细胞DNA提取：抽取2 ml静脉肝素抗凝血，低渗溶血收集白细胞，酚/氯仿法提取基因组DNA，适量TE液溶解，置于-70℃低温冰箱保存。扩增β珠蛋白基因：采用第一军医大学分子生物学研究所提供的两对生物素标记引物(C1及C2，C3及C4)，分两段扩增包含11种突变位点的β珠蛋白基因。PCR反应体系：反应总体积50 μ l，TaqDNA聚合酶2 U，dNTP 200μ mol/L，模板DNA 1μ g。PCR反应条件：97℃预变性5 min，55℃5 min(加Taq酶)，72℃2 min，循环1次；94℃50 s，55℃1 min，72℃1 min，循环30次。PCR产物经1%琼脂糖电泳，溴乙啶染色，紫外透射仪观察，扩增成功可见两条特异的DNA片段(601 bp，423 bp)。反向斑点杂交：将包含有检测11种β地贫基因突变的寡核苷酸探针的尼龙膜条与PCR产物同置于含有杂交液的杂交管中，42℃杂交6 h，洗膜和显色，依照寡核苷酸探针标记模式判断结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 血液学分析 32例轻型β地贫：Hb 98～145 g/L，正常或轻度降低；MCV 66.3～76.2 fl，RBC脆性11.0%～52.6%，均降低；HbA2 4.1%～6.7%，均增高；仅3例HbF轻度增高(4.4%～4.7%)。6例重型β地贫：Hb 33～65 g/L，明显降低；MCV 60.3～70.8 fl，RBC脆性9.8%～24.1%，均降低；HbA2 4.6%～5.8%，均增高；HbF 6.8%～12.6%，均明显增高。
2.2 基因突变类型和频率 38例β地贫共检出7种基因突变类型，包括4种我国南方常见类型和3种罕见类型，其中发现7例5种β地贫基因双重突变子。32例轻型β地贫中，30例突变杂合子，2例突变双重杂合子；6例重型β地贫中，5例双重突变子，1例突变杂合子。β地贫基因突变类型、频率和临床类型见表1。
, 百拇医药 表1 38例β地贫基因诊断结果 基因突变类型
例数
频率(%)
临床类型
CD41-42(-CTTT)/βA
6
15.8
轻型
IVS-Ⅱ-654(C→T)/βA
8
21.1
轻型
, 百拇医药
CD17(A→T)/βA
4
10.5
轻型(3/4)，重型(1/4)
TATAbox-28(A→G)/βA
8
21.1
轻型
TATAbox-29(A→G)/βA
2
5.3
, 百拇医药
轻型
CD26(G→A)/βA
2
5.3
轻型
IVS-I-1(G→T)/βA
1
2.6
轻型
TATAbox-28/TATAbox-29
1
2.6
, 百拇医药
轻型
CD17/IVS-I-1
1
2.6
轻型
CD41-42/IVS-Ⅱ-654
3
7.9
重型
CD41-42/CD26
1
2.6
重型
, 百拇医药
TATAbox-28/TATAbox-29/TATAbox-29
1
2.6
重型
3 讨论
β地贫基因以点突变为常见，突变类型多，目前全世界共发现160多种，中国已检出22种。中国南方常见的4种类型是：CD41-42(-CTTT)，IVS-Ⅱ-654(C→T)，CD17(A→T)和TATAbox-28(A→G)[2]。我们采用PCR/RDB技术同时检测11种中国人β地贫基因突变类型，对38例β地贫的76条染色体进行分析，共检出7种基因突变类型，涉及46个位点突变，包括上述4种常见类型(37/46，80.4%)和3种罕见类型(9/46，19.6%)。发现31例基因突变杂合子，7例基因双重突变子。一般认为轻型β地贫是某一基因位点突变杂合子，而重型β地贫往往是某一基因位点突变纯合子或两个以上基因位点突变双重、多重突变子。本组38例中，32例为轻型β地贫，其基因突变类型：30例为基因突变杂合子，2例基因是突变双重杂合子(TATAbox-28/TATAbox-29，CD17/IVS-I-1)，基因突变双重杂合子临床表型为轻型β地贫，比较少见,文献偶见报道.认为是两个突变基因位于同一条染色体上，相应的同源染色体基因发挥了代偿作用，能够维持一定水平的β珠蛋白链合成[3]。6例重型β地贫中，5例基因双重突变子，但1例是基因突变杂合子，其基因突变类型是CD17(A→T)/βA杂合子，推测可能还存在11种基因突变类型之外的罕见基因突变型未能检出。
, http://www.100md.com
β地贫基因突变的多样性，使β地贫基因诊断和研究比较繁琐和困难。PCR/RDB基因突变分析技术可以同时检测11种β地贫基因突变类型，并能区分纯合子、杂合子和多重突变子，是一种快速、敏感的基因分析技术，对一些高危人群进行多指标血液学分析和多基因突变位点检测是十分必要的，对于β地贫基因的研究和降低人群致病基因遗传负荷具有重要的意义。
参考文献
1，Huisman THJ. The β and δ thalassemia repository. Hemoglobin,1995，19(3)：213.
2，李厚钧，徐湘民，周常文，等. 应用反向点杂交检出新疆六种β地中海贫血突变型. 中华血液学杂志，1995，16(8)：423.
3，周常文，李厚钧，余伍忠，等. 一种新的β地中海贫血双重突变杂合体[-28(A→G).CD17(A→T)/N]. 中华医学遗传学杂志，1996，13(1)：5.
(修回日期：2000-01-21), 百拇医药
单位：519000 广东省珠海市，暨南大学医学院第三附属医院内科
关键词：β地中海贫血；基因；突变；杂交；聚合酶链反应
实用医学杂志000711 摘 要 目的：研究38例β地中海贫血(β地贫)基因突变类型以及与临床表型的相关性。方法：采用PCR/反向斑点杂交(PCR/RDB)技术同时检测11种β地贫基因突变位点，并对所有病例作血液学分析和临床资料收集对比。结果：本组病例共检出7种基因突变类型，涉及46个位点突变，包括4种常见类型(35/46，76.1%)，三种罕见类型(11/46，23.9%)。32例轻型β地贫中，30例为基因突变杂合子，2例是双重基因突变子；6例重型β地贫中，5例为基因双重突变子，1例是基因突变杂合子。结论：β地贫基因突变复杂多样，双重基因突变子多为重型β地贫，但亦见于少数轻型β地贫。多突变位点PCR/RDB基因技术快速、特异，适用于β地贫的基因诊断和研究。
, 百拇医药
β地中海贫血(β地贫)是一组由于β珠蛋白基因突变从而导致β珠蛋白肽链合成减少(β+)或缺乏(β-)为特征的遗传性血液病。β地贫在临床表现、血液学和生化指标以及基因突变类型方面呈现高度的异质性。重型β地贫贫血严重，常依靠反复输血维持，往往未成年即已夭折。而轻型β地贫可无临床症状，极易漏诊和误诊。β地贫分子遗传流行病学资料显示，其基因突变类型和频率具有明显的种族性和地域性差异[1]。我们采用多突变位点PCR/RDB基因分析技术，同时检测11种包含中国人常见和部分罕见的β地贫基因突变类型。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组共38例，男16例，女22例；年龄1～56岁，平均22.5岁，均为广东籍；所研究病例是通过婚孕检地贫筛查，以及地贫的先证者和其家系检测获得。38例β地贫患者中，轻型β地贫32例，无明显的临床表现；重型β地贫6例，临床上有不同程度的发育迟缓，轻、中度肝脾肿大和需要反复输血。所有研究病例均经Hb，平均红细胞容积(MCV)，血红蛋白A2(HbA2)，抗硷血红蛋白(HbF)，RBC脆性及Hb电泳检测证实。
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1.2 实验方法
1.2.1 血液学、生化指标检测方法 利用CELL-DYN-1700型血细胞自动分析仪检测Hb和RBC参数，HbF采用1 min碱变性法，RBC脆性采用比色一管法(正常参考值：>60%)，Hb电泳和HbA2采用血红蛋白自动电泳扫描分析仪(BECKMAN)检测。
1.2.2 β地贫基因突变分析方法 外周血白细胞DNA提取：抽取2 ml静脉肝素抗凝血，低渗溶血收集白细胞，酚/氯仿法提取基因组DNA，适量TE液溶解，置于-70℃低温冰箱保存。扩增β珠蛋白基因：采用第一军医大学分子生物学研究所提供的两对生物素标记引物(C1及C2，C3及C4)，分两段扩增包含11种突变位点的β珠蛋白基因。PCR反应体系：反应总体积50 μ l，TaqDNA聚合酶2 U，dNTP 200μ mol/L，模板DNA 1μ g。PCR反应条件：97℃预变性5 min，55℃5 min(加Taq酶)，72℃2 min，循环1次；94℃50 s，55℃1 min，72℃1 min，循环30次。PCR产物经1%琼脂糖电泳，溴乙啶染色，紫外透射仪观察，扩增成功可见两条特异的DNA片段(601 bp，423 bp)。反向斑点杂交：将包含有检测11种β地贫基因突变的寡核苷酸探针的尼龙膜条与PCR产物同置于含有杂交液的杂交管中，42℃杂交6 h，洗膜和显色，依照寡核苷酸探针标记模式判断结果。
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2 结果
2.1 血液学分析 32例轻型β地贫：Hb 98～145 g/L，正常或轻度降低；MCV 66.3～76.2 fl，RBC脆性11.0%～52.6%，均降低；HbA2 4.1%～6.7%，均增高；仅3例HbF轻度增高(4.4%～4.7%)。6例重型β地贫：Hb 33～65 g/L，明显降低；MCV 60.3～70.8 fl，RBC脆性9.8%～24.1%，均降低；HbA2 4.6%～5.8%，均增高；HbF 6.8%～12.6%，均明显增高。
2.2 基因突变类型和频率 38例β地贫共检出7种基因突变类型，包括4种我国南方常见类型和3种罕见类型，其中发现7例5种β地贫基因双重突变子。32例轻型β地贫中，30例突变杂合子，2例突变双重杂合子；6例重型β地贫中，5例双重突变子，1例突变杂合子。β地贫基因突变类型、频率和临床类型见表1。
, 百拇医药 表1 38例β地贫基因诊断结果 基因突变类型
例数
频率(%)
临床类型
CD41-42(-CTTT)/βA
6
15.8
轻型
IVS-Ⅱ-654(C→T)/βA
8
21.1
轻型
, 百拇医药
CD17(A→T)/βA
4
10.5
轻型(3/4)，重型(1/4)
TATAbox-28(A→G)/βA
8
21.1
轻型
TATAbox-29(A→G)/βA
2
5.3
, 百拇医药
轻型
CD26(G→A)/βA
2
5.3
轻型
IVS-I-1(G→T)/βA
1
2.6
轻型
TATAbox-28/TATAbox-29
1
2.6
, 百拇医药
轻型
CD17/IVS-I-1
1
2.6
轻型
CD41-42/IVS-Ⅱ-654
3
7.9
重型
CD41-42/CD26
1
2.6
重型
, 百拇医药
TATAbox-28/TATAbox-29/TATAbox-29
1
2.6
重型
3 讨论
β地贫基因以点突变为常见，突变类型多，目前全世界共发现160多种，中国已检出22种。中国南方常见的4种类型是：CD41-42(-CTTT)，IVS-Ⅱ-654(C→T)，CD17(A→T)和TATAbox-28(A→G)[2]。我们采用PCR/RDB技术同时检测11种中国人β地贫基因突变类型，对38例β地贫的76条染色体进行分析，共检出7种基因突变类型，涉及46个位点突变，包括上述4种常见类型(37/46，80.4%)和3种罕见类型(9/46，19.6%)。发现31例基因突变杂合子，7例基因双重突变子。一般认为轻型β地贫是某一基因位点突变杂合子，而重型β地贫往往是某一基因位点突变纯合子或两个以上基因位点突变双重、多重突变子。本组38例中，32例为轻型β地贫，其基因突变类型：30例为基因突变杂合子，2例基因是突变双重杂合子(TATAbox-28/TATAbox-29，CD17/IVS-I-1)，基因突变双重杂合子临床表型为轻型β地贫，比较少见,文献偶见报道.认为是两个突变基因位于同一条染色体上，相应的同源染色体基因发挥了代偿作用，能够维持一定水平的β珠蛋白链合成[3]。6例重型β地贫中，5例基因双重突变子，但1例是基因突变杂合子，其基因突变类型是CD17(A→T)/βA杂合子，推测可能还存在11种基因突变类型之外的罕见基因突变型未能检出。
, http://www.100md.com
β地贫基因突变的多样性，使β地贫基因诊断和研究比较繁琐和困难。PCR/RDB基因突变分析技术可以同时检测11种β地贫基因突变类型，并能区分纯合子、杂合子和多重突变子，是一种快速、敏感的基因分析技术，对一些高危人群进行多指标血液学分析和多基因突变位点检测是十分必要的，对于β地贫基因的研究和降低人群致病基因遗传负荷具有重要的意义。
参考文献
1，Huisman THJ. The β and δ thalassemia repository. Hemoglobin,1995，19(3)：213.
2，李厚钧，徐湘民，周常文，等. 应用反向点杂交检出新疆六种β地中海贫血突变型. 中华血液学杂志，1995，16(8)：423.
3，周常文，李厚钧，余伍忠，等. 一种新的β地中海贫血双重突变杂合体[-28(A→G).CD17(A→T)/N]. 中华医学遗传学杂志，1996，13(1)：5.
(修回日期：2000-01-21), 百拇医药