成纤维细胞生长因子受体在肾间质成纤维细胞的表达*
作者：杜爱萍 邹万忠
单位：北京医科大学病理学系(北京，100083)
关键词：细胞生长因子；成纤维细胞；细胞增殖
肾脏病与透析肾移植杂志990411
在肾小管间质纤维化的发生发展过程中，损伤和再生的肾小管上皮细胞可以合成和分泌多种细胞因子和生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)就是其中的一种。研究FGF的靶细胞或细胞受体(FGFR)，对于揭示FGF在肾小管间质纤维化中的作用有重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar大鼠，雌性，体重200～250g(北京医科大学实验动物提供)。并选用了1996年至1997年北京医科大学病理系肾穿刺标本有增生硬化性改变的肾小球肾炎20例，均伴有肾小管间质纤维化，5例轻度系膜增生性肾小球肾炎作为对照。
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1.2 细胞培养 Wistar大鼠1只，断头，无菌条件下取肾，在Hank液里剪碎，种入培养瓶，20%小牛血清DMEM培养，1周后传代，继续培养，铺满瓶底后收集，光镜、电镜观察，Keratin免疫组化染色阴性，Vimentin阳性，进一步经过含右旋缬氨酸的DMEM培养基替代培养，鉴定为成纤维细胞。
1.3 RT-PCR 异硫氰酸胍一步法[1]提取培养的成纤维细胞总RNA；FGFR1引物[2]：上游5′-CTAGACGTTGTGGAGCGAT-3′下游5′-AGGTCATCACGGCTGGTCT-3′合成片段大小：376bp，由北京医科大学病理系合成。扩增条件：25μl体系，逆转录产物1μl，10×buffer 2.5μl，引物各0.5 μmol/L，dNTP 160 μmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，Taq酶2U，94℃预变性1min后；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸30s，30循环；最后延伸7min。取PCR产物10μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
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1.4 免疫组化 LSAB法，兔抗人FGFR1单克隆抗体(1∶50稀释，Santa Cruz)，不加1抗为阴性对照。
1.5 3H-TdR掺入法观察bFGF对肾间质成纤维细胞的促增殖作用 将第二代培养的细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8h后换成1%小牛血清DMEM继续培养20h，加入bFGF，使终浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L，每个浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，分别于8、24、32、48h收集细胞，收集细胞前7h加入0.5 μci/孔3H-TdR。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(PPO：0.1%，POPOP：0.05%)，Beckman液闪仪检测。
2 结 果
2.1 RT-PCR 对培养的成纤维细胞总RNA进行RT-PCR，可扩增出376bp特异条带，说明肾间质成纤维细胞有FGFR1的mRNA表达。
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2.2 免疫组化 培养的肾间质成纤维细胞FGFR1阳性。伴有肾间质纤维化的人肾组织FGFR1强阳性分布于损伤和再生的肾小管，肾间质成纤维细胞、单个核细胞亦强阳性；而对照组阴性。
2.3 bFGF对培养的肾间质成纤维细胞促增殖实验 加入浓度为5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L的bFGF后，各时间点3H-TdR掺入率均高于对照组(附表)。
附表 不同浓度bFGF刺激肾间质成纤维细胞3H-TdR掺入率(min/104 cell)(
±s) 时间(h)
浓度 (μg/L)
0
5
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10
50
8
718.33±76.31
1257.25±93.24**
1097.53±112.07**
965.40±94.11*
16
698.91±72.01
1043.01±110.89*
991.12±96.30*
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963.67±98.35*
24
640.01±71.44
869.33±84.79*
857.43±88.14*
684.34±71.64
48
411.82±39.36
587.01±61.91*
591.34±55.37**
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435.34±49.01
与未加bFGF组相比*P<0.05，**P<0.01
3 讨 论
肾小管间质纤维化可由进行性肾小球损伤、慢性肾小管损伤和慢性间质性肾炎引起，尤以各种进行性肾小球损伤常见。在上述各种损伤中，损伤和再生的肾小管上皮细胞可以合成和分泌FGF[3]。FGF发挥作用，必须有其靶细胞，靶细胞则应具有FGFR。FGFR有两种，一种为高亲合力受体，属酪氨酸蛋白激酶类受体；另一种为低亲合力受体，属肝素样受体。高亲合力受体由胞内区、跨膜区和胞外区组成，胞外区含2～3个免疫球蛋白结合位点类似区。目前已克隆出五个与高亲合力受体有关的基因，不同基因在结构和亲合力方面有所不同，FGFR1、FGFR2和FGFR3可与aFGF和bFGF结合[2，4]。本研究表明，肾间质成纤维细胞有FGFR1的mRNA表达，损伤和再生的肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞以及单个核细胞均有FGFR1的蛋白合成，从而说明损伤和再生的肾小管上皮细胞所产生的FGF通过自分泌和旁分泌的途径，虽然有促进肾小管上皮细胞的再生和增生作用，也有促进肾间质成纤维细胞增生的作用，最终导致肾小管间质纤维化的形成。
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*国家自然科学基金资助课题(39770293)
参考文献
1 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extration.Analytic Biochem，1987，162：156
2 Miriam DF.Jennifer C，Ursula G et al.Expression of fibroblast growth factors and their receptors in rat glomeruli.Kidney Int，1997，51：1729
3 杜爱萍，邹万忠等.肾小管上皮细胞损伤与成纤维细胞生长因子的关系.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(3)：221
4 Jaye M，Schkessinger J，Craig A et al.FGFR tyrosine kinases molecular analysis and signal transduction.Biochem Biophy Acta，1992，1135：185
(1999-05-08收稿，1999-06-10修回), http://www.100md.com
单位：北京医科大学病理学系(北京，100083)
关键词：细胞生长因子；成纤维细胞；细胞增殖
肾脏病与透析肾移植杂志990411
在肾小管间质纤维化的发生发展过程中，损伤和再生的肾小管上皮细胞可以合成和分泌多种细胞因子和生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)就是其中的一种。研究FGF的靶细胞或细胞受体(FGFR)，对于揭示FGF在肾小管间质纤维化中的作用有重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar大鼠，雌性，体重200～250g(北京医科大学实验动物提供)。并选用了1996年至1997年北京医科大学病理系肾穿刺标本有增生硬化性改变的肾小球肾炎20例，均伴有肾小管间质纤维化，5例轻度系膜增生性肾小球肾炎作为对照。
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1.2 细胞培养 Wistar大鼠1只，断头，无菌条件下取肾，在Hank液里剪碎，种入培养瓶，20%小牛血清DMEM培养，1周后传代，继续培养，铺满瓶底后收集，光镜、电镜观察，Keratin免疫组化染色阴性，Vimentin阳性，进一步经过含右旋缬氨酸的DMEM培养基替代培养，鉴定为成纤维细胞。
1.3 RT-PCR 异硫氰酸胍一步法[1]提取培养的成纤维细胞总RNA；FGFR1引物[2]：上游5′-CTAGACGTTGTGGAGCGAT-3′下游5′-AGGTCATCACGGCTGGTCT-3′合成片段大小：376bp，由北京医科大学病理系合成。扩增条件：25μl体系，逆转录产物1μl，10×buffer 2.5μl，引物各0.5 μmol/L，dNTP 160 μmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，Taq酶2U，94℃预变性1min后；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸30s，30循环；最后延伸7min。取PCR产物10μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
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1.4 免疫组化 LSAB法，兔抗人FGFR1单克隆抗体(1∶50稀释，Santa Cruz)，不加1抗为阴性对照。
1.5 3H-TdR掺入法观察bFGF对肾间质成纤维细胞的促增殖作用 将第二代培养的细胞用胰酶消化，以104个/孔种入96孔板，8h后换成1%小牛血清DMEM继续培养20h，加入bFGF，使终浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L，每个浓度设3个平行孔，并设3个对照孔，分别于8、24、32、48h收集细胞，收集细胞前7h加入0.5 μci/孔3H-TdR。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烘干，浸入闪烁液(PPO：0.1%，POPOP：0.05%)，Beckman液闪仪检测。
2 结 果
2.1 RT-PCR 对培养的成纤维细胞总RNA进行RT-PCR，可扩增出376bp特异条带，说明肾间质成纤维细胞有FGFR1的mRNA表达。
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2.2 免疫组化 培养的肾间质成纤维细胞FGFR1阳性。伴有肾间质纤维化的人肾组织FGFR1强阳性分布于损伤和再生的肾小管，肾间质成纤维细胞、单个核细胞亦强阳性；而对照组阴性。
2.3 bFGF对培养的肾间质成纤维细胞促增殖实验 加入浓度为5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L的bFGF后，各时间点3H-TdR掺入率均高于对照组(附表)。
附表 不同浓度bFGF刺激肾间质成纤维细胞3H-TdR掺入率(min/104 cell)(
±s) 时间(h)浓度 (μg/L)
0
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10
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718.33±76.31
1257.25±93.24**
1097.53±112.07**
965.40±94.11*
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698.91±72.01
1043.01±110.89*
991.12±96.30*
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963.67±98.35*
24
640.01±71.44
869.33±84.79*
857.43±88.14*
684.34±71.64
48
411.82±39.36
587.01±61.91*
591.34±55.37**
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435.34±49.01
与未加bFGF组相比*P<0.05，**P<0.01
3 讨 论
肾小管间质纤维化可由进行性肾小球损伤、慢性肾小管损伤和慢性间质性肾炎引起，尤以各种进行性肾小球损伤常见。在上述各种损伤中，损伤和再生的肾小管上皮细胞可以合成和分泌FGF[3]。FGF发挥作用，必须有其靶细胞，靶细胞则应具有FGFR。FGFR有两种，一种为高亲合力受体，属酪氨酸蛋白激酶类受体；另一种为低亲合力受体，属肝素样受体。高亲合力受体由胞内区、跨膜区和胞外区组成，胞外区含2～3个免疫球蛋白结合位点类似区。目前已克隆出五个与高亲合力受体有关的基因，不同基因在结构和亲合力方面有所不同，FGFR1、FGFR2和FGFR3可与aFGF和bFGF结合[2，4]。本研究表明，肾间质成纤维细胞有FGFR1的mRNA表达，损伤和再生的肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞以及单个核细胞均有FGFR1的蛋白合成，从而说明损伤和再生的肾小管上皮细胞所产生的FGF通过自分泌和旁分泌的途径，虽然有促进肾小管上皮细胞的再生和增生作用，也有促进肾间质成纤维细胞增生的作用，最终导致肾小管间质纤维化的形成。
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*国家自然科学基金资助课题(39770293)
参考文献
1 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extration.Analytic Biochem，1987，162：156
2 Miriam DF.Jennifer C，Ursula G et al.Expression of fibroblast growth factors and their receptors in rat glomeruli.Kidney Int，1997，51：1729
3 杜爱萍，邹万忠等.肾小管上皮细胞损伤与成纤维细胞生长因子的关系.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6(3)：221
4 Jaye M，Schkessinger J，Craig A et al.FGFR tyrosine kinases molecular analysis and signal transduction.Biochem Biophy Acta，1992，1135：185
(1999-05-08收稿，1999-06-10修回), http://www.100md.com