中性粒细胞抗体对阳离子化牛血清白蛋白诱发的大鼠膜性肾病的作用
作者：刘杰 杜学海 王辉 付芳婷 邹万忠
单位：100029北京，中日友好医院肾内科广(刘杰，杜学海，王辉，付芳婷)北京医科大学病理教研室(邹万忠)
关键词：
中华医学杂志940526.htm 我们用兔抗鼠中性粒细胞抗血清(ANS)干扰阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱发大鼠膜性肾病(MN)，以探讨中性粒细胞在MN中的作用。
一、材料和方法
1.制备ANS：[kidney Int 1987,32:342]Wistar大鼠腹腔注射牡蛎糖原，3天内注射2次，第2次注射后3小时收集腹腔炎细胞。用淋巴细胞分离液分离中性粒细胞，并除去RBC。将6×l06个中性粒细胞与不完全弗氏佐剂混合，给兔皮下预免疫，2周后静脉加强免疫1次。3周末耳缘静脉取血分离血清给大鼠腹腔注射，12小时后取大鼠外周血计数中性粒细胞，结果<400个/mm3表明抗体效价达到标准。从兔颈动脉放血分离血清，用鼠胸腺细胞、巨噬细胞和RBC充分纯化，即为制备成功的ANS。
, 百拇医药
2.MN模型制作及分组
模型制作：将1mgC-BSA(自制)与不完全弗氏佐剂乳化，给大鼠多部位皮下预免疫。1周后隔日1次尾静脉注射每只C-BSA3.5mg/次，共4周。
实验分组：大鼠预免疫后随机分3组。正常对照组(n=7)，隔日1次尾静脉注射生理盐水1ml。膜性肾病组(n=8)，每次尾静脉注射C-BSA前1小时，腹腔注射生理盐水1ml。ANS组(n=9)，每次尾静脉注射C-BAS前1小时及之后12小时，腹腔注射ANS1.5ml。以上大鼠5周后尾静脉取血分离血清，处死后肾皮质制成10%匀浆。
3.主要观察指标：(1)24小时尿蛋白定量，考马斯亮兰染料法，规定>10mg/24h为异常。(2)血清及肾皮质脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)测定，硫代巴比妥酸比色法。(3)血清及肾皮质中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定，黄嘌呤氧化酶法。(4)血请及肾皮质中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性测定，还原型谷胱甘肽消耗法。(5)外周血WBC计数。(6)肾脏组织学检查，5周末肾皮质作IgG、C3、BSA荧光及光镜和电镜检查。
, 百拇医药
二、结果
1.24小时尿蛋白定量：实验3周末，肾病组及ANS组尿蛋白均升高，与正常组比差异无显著意义。5周末，肾病组(164±40mg/24h)及ANS组尿蛋白(226±54mg/24h)明显升高，两组间差异无显著意义(P>0.05)，但与正常组(8±3mg/24h)比差异有非常显著意义(P<0.01)。
2.血清及肾皮质中MDA含量、SOD及GSH-px活性(表1)：肾病组血清及肾皮质中MDA含量较正常组明显升高，SOD及GSH-px活性较正常组降低；ANS组MDA也较正常组明显升高，SOD及GSH-px活性较正常组明显降低，但与模型组比差异无显著意义。
3.外周血WBC计数：使用ANS耗竭大鼠体内中性粒细胞，外周血WBC总数和中性粒细胞数均较正常下降(表2)。
表1 5周末血清及肾皮质中MDA含量、SOD和GSH-px活性
, 百拇医药
组别
血清
肾皮质
MDA(nmol/ml)
SOD(Nu/ml)
GSH-px(U/m)
MDA(nmol/mgpro)
SOD(NU/mgpro)
GSH-P(U/mgpro)
正常组(n=7)
23±3
59±3
, 百拇医药
394±9
0.2±0.1
2.1±0.4
20.0±1.9
肾病组(n=8)
48±11*
41±4*
328±17*
1.3±0.3*
1.1±0.3*
13.0±1.8*
ANS组(n=9)
, http://www.100md.com
43±15*Δ
39±6*Δ
323±26*Δ
1.5±0.4*Δ
1.0±0.3*Δ
12.0±3.1*Δ
*与正常组比P<0.01，Δ与肾病组比P>0.05表2 各组外周血WBC和中性粒细胞(N)计数(个/mm3)
组别
第1周
第3周
第5周
, http://www.100md.com
WBC
N
WBC
N
WBC
N
正常组(n=7)
11240±5650
4620±3062
肾病组(n=8)
17240±4260
5060±3217
20580±2144
, 百拇医药
6942±4331
26860±2268
87456192
ANS组(n=9)
9250±2234
<400Δ
13860±3552*
<400Δ
15950±3648
<400Δ
*与肾病组比P<0.05，Δ与肾病组比P<0.001
, 百拇医药 4.肾病组织学检查：免疫荧光：ANS组和模型组IgG、C3和BSA沉积分别为+++～++++、++和+， 二组间无明显差别。光镜：ANS组和肾病组均表现为肾小球直径增大，毛细血管腔变窄，肾小球基底膜(GBM)增厚，钉突形成，ANS组病变较肾病组更明显。两组肾小球内均无细胞数增多，无WBC渗出。电镜：ANS组GBM增厚程度和上皮下电子致密物沉积较肾病组明显，并有严重的上皮细胞肿胀和足突融合。
三、讨论
细菌、免疫复合物等激活吞噬细胞后，通过葡萄糖磷酸戊糖途径代谢，耗氧量剧增，达正常的2～20倍，这种现象称为“呼吸爆炸”。[N Engl J Med 1987，298：659]由于呼吸爆炸是单电子还原，因此产生大量的反应性氧化代谢产物(ROM)，对组织造成损伤。其中中性粒细胞是呼吸爆炸产生ROM的主要来源。我们的实验表明ANS组大鼠体内基本无中性粒细胞(<400个/mm3)，蛋白尿也无改善，甚至比肾病组严重；组织病理变化也显示较重。血清和肾皮质中MDA含量和SOD及GSH-px活性在肾病组和ANS组相似，表明耗竭大鼠体内中性粒细胞，并不能抑制体内脂质过氧化损伤，说明C-BSA诱发的大鼠MN不依赖中性粒细胞，这与肾小球内无WBC渗出的病理改变一致。
在肾炎的发生过程中，补体和中性粒细胞有着密切关系。免疫复合物激活补体产生化学趋化因子C3a、C5a，吸引循环中的粒细胞聚集于抗原抗体反应部位，释放蛋白酶及ROM等炎性介质，导致组织损伤。有人推测由于MN免疫复合物主要沉积于上皮下，产生的化学趋化因子也位于上皮下，因此与循环中的粒细胞相距较远，难以吸引中性粒细胞到免疫复合物沉积部位，所以MN无中性粒细胞在肾小球内渗出。而抗GBM肾炎、SLE等的免疫复合物主要沉积于内皮下，它们激活补体产生的趋化因子能吸引循环中的粒细胞，引起渗出性病变，并引起一系列依赖中性粒细胞的损害，如H202-MPO-卤素系统参与的损害.(收稿：1993-09-24 修回：1994-01-28), http://www.100md.com
单位：100029北京，中日友好医院肾内科广(刘杰，杜学海，王辉，付芳婷)北京医科大学病理教研室(邹万忠)
关键词：
中华医学杂志940526.htm 我们用兔抗鼠中性粒细胞抗血清(ANS)干扰阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱发大鼠膜性肾病(MN)，以探讨中性粒细胞在MN中的作用。
一、材料和方法
1.制备ANS：[kidney Int 1987,32:342]Wistar大鼠腹腔注射牡蛎糖原，3天内注射2次，第2次注射后3小时收集腹腔炎细胞。用淋巴细胞分离液分离中性粒细胞，并除去RBC。将6×l06个中性粒细胞与不完全弗氏佐剂混合，给兔皮下预免疫，2周后静脉加强免疫1次。3周末耳缘静脉取血分离血清给大鼠腹腔注射，12小时后取大鼠外周血计数中性粒细胞，结果<400个/mm3表明抗体效价达到标准。从兔颈动脉放血分离血清，用鼠胸腺细胞、巨噬细胞和RBC充分纯化，即为制备成功的ANS。
, 百拇医药
2.MN模型制作及分组
模型制作：将1mgC-BSA(自制)与不完全弗氏佐剂乳化，给大鼠多部位皮下预免疫。1周后隔日1次尾静脉注射每只C-BSA3.5mg/次，共4周。
实验分组：大鼠预免疫后随机分3组。正常对照组(n=7)，隔日1次尾静脉注射生理盐水1ml。膜性肾病组(n=8)，每次尾静脉注射C-BSA前1小时，腹腔注射生理盐水1ml。ANS组(n=9)，每次尾静脉注射C-BAS前1小时及之后12小时，腹腔注射ANS1.5ml。以上大鼠5周后尾静脉取血分离血清，处死后肾皮质制成10%匀浆。
3.主要观察指标：(1)24小时尿蛋白定量，考马斯亮兰染料法，规定>10mg/24h为异常。(2)血清及肾皮质脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)测定，硫代巴比妥酸比色法。(3)血清及肾皮质中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定，黄嘌呤氧化酶法。(4)血请及肾皮质中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性测定，还原型谷胱甘肽消耗法。(5)外周血WBC计数。(6)肾脏组织学检查，5周末肾皮质作IgG、C3、BSA荧光及光镜和电镜检查。
, 百拇医药
二、结果
1.24小时尿蛋白定量：实验3周末，肾病组及ANS组尿蛋白均升高，与正常组比差异无显著意义。5周末，肾病组(164±40mg/24h)及ANS组尿蛋白(226±54mg/24h)明显升高，两组间差异无显著意义(P>0.05)，但与正常组(8±3mg/24h)比差异有非常显著意义(P<0.01)。
2.血清及肾皮质中MDA含量、SOD及GSH-px活性(表1)：肾病组血清及肾皮质中MDA含量较正常组明显升高，SOD及GSH-px活性较正常组降低；ANS组MDA也较正常组明显升高，SOD及GSH-px活性较正常组明显降低，但与模型组比差异无显著意义。
3.外周血WBC计数：使用ANS耗竭大鼠体内中性粒细胞，外周血WBC总数和中性粒细胞数均较正常下降(表2)。
表1 5周末血清及肾皮质中MDA含量、SOD和GSH-px活性
, 百拇医药
组别
血清
肾皮质
MDA(nmol/ml)
SOD(Nu/ml)
GSH-px(U/m)
MDA(nmol/mgpro)
SOD(NU/mgpro)
GSH-P(U/mgpro)
正常组(n=7)
23±3
59±3
, 百拇医药
394±9
0.2±0.1
2.1±0.4
20.0±1.9
肾病组(n=8)
48±11*
41±4*
328±17*
1.3±0.3*
1.1±0.3*
13.0±1.8*
ANS组(n=9)
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43±15*Δ
39±6*Δ
323±26*Δ
1.5±0.4*Δ
1.0±0.3*Δ
12.0±3.1*Δ
*与正常组比P<0.01，Δ与肾病组比P>0.05表2 各组外周血WBC和中性粒细胞(N)计数(个/mm3)
组别
第1周
第3周
第5周
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WBC
N
WBC
N
WBC
N
正常组(n=7)
11240±5650
4620±3062
肾病组(n=8)
17240±4260
5060±3217
20580±2144
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6942±4331
26860±2268
87456192
ANS组(n=9)
9250±2234
<400Δ
13860±3552*
<400Δ
15950±3648
<400Δ
*与肾病组比P<0.05，Δ与肾病组比P<0.001
, 百拇医药 4.肾病组织学检查：免疫荧光：ANS组和模型组IgG、C3和BSA沉积分别为+++～++++、++和+， 二组间无明显差别。光镜：ANS组和肾病组均表现为肾小球直径增大，毛细血管腔变窄，肾小球基底膜(GBM)增厚，钉突形成，ANS组病变较肾病组更明显。两组肾小球内均无细胞数增多，无WBC渗出。电镜：ANS组GBM增厚程度和上皮下电子致密物沉积较肾病组明显，并有严重的上皮细胞肿胀和足突融合。
三、讨论
细菌、免疫复合物等激活吞噬细胞后，通过葡萄糖磷酸戊糖途径代谢，耗氧量剧增，达正常的2～20倍，这种现象称为“呼吸爆炸”。[N Engl J Med 1987，298：659]由于呼吸爆炸是单电子还原，因此产生大量的反应性氧化代谢产物(ROM)，对组织造成损伤。其中中性粒细胞是呼吸爆炸产生ROM的主要来源。我们的实验表明ANS组大鼠体内基本无中性粒细胞(<400个/mm3)，蛋白尿也无改善，甚至比肾病组严重；组织病理变化也显示较重。血清和肾皮质中MDA含量和SOD及GSH-px活性在肾病组和ANS组相似，表明耗竭大鼠体内中性粒细胞，并不能抑制体内脂质过氧化损伤，说明C-BSA诱发的大鼠MN不依赖中性粒细胞，这与肾小球内无WBC渗出的病理改变一致。
在肾炎的发生过程中，补体和中性粒细胞有着密切关系。免疫复合物激活补体产生化学趋化因子C3a、C5a，吸引循环中的粒细胞聚集于抗原抗体反应部位，释放蛋白酶及ROM等炎性介质，导致组织损伤。有人推测由于MN免疫复合物主要沉积于上皮下，产生的化学趋化因子也位于上皮下，因此与循环中的粒细胞相距较远，难以吸引中性粒细胞到免疫复合物沉积部位，所以MN无中性粒细胞在肾小球内渗出。而抗GBM肾炎、SLE等的免疫复合物主要沉积于内皮下，它们激活补体产生的趋化因子能吸引循环中的粒细胞，引起渗出性病变，并引起一系列依赖中性粒细胞的损害，如H202-MPO-卤素系统参与的损害.(收稿：1993-09-24 修回：1994-01-28), http://www.100md.com