柴芩感冒药对呼吸道合胞病毒的抑制作用
作者：黄升海 龚蕴贞 胡涛 林维芬 赵兰娟 余莉
单位：安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032
关键词：呼吸道合胞病毒；药物作用；呼吸道感染；中医药疗法
安徽医科大学学报000312
摘要 目的 研究柴芩感冒药对呼吸道合胞病毒(RSV)的体外抑制作用。方法 微量细胞病变抑制法。从药物的最大无毒量(TD0)开始，作连续2倍系列稀释6个浓度，每一浓度均做4孔，分别加入已感染RSV的单层HeLa细胞中，整个实验重复3次。按Reed-Muench法计算产生50%病变抑制的药物浓度，即药物的半数有效量(IC50)，并计算治疗指数(TI)。结果 柴芩感冒药的IC50为(31±7.07) mg.L-1，TI值为28.88±4.05；中药对照金莲清热颗粒和西药对照利巴韦林注射液的IC50和TI值分别为(36±5.66) mg.L-1、18±2.8和(23.43±5.09)mg.L-1、93±10.7。结论 柴芩感冒药的抗RSV效果略好于金莲，但较利巴韦林的药效差。
, 百拇医药
自由词 柴芩感冒药
中图分类号 R563；R287
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0196-03
Inhibiting effects of ChaiQin Particles on
respiratory syncytial virus infection in vitro
Huang Shenghai,Gong Yunzhen, Hu Tao et al
(Dept of Aetiology, Anhui Medical University,Hefei 230032)
, 百拇医药 Abstract Objective To study the effects of ChaiQin Particles for common cold as inhibitor of respiratory syncytial virus (RSV) infection in vitro. Methods The anti-RSV effects in HeLa cell line were observed by microcytopathic-inhibiting-test. According to Reed-Muench assay,the effective dose of 50 percentage (IC50) and treatment index(TI) were measured. Results Its IC50 and TI to 100 TCID50 RSV-Long strain were 31±7.07 mg.L-1 and 28.88±4.05 respectively when diluted by 2-fold series, the positive medicine of JinLian antipyretic and rabavirin IC50 and TI were 36±5.66 mg.L-1,18±2.8 and 23.43±5.09 mg.L-1，93±10.7 respectively. Conclusion ChaiQin Particles as a inhibits RSV-Long strain to a certain degree in vitro,it is better than Jin Lian antipyretic but worse than ribavirin.
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MeSH respiratory syncytial virus/drug eff; respiratory tract infections/TCM ther
Free Word Chai Qin
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)属于副粘病毒科肺炎病毒属，与副流感病毒等同为一属，均为单负股RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病〔1〕。目前对病毒性感冒尚无有效的治疗措施，最近安徽中医学院课题组从柴胡、黄芩等中药中提取活性成分，制成中药复方“柴芩感冒药”，临床有一定疗效。本研究对该药进行了RSV的体外抗病毒试验，并判断其抗病毒效果。现报道如下。
1 材料
1.1 药物 “柴芩感冒药”，颗粒型，取5 g溶解于10 ml无菌双蒸水中，0.22 μm滤膜除菌过滤，无菌试验96 h(-)，4℃保存待测。金莲清热颗粒(无糖型，宁夏中药厂(94)卫药准字Z-09号)，5 g溶解于10 ml无菌双蒸水中，处理方法同待测定药物。利巴韦林注射液〔沪卫药准字(1995)第007170号，批号B980605，中国信谊药厂〕，剂型1 ml装(100 mg)。
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1.2 病毒 为RSV-Long株，购自湖北省医科院病毒所。HeLa细胞传代后滴定其50%组织细胞感染剂量(TCID50)为1×10-5.6，分装后作为种子病毒，-85℃冻存备用，用于正式实验。
1.3 细胞 为HeLa细胞传代株，本室常规使用。
1.4 主要设备 CO2恒温培养箱(日本大和科学株式会社)，倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)，-85℃超低温冰箱(日本三洋公司)，液氮贮存罐(四川亚西机器厂)，96孔细胞培养板(美国B.D公司)等。
2 方法
2.1 药物对HeLa细胞的毒性测定 以50 mg.ml-1柴芩感冒药为原液，用无血清的DMEM作连续10倍系列稀释后接种于已形成单层的HeLa细胞中，每孔100 μl，每一稀释度重复4孔，以DMEM液代替药物作为正常细胞对照，37℃ 0.05(体积分数，下同)CO2孵育。动态观察结果，记录由药物产生的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，按Reed-Muench法〔2〕计算CPE不再进展时(约72 h)药物的半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)〔3〕。阳性对照药金莲清热颗粒和利巴韦林的细胞毒性测定以同法同时进行。
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图1 药物对RSV-Long株的体外抑制试验
a.细胞对照；b.病毒对照；c.柴芩感冒药；d.金莲清热颗粒；e.利巴韦林注射液
2.2 药物对RSV-Long株病毒的抑制作用 柴芩感冒药、金莲清热颗粒和利巴韦林3种药物在同一块96孔板中同时进行。倾去已形成单层的HeLa细胞培养上清，加入100 TCID50 RSV-Long株病毒(种子病毒取0.1 ml作1×10-3.6倍稀释即得)，每孔100 μl，37℃吸附1 h后甩去上清，用PBS洗2次，洗去游离病毒。选用三种药物的最大无毒浓度(TD0)为第一孔，以无血清的DMEM作连续2倍系列稀释6个浓度，每个浓度均做4孔，分别加入上述已感染病毒的HeLa细胞孔内，每孔100 μl，33℃ 0.05 CO2培养，同时分别设立正常细胞对照及病毒对照。连续动态观察，以细胞对照形态正常，CPE(-)，病毒对照CPE达“”时记录结果(RSV致CPE特征是感染细胞与邻近细胞融合，形成合胞体。病变范围<25%为+，25%～50%为，50%～75%为，>75%为)。按Reed-Muench法计算3种药物对RSV致CPE产生50%抑制的浓度，即药物的半数有效量(IC50)。整个实验重复3次(n=3)，计算IC50平均值，并对3种药物的结果进行分析，经固定染色后拍照〔4〕。
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2.3 药物治疗指数(TI) 按TI=TD50/IC50进行计算〔5〕。
3 结果
3.1 药物对HeLa细胞的毒性作用 以量化单位药物半数中毒量TD50和最大无毒量TD0来表示，结果见表1。
可见3种药物在高浓度时对HeLa细胞均有一定的毒性作用。我们在进行药物的抗病毒试验时选用药物的最大无毒量TD0开始，以排除药物本身的CPE干扰，保证结果的正确性、可靠性。
表1 药物对HeLa细胞的毒性作用(mg.L-1) 药 物
TD50
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TD0
柴芩感冒药
869
50
金 莲
644
50
利巴韦林
2180
100
3.2 药物对RSV-Long株的抑制作用 将柴芩感冒药及阳性对照药分别作连续2倍系列稀释后，与100 TCID50 RSV-Long株进行抑病毒试验，计算药物的抑病毒百分率及半数有效量IC50，结果见表2和图1。由表2可见，柴芩感冒药的IC50介于两种阳性对照药之间，其体外抗RSV-Long株的效果略好于金莲，但较利巴韦林的差。
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表2 药物对RSV-Long株的IC50(
±s,mg.L-1) 药 物
IC50
柴芩感冒药
31±7.07
金 莲
36±5.66
利巴韦林
23.43±5.09
3.3 TI值大小 经计算3种药物的TI结果见表3。TI值愈大，表明药物的安全范围愈大，可见柴芩感冒药的安全范围大于金莲而小于利巴韦林。
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表3 药物的治疗指数TI(±s) 药 物
TI值
柴芩感冒药
28.88±4.05
金 莲
18±2.8
利巴韦林
93±10.7
3 讨论
呼吸道感染是一种常见病、多发病，临床表现多种多样，其病原相当复杂。但呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，如RSV、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)等等。目前对病毒性疾病尚缺乏有效的防治措施，特别是对易产生变异的病毒如RSV、IFV等。实践已证明许多中草药具有较好的抗病毒作用，而且毒副作用小或无，价格便宜，来源简便，本研究即是从柴胡、黄芩等中药中提取有效成分，组成中药复方“柴芩感冒药”，以RNA类病毒RSV作为实验对象，严格按照卫生部药政局“新药临床前研究指导原则”的要求，从量的水平上以微量细胞培养法进行药物的抗病毒试验。试验中选用RSV作为对象具有较好的代表性，并且以微孔板法进行具有灵敏度高、药物及各种材料用量少、操作简便、省时省力等优点。操作中我们参照苦参粗提液体外抗病毒作用的方法，但有不同，苦参经不同浓度稀释后与100 TCID50病毒直接作用1 h后再定量加入相应细胞中，本试验为待HeLa细胞形成单层后加入100 TCID50病毒，经吸附1 h和PBS洗2次后再加入不同浓度的药物，以避免药物对细胞外病毒的直接作用，从而降低药效影响试验的准确性。实验中同时设立两种阳性对照药，一是金莲清热颗粒，另一是利巴韦林(西药)，待测药与阳性对照药在同一块96孔板中同时进行，所有条件一致，因此所得结果可信，具良好的可比性。重复实验3次结果一致，且批间差异不大，反应稳定。
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从体外抗病毒试验结果看，柴芩感冒药的半数有效量(IC50)为(31±7.07) mg.L-1，与金莲清热颗粒和利巴韦林相比，小于金莲清热颗粒而大于利巴韦林注射液；并且柴芩感冒药的安全范围大于金莲而小于利巴韦林，所以柴芩感冒药的体外抗RSV效果优于金莲清热颗粒，但较利巴韦林的药效差。本研究仅仅是在体外细胞培养中进行，至于体内药效是否与体外结果相一致有待进一步研究。
作者简介：黄升海，男，31岁，硕士，讲师。研究方向：医学病毒学
参考文献
1 顾方舟，曹逸云，董德祥等译.病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993：562
2 中国医学科学院流行病防治研究所编.常见病毒病实验技术.北京：科学出版社，1978：34～37
, 百拇医药
3 中华人民共和国卫生部药政局.抗病毒药物药效指导原则.新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993：164～171
4 Schinazi RF，Nahmias AJ. Different in vitro effects of dual combinations of anti-Herpes simplex virus compounds. American Journal of Medicine,1982;73(1A):40～47
5 张均田主编.现代药理实验方法(下册).北京：北京医科大学与中国协和医科大学联合出版社，1998：1 430～1 431
1999-10-22收稿，2000-04-24修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032
关键词：呼吸道合胞病毒；药物作用；呼吸道感染；中医药疗法
安徽医科大学学报000312
摘要 目的 研究柴芩感冒药对呼吸道合胞病毒(RSV)的体外抑制作用。方法 微量细胞病变抑制法。从药物的最大无毒量(TD0)开始，作连续2倍系列稀释6个浓度，每一浓度均做4孔，分别加入已感染RSV的单层HeLa细胞中，整个实验重复3次。按Reed-Muench法计算产生50%病变抑制的药物浓度，即药物的半数有效量(IC50)，并计算治疗指数(TI)。结果 柴芩感冒药的IC50为(31±7.07) mg.L-1，TI值为28.88±4.05；中药对照金莲清热颗粒和西药对照利巴韦林注射液的IC50和TI值分别为(36±5.66) mg.L-1、18±2.8和(23.43±5.09)mg.L-1、93±10.7。结论 柴芩感冒药的抗RSV效果略好于金莲，但较利巴韦林的药效差。
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自由词 柴芩感冒药
中图分类号 R563；R287
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0196-03
Inhibiting effects of ChaiQin Particles on
respiratory syncytial virus infection in vitro
Huang Shenghai,Gong Yunzhen, Hu Tao et al
(Dept of Aetiology, Anhui Medical University,Hefei 230032)
, 百拇医药 Abstract Objective To study the effects of ChaiQin Particles for common cold as inhibitor of respiratory syncytial virus (RSV) infection in vitro. Methods The anti-RSV effects in HeLa cell line were observed by microcytopathic-inhibiting-test. According to Reed-Muench assay,the effective dose of 50 percentage (IC50) and treatment index(TI) were measured. Results Its IC50 and TI to 100 TCID50 RSV-Long strain were 31±7.07 mg.L-1 and 28.88±4.05 respectively when diluted by 2-fold series, the positive medicine of JinLian antipyretic and rabavirin IC50 and TI were 36±5.66 mg.L-1,18±2.8 and 23.43±5.09 mg.L-1，93±10.7 respectively. Conclusion ChaiQin Particles as a inhibits RSV-Long strain to a certain degree in vitro,it is better than Jin Lian antipyretic but worse than ribavirin.
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MeSH respiratory syncytial virus/drug eff; respiratory tract infections/TCM ther
Free Word Chai Qin
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)属于副粘病毒科肺炎病毒属，与副流感病毒等同为一属，均为单负股RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病〔1〕。目前对病毒性感冒尚无有效的治疗措施，最近安徽中医学院课题组从柴胡、黄芩等中药中提取活性成分，制成中药复方“柴芩感冒药”，临床有一定疗效。本研究对该药进行了RSV的体外抗病毒试验，并判断其抗病毒效果。现报道如下。
1 材料
1.1 药物 “柴芩感冒药”，颗粒型，取5 g溶解于10 ml无菌双蒸水中，0.22 μm滤膜除菌过滤，无菌试验96 h(-)，4℃保存待测。金莲清热颗粒(无糖型，宁夏中药厂(94)卫药准字Z-09号)，5 g溶解于10 ml无菌双蒸水中，处理方法同待测定药物。利巴韦林注射液〔沪卫药准字(1995)第007170号，批号B980605，中国信谊药厂〕，剂型1 ml装(100 mg)。
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1.2 病毒 为RSV-Long株，购自湖北省医科院病毒所。HeLa细胞传代后滴定其50%组织细胞感染剂量(TCID50)为1×10-5.6，分装后作为种子病毒，-85℃冻存备用，用于正式实验。
1.3 细胞 为HeLa细胞传代株，本室常规使用。
1.4 主要设备 CO2恒温培养箱(日本大和科学株式会社)，倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)，-85℃超低温冰箱(日本三洋公司)，液氮贮存罐(四川亚西机器厂)，96孔细胞培养板(美国B.D公司)等。
2 方法
2.1 药物对HeLa细胞的毒性测定 以50 mg.ml-1柴芩感冒药为原液，用无血清的DMEM作连续10倍系列稀释后接种于已形成单层的HeLa细胞中，每孔100 μl，每一稀释度重复4孔，以DMEM液代替药物作为正常细胞对照，37℃ 0.05(体积分数，下同)CO2孵育。动态观察结果，记录由药物产生的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，按Reed-Muench法〔2〕计算CPE不再进展时(约72 h)药物的半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)〔3〕。阳性对照药金莲清热颗粒和利巴韦林的细胞毒性测定以同法同时进行。
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图1 药物对RSV-Long株的体外抑制试验
a.细胞对照；b.病毒对照；c.柴芩感冒药；d.金莲清热颗粒；e.利巴韦林注射液
2.2 药物对RSV-Long株病毒的抑制作用 柴芩感冒药、金莲清热颗粒和利巴韦林3种药物在同一块96孔板中同时进行。倾去已形成单层的HeLa细胞培养上清，加入100 TCID50 RSV-Long株病毒(种子病毒取0.1 ml作1×10-3.6倍稀释即得)，每孔100 μl，37℃吸附1 h后甩去上清，用PBS洗2次，洗去游离病毒。选用三种药物的最大无毒浓度(TD0)为第一孔，以无血清的DMEM作连续2倍系列稀释6个浓度，每个浓度均做4孔，分别加入上述已感染病毒的HeLa细胞孔内，每孔100 μl，33℃ 0.05 CO2培养，同时分别设立正常细胞对照及病毒对照。连续动态观察，以细胞对照形态正常，CPE(-)，病毒对照CPE达“”时记录结果(RSV致CPE特征是感染细胞与邻近细胞融合，形成合胞体。病变范围<25%为+，25%～50%为，50%～75%为，>75%为)。按Reed-Muench法计算3种药物对RSV致CPE产生50%抑制的浓度，即药物的半数有效量(IC50)。整个实验重复3次(n=3)，计算IC50平均值，并对3种药物的结果进行分析，经固定染色后拍照〔4〕。
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2.3 药物治疗指数(TI) 按TI=TD50/IC50进行计算〔5〕。
3 结果
3.1 药物对HeLa细胞的毒性作用 以量化单位药物半数中毒量TD50和最大无毒量TD0来表示，结果见表1。
可见3种药物在高浓度时对HeLa细胞均有一定的毒性作用。我们在进行药物的抗病毒试验时选用药物的最大无毒量TD0开始，以排除药物本身的CPE干扰，保证结果的正确性、可靠性。
表1 药物对HeLa细胞的毒性作用(mg.L-1) 药 物
TD50
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TD0
柴芩感冒药
869
50
金 莲
644
50
利巴韦林
2180
100
3.2 药物对RSV-Long株的抑制作用 将柴芩感冒药及阳性对照药分别作连续2倍系列稀释后，与100 TCID50 RSV-Long株进行抑病毒试验，计算药物的抑病毒百分率及半数有效量IC50，结果见表2和图1。由表2可见，柴芩感冒药的IC50介于两种阳性对照药之间，其体外抗RSV-Long株的效果略好于金莲，但较利巴韦林的差。
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表2 药物对RSV-Long株的IC50(
±s,mg.L-1) 药 物IC50
柴芩感冒药
31±7.07
金 莲
36±5.66
利巴韦林
23.43±5.09
3.3 TI值大小 经计算3种药物的TI结果见表3。TI值愈大，表明药物的安全范围愈大，可见柴芩感冒药的安全范围大于金莲而小于利巴韦林。
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表3 药物的治疗指数TI(
±s) 药 物TI值
柴芩感冒药
28.88±4.05
金 莲
18±2.8
利巴韦林
93±10.7
3 讨论
呼吸道感染是一种常见病、多发病，临床表现多种多样，其病原相当复杂。但呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，如RSV、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)等等。目前对病毒性疾病尚缺乏有效的防治措施，特别是对易产生变异的病毒如RSV、IFV等。实践已证明许多中草药具有较好的抗病毒作用，而且毒副作用小或无，价格便宜，来源简便，本研究即是从柴胡、黄芩等中药中提取有效成分，组成中药复方“柴芩感冒药”，以RNA类病毒RSV作为实验对象，严格按照卫生部药政局“新药临床前研究指导原则”的要求，从量的水平上以微量细胞培养法进行药物的抗病毒试验。试验中选用RSV作为对象具有较好的代表性，并且以微孔板法进行具有灵敏度高、药物及各种材料用量少、操作简便、省时省力等优点。操作中我们参照苦参粗提液体外抗病毒作用的方法，但有不同，苦参经不同浓度稀释后与100 TCID50病毒直接作用1 h后再定量加入相应细胞中，本试验为待HeLa细胞形成单层后加入100 TCID50病毒，经吸附1 h和PBS洗2次后再加入不同浓度的药物，以避免药物对细胞外病毒的直接作用，从而降低药效影响试验的准确性。实验中同时设立两种阳性对照药，一是金莲清热颗粒，另一是利巴韦林(西药)，待测药与阳性对照药在同一块96孔板中同时进行，所有条件一致，因此所得结果可信，具良好的可比性。重复实验3次结果一致，且批间差异不大，反应稳定。
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从体外抗病毒试验结果看，柴芩感冒药的半数有效量(IC50)为(31±7.07) mg.L-1，与金莲清热颗粒和利巴韦林相比，小于金莲清热颗粒而大于利巴韦林注射液；并且柴芩感冒药的安全范围大于金莲而小于利巴韦林，所以柴芩感冒药的体外抗RSV效果优于金莲清热颗粒，但较利巴韦林的药效差。本研究仅仅是在体外细胞培养中进行，至于体内药效是否与体外结果相一致有待进一步研究。
作者简介：黄升海，男，31岁，硕士，讲师。研究方向：医学病毒学
参考文献
1 顾方舟，曹逸云，董德祥等译.病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993：562
2 中国医学科学院流行病防治研究所编.常见病毒病实验技术.北京：科学出版社，1978：34～37
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3 中华人民共和国卫生部药政局.抗病毒药物药效指导原则.新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993：164～171
4 Schinazi RF，Nahmias AJ. Different in vitro effects of dual combinations of anti-Herpes simplex virus compounds. American Journal of Medicine,1982;73(1A):40～47
5 张均田主编.现代药理实验方法(下册).北京：北京医科大学与中国协和医科大学联合出版社，1998：1 430～1 431
1999-10-22收稿，2000-04-24修回, 百拇医药