巢式聚合酶链反应检测早产儿肺透明膜病石蜡包埋肺组织巨细胞病毒
作者：
赵孟陶 陶英纯 郭津津 孟素芹
单位：110014沈阳市妇婴医院(赵孟陶、陶英纯、孟素芹)；中国医科大学第二临主床学院病毒室(郭津津)
关键词：
中华儿科杂志981017 用巢式聚合酶链反应(nested polymearase chain reaction, Nest PCR)检测早产儿肺透明膜病(HMD)死亡病例的石蜡包埋肺组织中巨细胞病毒(CMV)DNA，探讨宫内感染CMV与HMD发生的关系，为探讨HMD发病诱因提供依据。
对象及方法：(1)对象：经本院病理科确诊为HMD的早产儿，选择资料完整的30例，检查肺组织(HE染色)中巨细胞包涵体，其中阳性11例(36.7%)，胎龄28～30周3例，～34周8例，男4例，女7例。阴性19例，胎龄30周4例，～34周12例，～36例3例，男13例，女6例。(2)方法：取此30例石蜡包埋肺组织，用Nest PCR检测CMV DNA。取肺组织块一片(10 μm)，用二甲苯脱石蜡，然后1.5 ml乙醇梯度洗，离心、弃上清，加入100 μl PK缓冲液，75℃30分钟灭DNA酶，加入10 μl蛋白酶K(10 mg/ml)55℃2小时，加入TTN缓冲液，混匀、煮沸15分钟，离心、上清备用。选择CMV IE区核酸序列合成两对引物，外引物产物为289 bp，内引物产物为162 bp(上海生物化学研究所协助完成)。取DNA提取液5 μl，加10×PCR缓冲液6 μl，引物dNTP、TaqDNA聚合酶(购自上海复兴生物工程公司)，置MJ-200 PCR扩增仪上扩增，经35个循环完成第一次扩增。取第一次PCR产物1 μl，再经35个循环得扩增产物。结果判定：分别取第一次和第二次PCR产物10 μl，经溴化乙锭染色，于2%琼脂糖凝胶板上电泳30分钟，在紫外灯下观察特异性DNA光带，出现289 bp和(或)162 bp特异性莹光条带为阳性。特异性实验证实，引物与其他疱疹病毒(单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型、带状疱疹病毒)无交叉反应。分析样品同时设PCR阴性对照和阳性对照。
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结果：1.肺组织中检出巨细胞包涵体的11例CMV DNA均为阳性(36.7%)；未检出的19例无一例检出CMV DNA，表明光镜下检出肺组织内巨细胞包涵体阳性病例为宫内感染CMV。
2.临床表现：两组病例发病距出生时间均在2小时内，生后48小时内均无发热。阳性组3例于生后24小时内出现黄疸，肝在助下3.0～3.5 cm(除外母子血型不合溶血症)；1例见上臂有大小不等的紫癜(血小板100×109/L)。存活时间：阳性组33.5±17.9小时，阴性组28.0±33.3小时，均死于心、脑、肾功能衰竭和DIC。
3.实验室检查：生后1～2小时血气分析显示，pH值阳性组(7.09±0.05)明显低于阴性组(7.24±0.02)(t=11.54，P<0.01)，BE值阳性组(-18.2±3.3 mmol/L)明显大于阴性组(-10.5±1.9 mmol/L)，(t=8.19，P<0.01)。生后≤48小时外周血显示，两组白细胞总数和分数均在正常范围，B/S比值分别为阳性组0.06，阴性组0.04；检测C反应蛋白两组均为阴性；免疫球蛋白IgM均为阴性，IgG分别为阳性组6.4 g±0.6 g，阴性组5.7±1.2 g。
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4.两组病例均于生后30分钟抽取胃液涂片做革兰氏染色，在光镜下未找到细菌。30例中12例曾做胃液泡沫试验，结果均为阴性。
5.胸部X线检查：两组患儿均于入院后12小时内摄胸部仰卧位平片，部分病例隔12小时重复摄片。主要见双肺透光度减弱，肺内广泛分布细小颗粒影，部分病例呈毛玻璃状，支气管充气征阳性。绝大部分病例有不同程度肺不张，心缘模糊。两组胸片未见明显差异。
6.病理检查：在光镜下见肺泡壁、细支气管壁附着嗜伊红膜状物，绝大部分形成圆圈，均贴壁，伴有不同程度肺萎陷和肺水肿；肺出血以肺泡出血为主。存活期<10小时者透明膜形成不全，断续游离于肺泡壁。11例CMV-DNA阳性见巨细胞包涵体于肺泡壁、肺间质及终末气道；还见于肝脏(9/11)，心肌、脑、胸腺、胰腺和甲状腺各1例。存活期>24小时者见嗜中性粒细胞及单核细胞浸润5例。两组部分病例见肺微血管内凝血及微血栓。
讨论：本组病例均生后2小时内发病，临床表现、胸部X线平片及光镜下肺组织切片所见均符合HMD诊断。在检查的30例肺组织中检出巨细胞包涵体阳性占36.7%，11例阳性经Nest PCR检测均检出CMV DNA，表明这些病例胎儿期感染CMV，肺组织被浸染。资料表明[1，2]，妊娠早、中、晚期胎盘CMV DNA阳性检出率26.67%～66.67%；CMV宫内传播率33.33%～78.26%；早产率CMV IgM阳性孕妇为20.24%，CMV IgM阴性孕妇为4.62%。表明孕母在CMV活动性感染期，病毒通过胎盘易感染未成熟胎儿。本组CMV DNA阳性患儿胎龄均≤34周，对防御和调节CMV感染至关重要的免疫应答发育不完善，免疫调节功能紊乱，影响干扰素功能低下，允许病毒在细胞内缓慢增殖，造成脏器损害。病理检查表明，巨细胞包涵体除肺组织外，肝脏和其他组织也能见到。提示胎儿在病毒血症期肺及其他脏器被侵染，CMV在未成熟胎儿肺内缓慢增殖时，肺表面活性物质的合成、分泌可能受到抑制，或活性受到影响，对诱发HMD起一定的作用。
参考文献
1 黄海燕，翁霞云，沈荣森.用巢式聚合酶链反应技术诊断人巨细胞病毒宫内感染.中华妇产科杂志，1995，30：454～456.
2 杨仁美，顾昌彦，李天宪，等.妊娠妇女及围产儿巨细胞病毒感染的研究.中华妇产科杂志，1994，29：144～146.
(收稿：1997-11-13 修回：1998-06-01), 百拇医药
赵孟陶 陶英纯 郭津津 孟素芹
单位：110014沈阳市妇婴医院(赵孟陶、陶英纯、孟素芹)；中国医科大学第二临主床学院病毒室(郭津津)
关键词：
中华儿科杂志981017 用巢式聚合酶链反应(nested polymearase chain reaction, Nest PCR)检测早产儿肺透明膜病(HMD)死亡病例的石蜡包埋肺组织中巨细胞病毒(CMV)DNA，探讨宫内感染CMV与HMD发生的关系，为探讨HMD发病诱因提供依据。
对象及方法：(1)对象：经本院病理科确诊为HMD的早产儿，选择资料完整的30例，检查肺组织(HE染色)中巨细胞包涵体，其中阳性11例(36.7%)，胎龄28～30周3例，～34周8例，男4例，女7例。阴性19例，胎龄30周4例，～34周12例，～36例3例，男13例，女6例。(2)方法：取此30例石蜡包埋肺组织，用Nest PCR检测CMV DNA。取肺组织块一片(10 μm)，用二甲苯脱石蜡，然后1.5 ml乙醇梯度洗，离心、弃上清，加入100 μl PK缓冲液，75℃30分钟灭DNA酶，加入10 μl蛋白酶K(10 mg/ml)55℃2小时，加入TTN缓冲液，混匀、煮沸15分钟，离心、上清备用。选择CMV IE区核酸序列合成两对引物，外引物产物为289 bp，内引物产物为162 bp(上海生物化学研究所协助完成)。取DNA提取液5 μl，加10×PCR缓冲液6 μl，引物dNTP、TaqDNA聚合酶(购自上海复兴生物工程公司)，置MJ-200 PCR扩增仪上扩增，经35个循环完成第一次扩增。取第一次PCR产物1 μl，再经35个循环得扩增产物。结果判定：分别取第一次和第二次PCR产物10 μl，经溴化乙锭染色，于2%琼脂糖凝胶板上电泳30分钟，在紫外灯下观察特异性DNA光带，出现289 bp和(或)162 bp特异性莹光条带为阳性。特异性实验证实，引物与其他疱疹病毒(单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型、带状疱疹病毒)无交叉反应。分析样品同时设PCR阴性对照和阳性对照。
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结果：1.肺组织中检出巨细胞包涵体的11例CMV DNA均为阳性(36.7%)；未检出的19例无一例检出CMV DNA，表明光镜下检出肺组织内巨细胞包涵体阳性病例为宫内感染CMV。
2.临床表现：两组病例发病距出生时间均在2小时内，生后48小时内均无发热。阳性组3例于生后24小时内出现黄疸，肝在助下3.0～3.5 cm(除外母子血型不合溶血症)；1例见上臂有大小不等的紫癜(血小板100×109/L)。存活时间：阳性组33.5±17.9小时，阴性组28.0±33.3小时，均死于心、脑、肾功能衰竭和DIC。
3.实验室检查：生后1～2小时血气分析显示，pH值阳性组(7.09±0.05)明显低于阴性组(7.24±0.02)(t=11.54，P<0.01)，BE值阳性组(-18.2±3.3 mmol/L)明显大于阴性组(-10.5±1.9 mmol/L)，(t=8.19，P<0.01)。生后≤48小时外周血显示，两组白细胞总数和分数均在正常范围，B/S比值分别为阳性组0.06，阴性组0.04；检测C反应蛋白两组均为阴性；免疫球蛋白IgM均为阴性，IgG分别为阳性组6.4 g±0.6 g，阴性组5.7±1.2 g。
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4.两组病例均于生后30分钟抽取胃液涂片做革兰氏染色，在光镜下未找到细菌。30例中12例曾做胃液泡沫试验，结果均为阴性。
5.胸部X线检查：两组患儿均于入院后12小时内摄胸部仰卧位平片，部分病例隔12小时重复摄片。主要见双肺透光度减弱，肺内广泛分布细小颗粒影，部分病例呈毛玻璃状，支气管充气征阳性。绝大部分病例有不同程度肺不张，心缘模糊。两组胸片未见明显差异。
6.病理检查：在光镜下见肺泡壁、细支气管壁附着嗜伊红膜状物，绝大部分形成圆圈，均贴壁，伴有不同程度肺萎陷和肺水肿；肺出血以肺泡出血为主。存活期<10小时者透明膜形成不全，断续游离于肺泡壁。11例CMV-DNA阳性见巨细胞包涵体于肺泡壁、肺间质及终末气道；还见于肝脏(9/11)，心肌、脑、胸腺、胰腺和甲状腺各1例。存活期>24小时者见嗜中性粒细胞及单核细胞浸润5例。两组部分病例见肺微血管内凝血及微血栓。
讨论：本组病例均生后2小时内发病，临床表现、胸部X线平片及光镜下肺组织切片所见均符合HMD诊断。在检查的30例肺组织中检出巨细胞包涵体阳性占36.7%，11例阳性经Nest PCR检测均检出CMV DNA，表明这些病例胎儿期感染CMV，肺组织被浸染。资料表明[1，2]，妊娠早、中、晚期胎盘CMV DNA阳性检出率26.67%～66.67%；CMV宫内传播率33.33%～78.26%；早产率CMV IgM阳性孕妇为20.24%，CMV IgM阴性孕妇为4.62%。表明孕母在CMV活动性感染期，病毒通过胎盘易感染未成熟胎儿。本组CMV DNA阳性患儿胎龄均≤34周，对防御和调节CMV感染至关重要的免疫应答发育不完善，免疫调节功能紊乱，影响干扰素功能低下，允许病毒在细胞内缓慢增殖，造成脏器损害。病理检查表明，巨细胞包涵体除肺组织外，肝脏和其他组织也能见到。提示胎儿在病毒血症期肺及其他脏器被侵染，CMV在未成熟胎儿肺内缓慢增殖时，肺表面活性物质的合成、分泌可能受到抑制，或活性受到影响，对诱发HMD起一定的作用。
参考文献
1 黄海燕，翁霞云，沈荣森.用巢式聚合酶链反应技术诊断人巨细胞病毒宫内感染.中华妇产科杂志，1995，30：454～456.
2 杨仁美，顾昌彦，李天宪，等.妊娠妇女及围产儿巨细胞病毒感染的研究.中华妇产科杂志，1994，29：144～146.
(收稿：1997-11-13 修回：1998-06-01), 百拇医药