成人骨髓基质细胞培养
作者：姜红江 孙文学 鞠成朝 谭训香
单位：山东省文登市整骨医院骨伤研究所264400
关键词：骨；细胞学；骨髓基质细胞培养；方法；实验研究；人
中医正骨000502 提 要 为研究成人骨髓基质细胞的体外培养及其成骨特性，将来自需取髂骨的9例患者的骨髓标本进行体外培养，传代细胞进行含10-8mmo1.L-1地塞米松的条件培养和不含地塞米松的非条件培养。倒置显微镜每日观察细胞生长情况，计数传代细胞中骨样细胞转化率，检测碱性磷酸酶含量。9例标本骨髓基质细胞培养均获得成功，条件培养后有较高的成骨细胞转化率及碱性磷酸酶活性。结果表明，成人骨髓基质细胞条件培养后，可做为临床所需的成骨种子细胞来源。
中图分类号：Q813.1+1 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)05-0005-02
, 百拇医药
THE CULTURE OF STROMA CELLS OF ADULT BONE MARROW
Jiang Hongjiang，Sun Wenxue，Ju Chengchao
(Wendeng Orthopedic-Traumatological Hospital and Institute, Shandong Province 264400)
In order to study the in-vitro culture of adult bone marrow stroma cells and its osteogenic characteristics, nine bone marrow specimens from the ilia of the patients receiving iliac grafting were cultured in-vitro, and the subcultures were cultured with conditions containing 10-8 mmol. L-1 dexamesthasone (DXM) and with no conditions. The every-day growth of the cells was observed with inverted microscope, the transmission rates of the ossiform cells in the subcultured cells were counted, and the contents of AKP were measured. The bone marrow stroma cells were successfully cultured in all the nine specimens. A higher transmission rate of osteoblasts and a higher AKP activity were obtained in the culture with conditions. The results showed that the adult bone marrow stroma cells cultured with conditions may offer a source of the osteogenous seed cells for the clinical requirement.
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Key Words: bone/cytology bone marrow stroma cell culture/methology experimental study man
骨髓的成骨作用早已被证实，临床上应用骨髓注射或复合替代材料治疗骨缺损、骨不连已取得良好疗效〔1〕。目前所知，骨髓的成骨能力来源于骨髓基质系统的基质细胞〔2〕。如果能将骨髓基质细胞在体外培养、分化后再移植，势必有良好的应用前途。关于成人骨髓基质细胞培养及成骨研究，国内尚未见报道。本实验采用成人骨髓悬液培养，对成人骨髓基质细胞体外培养及成骨特性做初步研究。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试剂 1640培养液(GIBCO)，新生牛血清(上海实生细胞有限公司)，胰酶蛋白酶(GIBCO)地塞米松(江苏兴化制药厂，生产批号：970273)，CO2培养箱(TC2323，美国HELL/TB)，倒置显微镜(IX70，日本OLMPUS)，全自动显微摄像系统(PM20，日本OLMPUS)，全自动生化分析仪(AU400，日本OLMPUS)，超净工作台(IHT，济南空气净化消毒设备厂)。
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1.2 取材 实验材料取自9例取髂骨患者，经血、尿分析无代谢性骨病。其中男6例，女3例；年龄28～60岁，平均39.2岁；5例为骨不连，2例为股骨干粉碎性骨折，1例为颈椎间盘突出，1例为腰椎滑脱。术中取髂骨时，用18号腰穿针反复抽吸抽取骨髓2ml，针管预先抽取1640培养液2ml(含15%新生牛血清，青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1，氟康唑3ug.ml-1)。
1.3 细胞培养 将抽取的4ml骨髓悬液经80目、100目钢网过滤后，加培养液18ml稀释，接种于75ml培养瓶中，置37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养。每3天换液1次，换液时振荡培养瓶，吸除培养液，以便清除未贴壁细胞。细胞长满后，用0.25%胰酶消化，分A、B两组，以5×(105.ml-1)的细胞浓度接种于7cm培养皿及50ml培养瓶中。培养皿预先放置4片盖玻片。24小时细胞贴壁后，A组换用含10-8mmol.L-1地塞米松的1640培养液，B组用1640培养液，每3～4天换液1次。
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2 培养细胞的鉴定
2.1 活体相差显微观察 用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况及形态变化。
2.2 碱性磷酸酶(AKP)细胞化学染色 分别于7、14天将生长细胞的盖玻片取出，95%乙醇固定15分钟，采用改良Gomri钙钴法〔3〕测定细胞内AKP活性。阳性细胞计数方法：每组分别计数2张盖玻片，每张于细胞多、中、少三区各取一区，每区计数500个细胞，计算出阳性细胞的百分比。
2.3 AKP含量的测定 于培养第7、14、21、28天取上清液2ml，全自动生化分析仪检测AKP含量。注意测AKP时，培养液换成含5%小牛血清，培养24小时后取上清。
3 结果
3.1 活体相差显微观察 骨髓悬液于接种72小时内，以造血细胞为主。随着培养时间延长，造血细胞逐渐清除，出现梭形外观的骨髓基质细胞(图1左)，部分区域形成细胞簇。换液2～3次后，造血细胞基本消失，11～14天后，细胞融合成单层，形态多为长梭形(图1右)。传代细胞条件培养后，增殖速度较非条件组减慢，贴壁细胞呈长梭形或大多角形，单个核，核大，1～2个核仁。培养2周后，细胞基本连成片，胞浆内出现均一的黑色颗粒，随着培养时间的延长，细胞聚集成团，并形成层状结构。
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3.2 AKP细胞化学染色 经AKP孵育液及HE复染后，条件培养AKP阳性率明显高于非条件组(图2左)。阳性细胞可见灰黑色细小颗粒，有些融合成黑色块状，为AKP含量极高的细胞，明显见于条件培养2周后(图2右)。阴性细胞见胞质呈均匀一致的淡红色，无颗粒状物。9例标本2周后阳性细胞率均在85%以上(附表)。
3.3 AKP含量测定 条件培养组AKP检测值明显高于非条件组，分泌高峰两组均在第14天，以后逐渐下降，分泌曲线对比见图3。
附表 AKP阳性细胞百分率 病例
阴性
阳性
阳性率(%)
1
216
, 百拇医药
1284
85.60
2
199
1301
86.73
3
188
1312
87.47
4
192
1308
, 百拇医药
87.20
5
164
1336
89.06
6
209
1291
86.07
7
211
1289
85.93
, 百拇医药
8
187
1313
87.53
9
207
1293
86.20
图1 AKP细胞活体相差显微片
图2 AKP细胞化学染色片
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图3 AKP分泌曲线图
4 讨 论
一百多年前，就有人观察到骨髓异位移植后的成骨现象。近些年来，骨髓基质干细胞的存在及其成骨潜能已被越来越多的实验证实。骨髓可分为造血及基质两大系统，其成骨能力来源于基质系统的基质干细胞。它具有多向分化潜能，可向成骨细胞、成纤维细胞、网织细胞和脂肪细胞等方向分化〔2，4〕。其体外成骨转化很大程度上依赖于培养条件，在骨形态发生蛋白、β-转化生长因子、地塞米松等因素诱导下，可明显提高其成骨转化率〔5，6〕。
本实验中，我们采用骨髓悬液培养法，只将骨髓与培养液按1∶10稀释不应用Ficoll梯度离心，简化了操作步骤，骨髓中的造血细胞经2～3次换液后基本清除，骨髓基质细胞得到良好的生长。贴壁细胞11～14天，便可连接成片。条件培养中加入10-8mmol.L-1地塞米松，以促进骨髓基质细胞向成骨方向转化，其转化率明显高于非条件组。贴壁细胞形态多为梭形或多角形，胞浆内存在均匀一致的分泌颗粒，细胞间不存在接触抑制，可形成层状结构，这些均符合成骨细胞的形态特征及生物学特性。AKP染色阳性是成骨细胞的重要特征，常用于骨细胞的鉴定。阳性细胞可见灰黑以至深黑色颗粒或片块状沉淀，阴性细胞经HE复染后为均一的红色。AKP的活力可反映成骨细胞的成骨活性，与其它反映成骨活性的骨钙素、骨连接蛋白等有良好的相关性。该实验中，传代细胞经条件培养后，85%以上的细胞AKP染色阳性，有些融合成片块状，呈强阳性；AKP定量检测分泌高峰出现于7～14天，显示了较强的成骨活性。体外培养的骨髓基质细胞，其成骨能力是确定的。
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鉴于骨髓经皮注射及其复合物移植治疗骨缺损、骨不连的成功报道，骨髓基质细胞体外培养移植或与其他载体复合移植治疗骨缺损、骨不连也是可行的。它不仅具有骨髓的取材方便、对供体损伤小、自体骨髓移植不存在排斥反应等优点，并且具有可提供足量移植细胞、人为控制移植时间、反复应用等优点。特别是如果能进一步改良其培养条件，促进骨髓基质细胞的增殖与成骨分化，其应用前景则更为广阔。
作者简介 姜红江，男，1971年生。1995年毕业于泰山医学院，获学士学位。1997年考入苏州医学院骨科，攻读硕士学位。毕业后分配到山东省文登市整骨医院骨伤研究所工作，主要从事骨与关节创伤及组织工程学等方面的研究。
参考文献
1，Connolly JF.Injectable bone marrow preparations to stimulate osteogenic repair.Clin Orthop 1995;313:8
, 百拇医药
2，Maniatopoulous C,Sodek J,Melcher AH.Bone formation invitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rat.Cell Tissue Res 1988;254:314
3，杨景山。医学细胞化学与细胞生物技术。北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990；42
4，Burwell RG.The function of bone marrow in the incorpora tion of a bone graft.Clin Orthop 1985;200:125
5，Locklin RM,Williamson MC,Beresford JN， et al.In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells Clin Orthop 1995;313:27
6，Santos EM,Radin S,Shenker BJ， et al.Si-Ca-P xerogels and bone morphogenetic protein act synergisctically on rat stromal marrow cell differention in vitro.JBiomed Mater Res 1998;41：87
(1999-12-13收稿 2000-03-03修回), 百拇医药
单位：山东省文登市整骨医院骨伤研究所264400
关键词：骨；细胞学；骨髓基质细胞培养；方法；实验研究；人
中医正骨000502 提 要 为研究成人骨髓基质细胞的体外培养及其成骨特性，将来自需取髂骨的9例患者的骨髓标本进行体外培养，传代细胞进行含10-8mmo1.L-1地塞米松的条件培养和不含地塞米松的非条件培养。倒置显微镜每日观察细胞生长情况，计数传代细胞中骨样细胞转化率，检测碱性磷酸酶含量。9例标本骨髓基质细胞培养均获得成功，条件培养后有较高的成骨细胞转化率及碱性磷酸酶活性。结果表明，成人骨髓基质细胞条件培养后，可做为临床所需的成骨种子细胞来源。
中图分类号：Q813.1+1 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)05-0005-02
, 百拇医药
THE CULTURE OF STROMA CELLS OF ADULT BONE MARROW
Jiang Hongjiang，Sun Wenxue，Ju Chengchao
(Wendeng Orthopedic-Traumatological Hospital and Institute, Shandong Province 264400)
In order to study the in-vitro culture of adult bone marrow stroma cells and its osteogenic characteristics, nine bone marrow specimens from the ilia of the patients receiving iliac grafting were cultured in-vitro, and the subcultures were cultured with conditions containing 10-8 mmol. L-1 dexamesthasone (DXM) and with no conditions. The every-day growth of the cells was observed with inverted microscope, the transmission rates of the ossiform cells in the subcultured cells were counted, and the contents of AKP were measured. The bone marrow stroma cells were successfully cultured in all the nine specimens. A higher transmission rate of osteoblasts and a higher AKP activity were obtained in the culture with conditions. The results showed that the adult bone marrow stroma cells cultured with conditions may offer a source of the osteogenous seed cells for the clinical requirement.
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Key Words: bone/cytology bone marrow stroma cell culture/methology experimental study man
骨髓的成骨作用早已被证实，临床上应用骨髓注射或复合替代材料治疗骨缺损、骨不连已取得良好疗效〔1〕。目前所知，骨髓的成骨能力来源于骨髓基质系统的基质细胞〔2〕。如果能将骨髓基质细胞在体外培养、分化后再移植，势必有良好的应用前途。关于成人骨髓基质细胞培养及成骨研究，国内尚未见报道。本实验采用成人骨髓悬液培养，对成人骨髓基质细胞体外培养及成骨特性做初步研究。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试剂 1640培养液(GIBCO)，新生牛血清(上海实生细胞有限公司)，胰酶蛋白酶(GIBCO)地塞米松(江苏兴化制药厂，生产批号：970273)，CO2培养箱(TC2323，美国HELL/TB)，倒置显微镜(IX70，日本OLMPUS)，全自动显微摄像系统(PM20，日本OLMPUS)，全自动生化分析仪(AU400，日本OLMPUS)，超净工作台(IHT，济南空气净化消毒设备厂)。
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1.2 取材 实验材料取自9例取髂骨患者，经血、尿分析无代谢性骨病。其中男6例，女3例；年龄28～60岁，平均39.2岁；5例为骨不连，2例为股骨干粉碎性骨折，1例为颈椎间盘突出，1例为腰椎滑脱。术中取髂骨时，用18号腰穿针反复抽吸抽取骨髓2ml，针管预先抽取1640培养液2ml(含15%新生牛血清，青霉素100U.ml-1，链霉素100μg.ml-1，氟康唑3ug.ml-1)。
1.3 细胞培养 将抽取的4ml骨髓悬液经80目、100目钢网过滤后，加培养液18ml稀释，接种于75ml培养瓶中，置37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养。每3天换液1次，换液时振荡培养瓶，吸除培养液，以便清除未贴壁细胞。细胞长满后，用0.25%胰酶消化，分A、B两组，以5×(105.ml-1)的细胞浓度接种于7cm培养皿及50ml培养瓶中。培养皿预先放置4片盖玻片。24小时细胞贴壁后，A组换用含10-8mmol.L-1地塞米松的1640培养液，B组用1640培养液，每3～4天换液1次。
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2 培养细胞的鉴定
2.1 活体相差显微观察 用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况及形态变化。
2.2 碱性磷酸酶(AKP)细胞化学染色 分别于7、14天将生长细胞的盖玻片取出，95%乙醇固定15分钟，采用改良Gomri钙钴法〔3〕测定细胞内AKP活性。阳性细胞计数方法：每组分别计数2张盖玻片，每张于细胞多、中、少三区各取一区，每区计数500个细胞，计算出阳性细胞的百分比。
2.3 AKP含量的测定 于培养第7、14、21、28天取上清液2ml，全自动生化分析仪检测AKP含量。注意测AKP时，培养液换成含5%小牛血清，培养24小时后取上清。
3 结果
3.1 活体相差显微观察 骨髓悬液于接种72小时内，以造血细胞为主。随着培养时间延长，造血细胞逐渐清除，出现梭形外观的骨髓基质细胞(图1左)，部分区域形成细胞簇。换液2～3次后，造血细胞基本消失，11～14天后，细胞融合成单层，形态多为长梭形(图1右)。传代细胞条件培养后，增殖速度较非条件组减慢，贴壁细胞呈长梭形或大多角形，单个核，核大，1～2个核仁。培养2周后，细胞基本连成片，胞浆内出现均一的黑色颗粒，随着培养时间的延长，细胞聚集成团，并形成层状结构。
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3.2 AKP细胞化学染色 经AKP孵育液及HE复染后，条件培养AKP阳性率明显高于非条件组(图2左)。阳性细胞可见灰黑色细小颗粒，有些融合成黑色块状，为AKP含量极高的细胞，明显见于条件培养2周后(图2右)。阴性细胞见胞质呈均匀一致的淡红色，无颗粒状物。9例标本2周后阳性细胞率均在85%以上(附表)。
3.3 AKP含量测定 条件培养组AKP检测值明显高于非条件组，分泌高峰两组均在第14天，以后逐渐下降，分泌曲线对比见图3。
附表 AKP阳性细胞百分率 病例
阴性
阳性
阳性率(%)
1
216
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1284
85.60
2
199
1301
86.73
3
188
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87.47
4
192
1308
, 百拇医药
87.20
5
164
1336
89.06
6
209
1291
86.07
7
211
1289
85.93
, 百拇医药
8
187
1313
87.53
9
207
1293
86.20
图1 AKP细胞活体相差显微片
图2 AKP细胞化学染色片
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图3 AKP分泌曲线图
4 讨 论
一百多年前，就有人观察到骨髓异位移植后的成骨现象。近些年来，骨髓基质干细胞的存在及其成骨潜能已被越来越多的实验证实。骨髓可分为造血及基质两大系统，其成骨能力来源于基质系统的基质干细胞。它具有多向分化潜能，可向成骨细胞、成纤维细胞、网织细胞和脂肪细胞等方向分化〔2，4〕。其体外成骨转化很大程度上依赖于培养条件，在骨形态发生蛋白、β-转化生长因子、地塞米松等因素诱导下，可明显提高其成骨转化率〔5，6〕。
本实验中，我们采用骨髓悬液培养法，只将骨髓与培养液按1∶10稀释不应用Ficoll梯度离心，简化了操作步骤，骨髓中的造血细胞经2～3次换液后基本清除，骨髓基质细胞得到良好的生长。贴壁细胞11～14天，便可连接成片。条件培养中加入10-8mmol.L-1地塞米松，以促进骨髓基质细胞向成骨方向转化，其转化率明显高于非条件组。贴壁细胞形态多为梭形或多角形，胞浆内存在均匀一致的分泌颗粒，细胞间不存在接触抑制，可形成层状结构，这些均符合成骨细胞的形态特征及生物学特性。AKP染色阳性是成骨细胞的重要特征，常用于骨细胞的鉴定。阳性细胞可见灰黑以至深黑色颗粒或片块状沉淀，阴性细胞经HE复染后为均一的红色。AKP的活力可反映成骨细胞的成骨活性，与其它反映成骨活性的骨钙素、骨连接蛋白等有良好的相关性。该实验中，传代细胞经条件培养后，85%以上的细胞AKP染色阳性，有些融合成片块状，呈强阳性；AKP定量检测分泌高峰出现于7～14天，显示了较强的成骨活性。体外培养的骨髓基质细胞，其成骨能力是确定的。
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鉴于骨髓经皮注射及其复合物移植治疗骨缺损、骨不连的成功报道，骨髓基质细胞体外培养移植或与其他载体复合移植治疗骨缺损、骨不连也是可行的。它不仅具有骨髓的取材方便、对供体损伤小、自体骨髓移植不存在排斥反应等优点，并且具有可提供足量移植细胞、人为控制移植时间、反复应用等优点。特别是如果能进一步改良其培养条件，促进骨髓基质细胞的增殖与成骨分化，其应用前景则更为广阔。
作者简介 姜红江，男，1971年生。1995年毕业于泰山医学院，获学士学位。1997年考入苏州医学院骨科，攻读硕士学位。毕业后分配到山东省文登市整骨医院骨伤研究所工作，主要从事骨与关节创伤及组织工程学等方面的研究。
参考文献
1，Connolly JF.Injectable bone marrow preparations to stimulate osteogenic repair.Clin Orthop 1995;313:8
, 百拇医药
2，Maniatopoulous C,Sodek J,Melcher AH.Bone formation invitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rat.Cell Tissue Res 1988;254:314
3，杨景山。医学细胞化学与细胞生物技术。北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990；42
4，Burwell RG.The function of bone marrow in the incorpora tion of a bone graft.Clin Orthop 1985;200:125
5，Locklin RM,Williamson MC,Beresford JN， et al.In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells Clin Orthop 1995;313:27
6，Santos EM,Radin S,Shenker BJ， et al.Si-Ca-P xerogels and bone morphogenetic protein act synergisctically on rat stromal marrow cell differention in vitro.JBiomed Mater Res 1998;41：87
(1999-12-13收稿 2000-03-03修回), 百拇医药