改良K液的动物试验
作者：卢争鸣* 龚向明**
单位：*广州中山医院大学眼科中心研究生在广东省珠海市人民医院眼科，519000；*广州中山医科大学中心
关键词：内皮；角膜；软骨素硫酸盐类；保存；生物学
眼科980316 摘 要 本文用硫酸软骨素取代MK液中的低分子右旋糖酐并加入胰岛素、营养物质及抗氧化剂等配制成一种新的改良K液，以K液作对照，采用随机匹配比较的方法，通过动物试验对保存在二组液中的角膜组织进行内皮细胞活性检测及组织形态学分析。各项实验资料证明：改良K液配方合理，性质稳定，不仅具有比K液配制简单、经济、安全可靠等优点，更主要的是延长了角膜保存时间，提高了角膜保存质量。
分类号 R779.65
Animal experiment of modified liquid for corneal storage/Lu Zhengming…∥Ophthalmol CHN.-1998，7(3)-175～177(Zhong Shan Ophthalmic Center，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510060)
, 百拇医药
In this study，we substituted chondroitin sulfate for the Dextran in MK liquid and added insulin，nutrients(e.g.amino acid)，and antioxidant into the liquid to make a new modified liquid for corneal storage.The randomly matched design was adopted.The vigor of corneal endothelia and their histological morphology preserved in the new modified liquid and the control liquid (MK liquid) were detected.The result of this study showed that：the modified liquid was simple，economic，safe and reliable just like MK liquid，and the most important was that it could not only prolong the duration for corneal storage but also improve the quality.
, 百拇医药
Subject terms Endothelium，corneal；Chondroitin sulfates；Preservation，biological
为了探讨延长保存角膜的方法，本文用硫酸软骨素取代MK液中的低分子右旋糖酐并加入胰岛素、营养物质及抗氧化剂等配制成一种新的改良K液，对保存的兔角膜进行内皮细胞活性检测及组织形态学分析。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 纯种新西兰白兔50只，体重2.0～2.2kg，雌雄并用。将50只白兔随机分为5组，每只兔的两侧眼为一配对，每组10对。处死后立即摘出眼球，用0.125mg/ml升汞和生理盐水冲洗后，置于含庆大霉素(2 000μ/ml)生理盐水中浸泡5分钟，无菌操作下切取带2mm巩膜的角膜片放入平衡盐液内轻轻漂洗，内皮面朝上，一只浸入K液，另一只浸入改良K液，每只角膜用保存液20ml密封，置4℃冰箱内保存。一组于保存10天后取出用于电镜观察，其余四组分别于保存7、10、14及21天取出行细胞化学染色及测定保存液中葡萄糖消耗量。
, 百拇医药
1.2 角膜保存液的配制
1.2.1 硫酸软骨素的处理 选择4800型Amica(亚米康)搅拌式超滤器配用超滤膜(PM10)，在密闭系统低温下N2正压通过滤过膜，压力3kg/cm2，将液体中小于10 000分子量的硫酸软骨素滤掉。
1.2.2 K液配制 用经过处理的硫酸软骨素(2.5%，分子量>10 000，Sigma公司产品)取代MK液中的低分子右旋糖酐即配制成K液。pH调至7.4，渗透压300mOsm，滤过膜抽滤除菌后备用。
1.2.3 改良K液的配制 即在K液的基础上加入胰岛素(5μg/ml)，非必需氨基酸(0.1mmol/L)，丙酮酸钠(1.0mmol/L)，还原型谷胱甘肽(0.16μmol/L)及维生素C(0.28μmol/L)，pH调至7.4，渗透压310mOsm，滤过膜抽滤除菌后备用。
, 百拇医药
1.3 组织细胞化学染色 将保存在K液和改良K液中7、10、14及21天的兔角膜经平衡盐液清洗后，用1%茜素红和0.25%台盼蓝先后各染色一分半钟，显微镜下观察角膜内皮细胞形态，作活性内皮细胞计数并摄像，凡核不被染色者皆被认为正常之有活性细胞。计数时，用一含有相等小方格的显微镜目镜，取内皮细胞不同死亡密度的5个视野求其平均值后以百分数来表示内皮细胞存活的程度。
1.4 电镜观察 将保存在K液和改良K液中10天的兔角膜经平衡盐液清洗后置戊二醛中固定，经乙醇梯度脱水，用Epon-812＃包埋，LKB超薄切片，再经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，用H-600-TEM观察。另一部分标本按上述固定，脱水，乙睛置换，真空干燥，经离子镀膜后，用S520型SEM观察。
1.5 葡萄糖浓度测定 将置4℃低温保存下的K液和改良K液分别于保存1、3、5、7、9、11、14及21天后测定各保存液中葡萄糖浓度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 离体角膜及保存液观察 4℃冰箱低温保存在K液中的兔角膜随着时间延长水肿逐渐加重，至21天整个角膜呈灰白色混浊，液体颜色也由橙红色变为淡黄色，pH值降低(5.1)，渗透压升高(345mOsm)。而保存在改良K液组1～21天者仅显示轻度水肿，液体的颜色，pH值及渗透压无明显改变。
2.2 组织细胞化学染色 保存在K液10天的兔角膜内皮细胞呈片状溶解脱落，细胞多形性改变显著，细胞核普遍着色。改良K液保存10天者内皮完整，细胞形态、大小基本正常，细胞核着色不多见。经活性内皮细胞计数，两组液在同一保存时间活性内皮细胞计数及其百分比有显著性差异(P均<0.01)(附表)。
附表 两组保存液保存兔角膜不同时间的内皮细胞活性率比较(
±s) 组 别
, 百拇医药
7天
10天
14天
21天
K液
57.5±0.35*
16.4±0.44**
6.5±0.27*
1.8±0.53**
改良K液
92.7±0.53
, 百拇医药
88.2±0.36
71.1±0.23
51.5±0.27
*P<0.01，**P<0.001
2.3 电镜观察 扫描电镜显示：保存在K液中10天的兔角膜内皮细胞肿胀，多形性改变显著，细胞大小不一，可见不少破裂细胞(图1)；保存在改良K液组者内皮细胞轻度肿胀，细胞保持六角形镶嵌结构，大小基本一致，很少见到破裂细胞(图2)。透射电镜显示：K液组内皮细胞核膜皱缩，胞浆内空泡变性，细胞器减少(图3)；改良K液组核膜完整，胞浆内无明显空泡变性，细胞器丰富，线粒体嵴清晰，细胞间连接正常(图4)。
2.4 保存液葡萄糖浓度测定 4℃冰箱低温保存21天，改良K液组葡萄糖浓度随着时间延长呈逐渐下降趋势，显示保存在改良K液中的角膜内皮细胞保持良好的代谢活力。而K液组中葡萄糖浓度早期虽呈下降趋势，但一周后至保存期末(21天)下降不明显。说明4℃低温保存在K液中的角膜内皮细胞一周后代谢活力明显减弱甚或消失。
, 百拇医药
3 讨论
角膜保存是角膜移植的物质基础，也是目前一个亟待解决的课题，是角膜移植能否推广的一个关键。1974年，MK液的问世虽然在某种程度上改变了传统湿房保存方法的面貌，但液体中的低分子右旋糖酐很快被角膜内皮细胞吸收，导致内皮细胞破裂，使得MK液的有效保存角膜时间只有2～4天[1]。1984年，Kaufman等将硫酸软骨素取代MK液中的低分子右旋糖酐配制成K液，使有效保存角膜时间延长至7天[2，3]。我们在K液的基础上加入胰岛素，营养物质及丙酮酸等，其目的是增强内皮的液泵活性，维持角膜正常厚度。Maurice[4]通过实践证明，4℃冰箱保存的角膜内皮细胞仍具有一定代谢活力。我们通过对保存液中葡萄糖浓度的测定，证实这种代谢活力就是葡萄糖的氧化利用，以产生能源供内皮液泵之需，从而维持角膜正常厚度。胰岛素能增加细胞对葡萄糖的利用，还可通过己糖转运，蛋白质合成，糖原、氨基酸及铁的运输促进细胞内新陈代谢，从而加强细胞生物泵的功能，减少角膜基质过多的水分积聚，有效地限制了角膜组织肿胀[5]。丙酮酸为糖酵解和三羧酸循环中的一个关键中间产物，增加丙酮酸浓度等于加速葡萄糖的氧化利用，产生更多能源以供4℃环境下角膜内皮液泵功能之需。Mizukawa等报道：即使是在4℃低温下，角膜内皮细胞功能也不可能完全停止，因此，保存液中应当含有一些营养物质。可以肯定，保存液中缺乏营养物质将导致角膜的更多损害[6]。我们在保存液中加入氨基酸也就是增加保存液中营养物质。正常角膜组织内也和全身其它部位一样，在不断进行蛋白质合成和分解过程中，每时每刻都在进行着蛋白质的自我更新。4℃低温保存的角膜也在缓慢地进行着这种自我更新。但合成蛋白质的氨基酸来源不像活体那样通过房水和角膜缘血管网提供，而是来源于保存液中的氨基酸[7]，所以保存液中必需有足够的氨基酸。氨基酸在保存液中的作用：①参与蛋白质合成；②转化为糖，参与三羧酸循环；③转化为非蛋白含氮物质(嘌呤、嘧啶、核酸等)。我们通过透射电镜观察到，保存在改良K液中的角膜内皮细胞核膜完整，细胞器丰富，而保存在K液组者，核膜皱缩，细胞器减少。这与改良K液中加入氨基酸是不无关系的。
, http://www.100md.com
一些研究表明：角膜为极易受氧化损伤的组织之一，尤其是角膜内皮细胞的Na-K-ATP酶对活性氧十分敏感[8]，当角膜组织在低温液体内保存时，细胞代谢仍在进行，氧化产物不断蓄积，导致角膜组织结构损害，同时又由于改变了角膜保存液内的pH值和渗透压，加重组织损伤。抗氧化剂对保存角膜内皮细胞完整和结构的正常具有重大作用[9]。实验结果显示：保存在K液中10天的角膜组织无论是组织细胞染色还是电镜观察均显示内皮细胞多个破裂甚或内皮大片脱落，其保存液pH值及渗透压在保存前后有明显改变。而保存在改良K液中10天的兔角膜内皮细胞完整，细胞间连接正常，内皮与后弹力膜相贴紧密，其保存液pH值及渗透压于保存前后改变不明显。
各项实验资料证明：改良K液保存角膜的时间及质量明显优于K液，其配方合理，配制经济、简单，具有进一步研究和应用价值。
, 百拇医药
图1 扫描电镜(1500×)：保存在K液中10天的兔角膜内皮细胞肿胀，多形性改变显著，细胞大小不一，可见不少破裂细胞
图2 扫描电镜(1500×)：保存在改良K液中10天的兔角膜内皮细胞保持六角形镶嵌结构，大小基本一致，很少见到破裂细胞
目3 透射电镜(3000×)：保存10天，K液组内皮细胞核皱缩，胞浆内空泡变性，细胞器明显减少
图4 透射电镜(3000×)：保存10天兔角膜，改良K液组核膜完整，胞浆内无明显空泡变性，细胞器丰富，线粒体嵴清晰，细胞间连接正常
4 参考文献
1 Van Horn DL，Schultz RO，Debruin J.Endothelial survival in corneal tissue stored in M-K medium.Am J Ophthalmol，1975；80：642
, 百拇医药
2 Kaufman HE，Varnell ED，Kaufman S.Chondroitin sulfate in a new cornea preservation medium.Am J Ophthalmol，1984；98：112
3 Kaufman HE，Varnell ED，Kaufman S，et al.K-Sol corneal preservation.Am J Ophthalmol，1985；100：299
4 Mishima S.Clinical investigations on the corneal endothelium.Am J Ophthalmol，1982；93：1
5 朱志忠.穿透移植角膜材料活性保存的实验研究.中华眼科杂志，1979；15(3)：153
6 Tamaki K，Yamaguchi T，Varnell ED，et al.Histological study of corneas preserved in two new media.Br J Ophthalmol，1987；71：570
, 百拇医药
7 李贺诚.实用角膜移植.广州：广东科技出版社，1985：12
8 彭秀军，惠延年，张廷钺，等.抗氧化液保存角膜的形态学观察.中华眼科杂志，1994；30(1)：57
9 Reddy TS，Varnell ED，Beuerman RW，et al.Endothelial cell damage in human and rabbit corneas stored in K-Sol without antioxidants.Br J Ophthalmol，1989；73：803
(1997-03-10收稿，1997-05-04修回), 百拇医药
单位：*广州中山医院大学眼科中心研究生在广东省珠海市人民医院眼科，519000；*广州中山医科大学中心
关键词：内皮；角膜；软骨素硫酸盐类；保存；生物学
眼科980316 摘 要 本文用硫酸软骨素取代MK液中的低分子右旋糖酐并加入胰岛素、营养物质及抗氧化剂等配制成一种新的改良K液，以K液作对照，采用随机匹配比较的方法，通过动物试验对保存在二组液中的角膜组织进行内皮细胞活性检测及组织形态学分析。各项实验资料证明：改良K液配方合理，性质稳定，不仅具有比K液配制简单、经济、安全可靠等优点，更主要的是延长了角膜保存时间，提高了角膜保存质量。
分类号 R779.65
Animal experiment of modified liquid for corneal storage/Lu Zhengming…∥Ophthalmol CHN.-1998，7(3)-175～177(Zhong Shan Ophthalmic Center，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510060)
, 百拇医药
In this study，we substituted chondroitin sulfate for the Dextran in MK liquid and added insulin，nutrients(e.g.amino acid)，and antioxidant into the liquid to make a new modified liquid for corneal storage.The randomly matched design was adopted.The vigor of corneal endothelia and their histological morphology preserved in the new modified liquid and the control liquid (MK liquid) were detected.The result of this study showed that：the modified liquid was simple，economic，safe and reliable just like MK liquid，and the most important was that it could not only prolong the duration for corneal storage but also improve the quality.
, 百拇医药
Subject terms Endothelium，corneal；Chondroitin sulfates；Preservation，biological
为了探讨延长保存角膜的方法，本文用硫酸软骨素取代MK液中的低分子右旋糖酐并加入胰岛素、营养物质及抗氧化剂等配制成一种新的改良K液，对保存的兔角膜进行内皮细胞活性检测及组织形态学分析。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 纯种新西兰白兔50只，体重2.0～2.2kg，雌雄并用。将50只白兔随机分为5组，每只兔的两侧眼为一配对，每组10对。处死后立即摘出眼球，用0.125mg/ml升汞和生理盐水冲洗后，置于含庆大霉素(2 000μ/ml)生理盐水中浸泡5分钟，无菌操作下切取带2mm巩膜的角膜片放入平衡盐液内轻轻漂洗，内皮面朝上，一只浸入K液，另一只浸入改良K液，每只角膜用保存液20ml密封，置4℃冰箱内保存。一组于保存10天后取出用于电镜观察，其余四组分别于保存7、10、14及21天取出行细胞化学染色及测定保存液中葡萄糖消耗量。
, 百拇医药
1.2 角膜保存液的配制
1.2.1 硫酸软骨素的处理 选择4800型Amica(亚米康)搅拌式超滤器配用超滤膜(PM10)，在密闭系统低温下N2正压通过滤过膜，压力3kg/cm2，将液体中小于10 000分子量的硫酸软骨素滤掉。
1.2.2 K液配制 用经过处理的硫酸软骨素(2.5%，分子量>10 000，Sigma公司产品)取代MK液中的低分子右旋糖酐即配制成K液。pH调至7.4，渗透压300mOsm，滤过膜抽滤除菌后备用。
1.2.3 改良K液的配制 即在K液的基础上加入胰岛素(5μg/ml)，非必需氨基酸(0.1mmol/L)，丙酮酸钠(1.0mmol/L)，还原型谷胱甘肽(0.16μmol/L)及维生素C(0.28μmol/L)，pH调至7.4，渗透压310mOsm，滤过膜抽滤除菌后备用。
, 百拇医药
1.3 组织细胞化学染色 将保存在K液和改良K液中7、10、14及21天的兔角膜经平衡盐液清洗后，用1%茜素红和0.25%台盼蓝先后各染色一分半钟，显微镜下观察角膜内皮细胞形态，作活性内皮细胞计数并摄像，凡核不被染色者皆被认为正常之有活性细胞。计数时，用一含有相等小方格的显微镜目镜，取内皮细胞不同死亡密度的5个视野求其平均值后以百分数来表示内皮细胞存活的程度。
1.4 电镜观察 将保存在K液和改良K液中10天的兔角膜经平衡盐液清洗后置戊二醛中固定，经乙醇梯度脱水，用Epon-812＃包埋，LKB超薄切片，再经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，用H-600-TEM观察。另一部分标本按上述固定，脱水，乙睛置换，真空干燥，经离子镀膜后，用S520型SEM观察。
1.5 葡萄糖浓度测定 将置4℃低温保存下的K液和改良K液分别于保存1、3、5、7、9、11、14及21天后测定各保存液中葡萄糖浓度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 离体角膜及保存液观察 4℃冰箱低温保存在K液中的兔角膜随着时间延长水肿逐渐加重，至21天整个角膜呈灰白色混浊，液体颜色也由橙红色变为淡黄色，pH值降低(5.1)，渗透压升高(345mOsm)。而保存在改良K液组1～21天者仅显示轻度水肿，液体的颜色，pH值及渗透压无明显改变。
2.2 组织细胞化学染色 保存在K液10天的兔角膜内皮细胞呈片状溶解脱落，细胞多形性改变显著，细胞核普遍着色。改良K液保存10天者内皮完整，细胞形态、大小基本正常，细胞核着色不多见。经活性内皮细胞计数，两组液在同一保存时间活性内皮细胞计数及其百分比有显著性差异(P均<0.01)(附表)。
附表 两组保存液保存兔角膜不同时间的内皮细胞活性率比较(
±s) 组 别, 百拇医药
7天
10天
14天
21天
K液
57.5±0.35*
16.4±0.44**
6.5±0.27*
1.8±0.53**
改良K液
92.7±0.53
, 百拇医药
88.2±0.36
71.1±0.23
51.5±0.27
*P<0.01，**P<0.001
2.3 电镜观察 扫描电镜显示：保存在K液中10天的兔角膜内皮细胞肿胀，多形性改变显著，细胞大小不一，可见不少破裂细胞(图1)；保存在改良K液组者内皮细胞轻度肿胀，细胞保持六角形镶嵌结构，大小基本一致，很少见到破裂细胞(图2)。透射电镜显示：K液组内皮细胞核膜皱缩，胞浆内空泡变性，细胞器减少(图3)；改良K液组核膜完整，胞浆内无明显空泡变性，细胞器丰富，线粒体嵴清晰，细胞间连接正常(图4)。
2.4 保存液葡萄糖浓度测定 4℃冰箱低温保存21天，改良K液组葡萄糖浓度随着时间延长呈逐渐下降趋势，显示保存在改良K液中的角膜内皮细胞保持良好的代谢活力。而K液组中葡萄糖浓度早期虽呈下降趋势，但一周后至保存期末(21天)下降不明显。说明4℃低温保存在K液中的角膜内皮细胞一周后代谢活力明显减弱甚或消失。
, 百拇医药
3 讨论
角膜保存是角膜移植的物质基础，也是目前一个亟待解决的课题，是角膜移植能否推广的一个关键。1974年，MK液的问世虽然在某种程度上改变了传统湿房保存方法的面貌，但液体中的低分子右旋糖酐很快被角膜内皮细胞吸收，导致内皮细胞破裂，使得MK液的有效保存角膜时间只有2～4天[1]。1984年，Kaufman等将硫酸软骨素取代MK液中的低分子右旋糖酐配制成K液，使有效保存角膜时间延长至7天[2，3]。我们在K液的基础上加入胰岛素，营养物质及丙酮酸等，其目的是增强内皮的液泵活性，维持角膜正常厚度。Maurice[4]通过实践证明，4℃冰箱保存的角膜内皮细胞仍具有一定代谢活力。我们通过对保存液中葡萄糖浓度的测定，证实这种代谢活力就是葡萄糖的氧化利用，以产生能源供内皮液泵之需，从而维持角膜正常厚度。胰岛素能增加细胞对葡萄糖的利用，还可通过己糖转运，蛋白质合成，糖原、氨基酸及铁的运输促进细胞内新陈代谢，从而加强细胞生物泵的功能，减少角膜基质过多的水分积聚，有效地限制了角膜组织肿胀[5]。丙酮酸为糖酵解和三羧酸循环中的一个关键中间产物，增加丙酮酸浓度等于加速葡萄糖的氧化利用，产生更多能源以供4℃环境下角膜内皮液泵功能之需。Mizukawa等报道：即使是在4℃低温下，角膜内皮细胞功能也不可能完全停止，因此，保存液中应当含有一些营养物质。可以肯定，保存液中缺乏营养物质将导致角膜的更多损害[6]。我们在保存液中加入氨基酸也就是增加保存液中营养物质。正常角膜组织内也和全身其它部位一样，在不断进行蛋白质合成和分解过程中，每时每刻都在进行着蛋白质的自我更新。4℃低温保存的角膜也在缓慢地进行着这种自我更新。但合成蛋白质的氨基酸来源不像活体那样通过房水和角膜缘血管网提供，而是来源于保存液中的氨基酸[7]，所以保存液中必需有足够的氨基酸。氨基酸在保存液中的作用：①参与蛋白质合成；②转化为糖，参与三羧酸循环；③转化为非蛋白含氮物质(嘌呤、嘧啶、核酸等)。我们通过透射电镜观察到，保存在改良K液中的角膜内皮细胞核膜完整，细胞器丰富，而保存在K液组者，核膜皱缩，细胞器减少。这与改良K液中加入氨基酸是不无关系的。
, http://www.100md.com
一些研究表明：角膜为极易受氧化损伤的组织之一，尤其是角膜内皮细胞的Na-K-ATP酶对活性氧十分敏感[8]，当角膜组织在低温液体内保存时，细胞代谢仍在进行，氧化产物不断蓄积，导致角膜组织结构损害，同时又由于改变了角膜保存液内的pH值和渗透压，加重组织损伤。抗氧化剂对保存角膜内皮细胞完整和结构的正常具有重大作用[9]。实验结果显示：保存在K液中10天的角膜组织无论是组织细胞染色还是电镜观察均显示内皮细胞多个破裂甚或内皮大片脱落，其保存液pH值及渗透压在保存前后有明显改变。而保存在改良K液中10天的兔角膜内皮细胞完整，细胞间连接正常，内皮与后弹力膜相贴紧密，其保存液pH值及渗透压于保存前后改变不明显。
各项实验资料证明：改良K液保存角膜的时间及质量明显优于K液，其配方合理，配制经济、简单，具有进一步研究和应用价值。
, 百拇医药
图1 扫描电镜(1500×)：保存在K液中10天的兔角膜内皮细胞肿胀，多形性改变显著，细胞大小不一，可见不少破裂细胞
图2 扫描电镜(1500×)：保存在改良K液中10天的兔角膜内皮细胞保持六角形镶嵌结构，大小基本一致，很少见到破裂细胞
目3 透射电镜(3000×)：保存10天，K液组内皮细胞核皱缩，胞浆内空泡变性，细胞器明显减少
图4 透射电镜(3000×)：保存10天兔角膜，改良K液组核膜完整，胞浆内无明显空泡变性，细胞器丰富，线粒体嵴清晰，细胞间连接正常
4 参考文献
1 Van Horn DL，Schultz RO，Debruin J.Endothelial survival in corneal tissue stored in M-K medium.Am J Ophthalmol，1975；80：642
, 百拇医药
2 Kaufman HE，Varnell ED，Kaufman S.Chondroitin sulfate in a new cornea preservation medium.Am J Ophthalmol，1984；98：112
3 Kaufman HE，Varnell ED，Kaufman S，et al.K-Sol corneal preservation.Am J Ophthalmol，1985；100：299
4 Mishima S.Clinical investigations on the corneal endothelium.Am J Ophthalmol，1982；93：1
5 朱志忠.穿透移植角膜材料活性保存的实验研究.中华眼科杂志，1979；15(3)：153
6 Tamaki K，Yamaguchi T，Varnell ED，et al.Histological study of corneas preserved in two new media.Br J Ophthalmol，1987；71：570
, 百拇医药
7 李贺诚.实用角膜移植.广州：广东科技出版社，1985：12
8 彭秀军，惠延年，张廷钺，等.抗氧化液保存角膜的形态学观察.中华眼科杂志，1994；30(1)：57
9 Reddy TS，Varnell ED，Beuerman RW，et al.Endothelial cell damage in human and rabbit corneas stored in K-Sol without antioxidants.Br J Ophthalmol，1989；73：803
(1997-03-10收稿，1997-05-04修回), 百拇医药