16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA
作者：尚世强 洪文澜 俞惠民 孙眉月 滕恣群 金益人
单位：310003 杭州，浙江大学附属儿童医院
关键词：核糖核酸；细菌；聚合酶链反应；杂交
中华传染病杂志990109 【摘要】 目的 探讨聚合酶链反应(PCR)加反相杂交技术在细菌DNA检测中的应用。方法 以16SrRNA基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用PCR法加反相杂交检测标准菌株及临床标本细菌DNA。结果 对20株不同标准菌株进行PCR扩增，均出现371bp长度的DNA片段，敏感性试验可检测出10-12g的细菌DNA，与人基因组及病毒无交叉反应；22份血培养阳性标本及4份脑脊液培养阳性标本均扩增出371bp长度DNA条带，反相杂交区分革兰阳性/阴性细菌与培养结果相符。结论 16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA，具有敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据。
, 百拇医药
Detection of bacterial DNA with polymerase chain reaction and reverse hybridization of 16SrRNA gene
SHANG Shiqiang, HONG Wenlan, YU Huimin, et al.
Children's Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To develop a molecular biologic technique for detection of bacterial DNA in all bacteria with polymerase chain reaction (PCR) and reverse hybridization.Methods A pair of primers were designed according to the gene encoding 16SrRNA. DNA fragments of different species and digested from clinical samples were detected with PCR, reverse hybridization of a universal bacterial probe, and a gram-positive probe as well as a gram-negative probe.Results 371bp DNA fragments were amplified from 20 different species. The sensitivity could be improved to 10-12g. No signal was observed when human DNA and viruses were used as templates. 22 blood samples and 4 cerebrospinal fluid samples, being positive with culture, were positive by using PCR. The gram-negative and gram-positive probes hybridized to clinic samples and different species, as predicted by Gram stain characteristics.Conclusions The method not only is sensitive, rapid and specific, but also provides an etiological basis for diagnosis of sepsis.
, 百拇医药
【Key words】 rRNA Bacteria Polymerase chain reaction Hybridization
细菌培养、组织学、免疫学方法虽广泛应用于对病原菌的检测，但都存在一定的不足[1，2]。为探索快速可靠的诊断方法，我们在细菌保守的16SrRNA基因内，自行设计并建立了聚合酶链反应(PCR)加反相杂交检测所有细菌DNA的方法，取得了较好的结果，现报告如下。
材料与方法
一、材料
(一)对照菌株来源 标准菌株选择1990年1月～1996年12月浙江医科大学儿童医院内引起新生儿败血症的常见的革兰阳性与阴性细菌菌株20种(见表1)。菌株由浙江省临床检验中心提供，人基因组DNA由中国预防医学科学院提供，巨细胞病毒由本院感染实验室提供。
, 百拇医药
表1 20种标准菌株 种类
G+菌
G-菌
标准
1.金黄色葡萄球菌
1.大肠杆菌
8.沙雷氏菌
菌株
2.表皮葡萄球菌
2.产气杆菌
9.痢疾杆菌
3.D群链球菌
, 百拇医药
3.变形杆菌
10.沙门氏菌
4.枯草杆菌
4.克雷伯氏杆菌
11.伤寒杆菌
5.微球菌
5.枸橼酸杆菌
12.不动杆菌
6.肺炎链球菌
6.绿脓杆菌
13.气单胞菌
7.A群链球菌
, 百拇医药
7.嗜血流感杆菌
(二)标本来源 于1996年3月～1997年3月间我院新生儿病房血培养阳性确诊为败血症的血标本22份，正常儿童血标本30份作为正常血对照，培养阳性的脑脊液标本4份。
(三)试剂与仪器 Taq酶，4dNTP,10TdT等购于美国Promega公司。链亲和素-碱性磷酸酶显色试剂盒，购于北京医科大学人民医院。DNAmarkers GEM-7zf(+)DNA/ HaeⅢ购于华美公司，引物及探针由上海细胞生物研究所381型仪合成并纯化，PCR扩增仪为PERKIN-ELMER公司的PE480型仪。电泳槽及电泳仪为美国BIORAD公司产品。
二、方法
(一)标本DNA抽提 菌株DNA制备用经典酚-氯仿抽提，临床血白细胞DNA抽提，采用本实验室建立的方法[2]。所有试剂均以0.22μm孔径滤菌器过滤分装。抽血专用工作台每日消毒2次，每次1小时。抽血过程严格无菌操作。
, 百拇医药
(二)16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针的设计与合成 引物选自细菌16SrRNA基因保守区内，经计算机软件辅助设计，上海细胞生物研究所合成。同时设计了3条寡核苷酸探针，分别是对所有细菌共用的通用探针，对革兰阳性菌特异的探针及对革兰阴性菌特异的探针。引物序列及有关参数见表2。为使引物5′端带有生物素基因，以便PCR扩增后进行反相杂交，在DNA合成仪合成引物到最后一个核苷酸时，改用Tritylon程序，加入Link-NH2，反应后引物的5′加上一个带NH2的基因。待NH4OH去掉保护基后，以琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)在其NH2上生物素化。表2 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针序列及有关参数 序列5′-3′
所在基因位置
引物1
5′-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3′
, 百拇医药
1521～1539
引物2
5′-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3′
1187～1169
通用探针
5′-CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC-3′
1368～1394
G+探针
5′-GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTC-3′
1189～1216
, 百拇医药
G-探针
5′-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3′
1189～1216
(三)16SrRNA基因PCR实验程序 方法见文献[3]。
(四)反相杂交 1.寡核苷酸加尾：100μl反应体系中，加入寡核苷酸(通用探针、G+探针、G-探针三种之一)200pmol,10×TdT反应缓冲液(1mol/ L二甲胂酸钾，250mmol/ L Tris.Cl pH7.6,10mmol/ L CoCl2,2mmol/ L DTT)10μl,dTTP100nmol/ L,TdT80U，补水至100μl。混匀后，稍加离心，置37°C水浴60分钟，加入100μl 10mmol/ L EDTA终止反应。2.点膜：取加尾后的通用探针、G+探针、G-探针各6pmol点于尼龙膜(zeta-probe)上，每种探针各点2点，将膜置于254nmU V灯下照射固定10分钟。3.杂交：将点有加尾的寡核苷酸探针的尼龙膜及变性的生物素标记的PCR产物一起放入塑料袋中，混匀、闭膜。于55°C温育30分钟后洗膜。4.显色：按链亲和素—碱性磷酸酶显色试剂盒(北京医科大学人民医院生产)，使用按说明书进行操作。待DNA显蓝色，又未出现本底时，终止液洗膜终止反应。显色时间约40分钟，G+探针处显色判为G+细菌，G-探针处显色判为G-细菌。结果
, 百拇医药
一、16SrRNA基因PCR的敏感性与特异性
用PCR方法扩增20种标准菌株，经电泳在相当于371bp处均可见一条DNA带。用人基因组DNA、巨细胞病毒扩增，未见阳性条带。说明与人基因组及病毒无交叉反应，对细菌具有较高的特异性。取大肠杆菌所抽提的DNA作模板，1∶10定量稀释，PCR最小检出量为1pg(10-12g)。对20种标准菌株PCR扩增后产物进行反相杂交，结果，20种标准菌株中，7株G+菌中，G+探针、通用探针阳性，G-探针阴性；13株G-菌中，G-菌探针、通用探针均阳性，G+菌探针阴性。反相杂交区分G+/ G-菌结果与已知标准菌株全部符合。
二、临床标本的检测
22份血标本、4份脑脊液标本细菌学、PCR及反相杂交检测，结果见表3。30份正常儿童血标本经16SrRNA基因PCR扩增均为阴性。
, 百拇医药
表3 22份血标本、4份脑脊液标本检测阳性数 细菌培养
PCR
通用探针
G+探针
G-探针
血标本
表皮葡萄球菌
5
5
5
0
水生棒状杆菌
, http://www.100md.com
2
2
2
0
草绿色链球菌
1
1
1
0
产气肠杆菌
1
1
0
1
, http://www.100md.com
嗜血流感杆菌
1
1
0
1
克雷伯氏杆菌
3
3
0
3
大肠杆菌
1
1
0
, 百拇医药
1
聚团肠杆菌
1
1
0
1
变形杆菌
1
1
0
1
金黄色葡萄球菌
5
5
, http://www.100md.com
5
0
肠球菌L型
1
1
1
0
脑脊液标本
表皮葡萄球菌
2
2
2
0
腐生葡萄球菌
, 百拇医药
1
1
1
0
产气肠杆菌
1
1
0
1
讨论
近年来，有作者根据细菌rRNA及基因结构特点，利用rRNA基因序列来检测不同的病原体，但均局限于对某一特定病原微生物的测定。16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因中。除细菌外，也存在于衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放射菌等原核生物中，但不存在于非原核生物如病毒、真菌等的体内。它的内部结构由保守区及可变区二部分组成，保守区为所有细菌所共同拥有，细菌间无明显差异；可变区在长期的进化过程中，因不时突变在不同的细菌间存在较大差异。两者互相交错排列。因此，理论上可以设计不同的引物进行对所有细菌或特定细菌的PCR检测。Wilson等[4]设计了2对细菌共同引物，分别对每种保留菌株进行PCR，获得了相同扩增产物789及721bp。McCabe等[5]报道用一对细菌共同引物p806R，p8FPL对12种不同的G+和G-菌进行PCR扩增，均获得了861bp长度的DNA片段，而对照组人基因组DNA未被扩增。我们根据16SrRNA基因用SEQNCE、 PRIMERS和PCRDESN软件分析，在保守区内设计了1对共同引物，经PCR扩增20种不同细菌标准菌株，均获得371bp长度DNA片段，与病毒及人基因组DNA无交叉反应，最小检出量达10-12g，相当于3个致病菌[6]。表明该方法具有较高的特异性与敏感性。同时，进一步在16SrRNA基因可变区内设计了分别对G+或G-特异的寡核苷酸探针，经反相杂交区分细菌系G+抑或G-菌，可以指导临床用药。
, 百拇医药
目前，败血症的诊断仍然靠血培养。由于血培养受各种因素影响，阳性率不高，而且培养方法本身费时费力，达不到快速诊断的目的。为避免败血症尤其是新生儿败血症的漏诊而延误治疗导致严重后果，相继有许多败血症的诊断方法问世，如用免疫反应检测病原菌抗原的特异性诊断方法，但仅用于检测特定的单一菌株，而其他非特异的诊断方法，敏感性及特异性均低。我们用简易的血标本DNA制备法，快速进行标本处理，22份血培养阳性标本经16SrRNA基因PCR加反相杂交检测，结果均为阳性，且G+或G-结果与培养完全相符，30份正常血标本均阴性。在临床实际应用中也证实了本方法具有较高的准确性。
新生儿败血症中，约1/ 3合并化脓性脑膜炎(化脑)，新生儿化脑缺乏典型的临床表现，需依靠脑脊液培养及常规检查来确诊。新生儿脑脊液中，细胞数、糖、蛋白质变化范围大，而脑脊液培养需3天报告，阳性率又低。正常脑脊液为无菌液体，和血标本一样，可用16SrRNA基因PCR进行细菌检测。本组4份培养阳性的脑脊液标本，经检测均为阳性，其G+或G-探针区分细菌与培养结果相符。由于我们在实验中改一般的点杂交为反相杂交，一次杂交可完成对通用、G+及G-菌三种探针的探测，整个实验1天即可完成，缩短了诊断的时间，能够满足临床快速诊断的需要。
, http://www.100md.com
16SrRNA基因PCR加反相杂交，可直接探测血中细菌DNA，为提高诊断的可靠性，应注意标本处理过程中，必须减少蛋白质等抑制PCR反应的物质存在，并应严格的无菌操作，试剂须过滤除菌。
本研究为浙江省自然科学基金资助项目(基金编号396457)
参考文献
1 Lieu TA, Schwartz JS, Jaffe DM, et al. Strategies for diagnosis and treatment of children at risk for occult bacteremia: clinical effectiveness and cost effectiveness. J Pediatr, 1991, 118:21-29.
2 Downs SM, McNutt RA, Margolis PA. Management of in foats at risk for occult bacteremia: a decision analysis. J Pediatr, 1991, 118:11-20.
, 百拇医药
3 尚世强，洪文澜，石一复，等.套式聚合酶链反应加限制酶分析检测母婴巨细胞病毒感染.中华儿科杂志，1997，35：593-596.
4 Wilson KH, Bitchington RB, Green RC. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with PCR. J Clin Microbiol, 1990, 28:1942-1946.
5 McCabe KM, Khan G, Yao-Hua Z, et al. Amplification of bacterial DNA using highly conserved sequences: automated analysis and potential for moleculovr triage of sepsis. Pediatrics, 1995,95: 165-169.
6 Shirai H, Nishibuchi M, Ramamurthy T, et al. Polymerase chain reaction for detection of the cholera enterotoxin operon of vibrio cholerae. J Clin Microbiol, 1991,29:2517-2521.
(收稿：1997-12-19 修回：1998-07-08), http://www.100md.com
单位：310003 杭州，浙江大学附属儿童医院
关键词：核糖核酸；细菌；聚合酶链反应；杂交
中华传染病杂志990109 【摘要】 目的 探讨聚合酶链反应(PCR)加反相杂交技术在细菌DNA检测中的应用。方法 以16SrRNA基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用PCR法加反相杂交检测标准菌株及临床标本细菌DNA。结果 对20株不同标准菌株进行PCR扩增，均出现371bp长度的DNA片段，敏感性试验可检测出10-12g的细菌DNA，与人基因组及病毒无交叉反应；22份血培养阳性标本及4份脑脊液培养阳性标本均扩增出371bp长度DNA条带，反相杂交区分革兰阳性/阴性细菌与培养结果相符。结论 16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA，具有敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据。
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Detection of bacterial DNA with polymerase chain reaction and reverse hybridization of 16SrRNA gene
SHANG Shiqiang, HONG Wenlan, YU Huimin, et al.
Children's Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To develop a molecular biologic technique for detection of bacterial DNA in all bacteria with polymerase chain reaction (PCR) and reverse hybridization.Methods A pair of primers were designed according to the gene encoding 16SrRNA. DNA fragments of different species and digested from clinical samples were detected with PCR, reverse hybridization of a universal bacterial probe, and a gram-positive probe as well as a gram-negative probe.Results 371bp DNA fragments were amplified from 20 different species. The sensitivity could be improved to 10-12g. No signal was observed when human DNA and viruses were used as templates. 22 blood samples and 4 cerebrospinal fluid samples, being positive with culture, were positive by using PCR. The gram-negative and gram-positive probes hybridized to clinic samples and different species, as predicted by Gram stain characteristics.Conclusions The method not only is sensitive, rapid and specific, but also provides an etiological basis for diagnosis of sepsis.
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【Key words】 rRNA Bacteria Polymerase chain reaction Hybridization
细菌培养、组织学、免疫学方法虽广泛应用于对病原菌的检测，但都存在一定的不足[1，2]。为探索快速可靠的诊断方法，我们在细菌保守的16SrRNA基因内，自行设计并建立了聚合酶链反应(PCR)加反相杂交检测所有细菌DNA的方法，取得了较好的结果，现报告如下。
材料与方法
一、材料
(一)对照菌株来源 标准菌株选择1990年1月～1996年12月浙江医科大学儿童医院内引起新生儿败血症的常见的革兰阳性与阴性细菌菌株20种(见表1)。菌株由浙江省临床检验中心提供，人基因组DNA由中国预防医学科学院提供，巨细胞病毒由本院感染实验室提供。
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表1 20种标准菌株 种类
G+菌
G-菌
标准
1.金黄色葡萄球菌
1.大肠杆菌
8.沙雷氏菌
菌株
2.表皮葡萄球菌
2.产气杆菌
9.痢疾杆菌
3.D群链球菌
, 百拇医药
3.变形杆菌
10.沙门氏菌
4.枯草杆菌
4.克雷伯氏杆菌
11.伤寒杆菌
5.微球菌
5.枸橼酸杆菌
12.不动杆菌
6.肺炎链球菌
6.绿脓杆菌
13.气单胞菌
7.A群链球菌
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7.嗜血流感杆菌
(二)标本来源 于1996年3月～1997年3月间我院新生儿病房血培养阳性确诊为败血症的血标本22份，正常儿童血标本30份作为正常血对照，培养阳性的脑脊液标本4份。
(三)试剂与仪器 Taq酶，4dNTP,10TdT等购于美国Promega公司。链亲和素-碱性磷酸酶显色试剂盒，购于北京医科大学人民医院。DNAmarkers GEM-7zf(+)DNA/ HaeⅢ购于华美公司，引物及探针由上海细胞生物研究所381型仪合成并纯化，PCR扩增仪为PERKIN-ELMER公司的PE480型仪。电泳槽及电泳仪为美国BIORAD公司产品。
二、方法
(一)标本DNA抽提 菌株DNA制备用经典酚-氯仿抽提，临床血白细胞DNA抽提，采用本实验室建立的方法[2]。所有试剂均以0.22μm孔径滤菌器过滤分装。抽血专用工作台每日消毒2次，每次1小时。抽血过程严格无菌操作。
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(二)16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针的设计与合成 引物选自细菌16SrRNA基因保守区内，经计算机软件辅助设计，上海细胞生物研究所合成。同时设计了3条寡核苷酸探针，分别是对所有细菌共用的通用探针，对革兰阳性菌特异的探针及对革兰阴性菌特异的探针。引物序列及有关参数见表2。为使引物5′端带有生物素基因，以便PCR扩增后进行反相杂交，在DNA合成仪合成引物到最后一个核苷酸时，改用Tritylon程序，加入Link-NH2，反应后引物的5′加上一个带NH2的基因。待NH4OH去掉保护基后，以琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)在其NH2上生物素化。表2 16SrRNA基因引物及寡核苷酸探针序列及有关参数 序列5′-3′
所在基因位置
引物1
5′-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3′
, 百拇医药
1521～1539
引物2
5′-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3′
1187～1169
通用探针
5′-CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC-3′
1368～1394
G+探针
5′-GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTC-3′
1189～1216
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G-探针
5′-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3′
1189～1216
(三)16SrRNA基因PCR实验程序 方法见文献[3]。
(四)反相杂交 1.寡核苷酸加尾：100μl反应体系中，加入寡核苷酸(通用探针、G+探针、G-探针三种之一)200pmol,10×TdT反应缓冲液(1mol/ L二甲胂酸钾，250mmol/ L Tris.Cl pH7.6,10mmol/ L CoCl2,2mmol/ L DTT)10μl,dTTP100nmol/ L,TdT80U，补水至100μl。混匀后，稍加离心，置37°C水浴60分钟，加入100μl 10mmol/ L EDTA终止反应。2.点膜：取加尾后的通用探针、G+探针、G-探针各6pmol点于尼龙膜(zeta-probe)上，每种探针各点2点，将膜置于254nmU V灯下照射固定10分钟。3.杂交：将点有加尾的寡核苷酸探针的尼龙膜及变性的生物素标记的PCR产物一起放入塑料袋中，混匀、闭膜。于55°C温育30分钟后洗膜。4.显色：按链亲和素—碱性磷酸酶显色试剂盒(北京医科大学人民医院生产)，使用按说明书进行操作。待DNA显蓝色，又未出现本底时，终止液洗膜终止反应。显色时间约40分钟，G+探针处显色判为G+细菌，G-探针处显色判为G-细菌。结果
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一、16SrRNA基因PCR的敏感性与特异性
用PCR方法扩增20种标准菌株，经电泳在相当于371bp处均可见一条DNA带。用人基因组DNA、巨细胞病毒扩增，未见阳性条带。说明与人基因组及病毒无交叉反应，对细菌具有较高的特异性。取大肠杆菌所抽提的DNA作模板，1∶10定量稀释，PCR最小检出量为1pg(10-12g)。对20种标准菌株PCR扩增后产物进行反相杂交，结果，20种标准菌株中，7株G+菌中，G+探针、通用探针阳性，G-探针阴性；13株G-菌中，G-菌探针、通用探针均阳性，G+菌探针阴性。反相杂交区分G+/ G-菌结果与已知标准菌株全部符合。
二、临床标本的检测
22份血标本、4份脑脊液标本细菌学、PCR及反相杂交检测，结果见表3。30份正常儿童血标本经16SrRNA基因PCR扩增均为阴性。
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表3 22份血标本、4份脑脊液标本检测阳性数 细菌培养
PCR
通用探针
G+探针
G-探针
血标本
表皮葡萄球菌
5
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0
水生棒状杆菌
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2
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0
草绿色链球菌
1
1
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产气肠杆菌
1
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嗜血流感杆菌
1
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克雷伯氏杆菌
3
3
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大肠杆菌
1
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聚团肠杆菌
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变形杆菌
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金黄色葡萄球菌
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肠球菌L型
1
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脑脊液标本
表皮葡萄球菌
2
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0
腐生葡萄球菌
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1
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产气肠杆菌
1
1
0
1
讨论
近年来，有作者根据细菌rRNA及基因结构特点，利用rRNA基因序列来检测不同的病原体，但均局限于对某一特定病原微生物的测定。16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因中。除细菌外，也存在于衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放射菌等原核生物中，但不存在于非原核生物如病毒、真菌等的体内。它的内部结构由保守区及可变区二部分组成，保守区为所有细菌所共同拥有，细菌间无明显差异；可变区在长期的进化过程中，因不时突变在不同的细菌间存在较大差异。两者互相交错排列。因此，理论上可以设计不同的引物进行对所有细菌或特定细菌的PCR检测。Wilson等[4]设计了2对细菌共同引物，分别对每种保留菌株进行PCR，获得了相同扩增产物789及721bp。McCabe等[5]报道用一对细菌共同引物p806R，p8FPL对12种不同的G+和G-菌进行PCR扩增，均获得了861bp长度的DNA片段，而对照组人基因组DNA未被扩增。我们根据16SrRNA基因用SEQNCE、 PRIMERS和PCRDESN软件分析，在保守区内设计了1对共同引物，经PCR扩增20种不同细菌标准菌株，均获得371bp长度DNA片段，与病毒及人基因组DNA无交叉反应，最小检出量达10-12g，相当于3个致病菌[6]。表明该方法具有较高的特异性与敏感性。同时，进一步在16SrRNA基因可变区内设计了分别对G+或G-特异的寡核苷酸探针，经反相杂交区分细菌系G+抑或G-菌，可以指导临床用药。
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目前，败血症的诊断仍然靠血培养。由于血培养受各种因素影响，阳性率不高，而且培养方法本身费时费力，达不到快速诊断的目的。为避免败血症尤其是新生儿败血症的漏诊而延误治疗导致严重后果，相继有许多败血症的诊断方法问世，如用免疫反应检测病原菌抗原的特异性诊断方法，但仅用于检测特定的单一菌株，而其他非特异的诊断方法，敏感性及特异性均低。我们用简易的血标本DNA制备法，快速进行标本处理，22份血培养阳性标本经16SrRNA基因PCR加反相杂交检测，结果均为阳性，且G+或G-结果与培养完全相符，30份正常血标本均阴性。在临床实际应用中也证实了本方法具有较高的准确性。
新生儿败血症中，约1/ 3合并化脓性脑膜炎(化脑)，新生儿化脑缺乏典型的临床表现，需依靠脑脊液培养及常规检查来确诊。新生儿脑脊液中，细胞数、糖、蛋白质变化范围大，而脑脊液培养需3天报告，阳性率又低。正常脑脊液为无菌液体，和血标本一样，可用16SrRNA基因PCR进行细菌检测。本组4份培养阳性的脑脊液标本，经检测均为阳性，其G+或G-探针区分细菌与培养结果相符。由于我们在实验中改一般的点杂交为反相杂交，一次杂交可完成对通用、G+及G-菌三种探针的探测，整个实验1天即可完成，缩短了诊断的时间，能够满足临床快速诊断的需要。
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16SrRNA基因PCR加反相杂交，可直接探测血中细菌DNA，为提高诊断的可靠性，应注意标本处理过程中，必须减少蛋白质等抑制PCR反应的物质存在，并应严格的无菌操作，试剂须过滤除菌。
本研究为浙江省自然科学基金资助项目(基金编号396457)
参考文献
1 Lieu TA, Schwartz JS, Jaffe DM, et al. Strategies for diagnosis and treatment of children at risk for occult bacteremia: clinical effectiveness and cost effectiveness. J Pediatr, 1991, 118:21-29.
2 Downs SM, McNutt RA, Margolis PA. Management of in foats at risk for occult bacteremia: a decision analysis. J Pediatr, 1991, 118:11-20.
, 百拇医药
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(收稿：1997-12-19 修回：1998-07-08), http://www.100md.com