层粘连蛋白受体及微血管密度与甲状腺癌转移的关系
作者：张维东 高雪芹 宋守芹 武利存 刘惠萍
单位：张维东 高雪芹 宋守芹 武利存(山东省医学科学院基础医学研究所 济南 250062)；刘惠萍(济南市中心医院病理科)
关键词：甲状腺肿瘤；层粘连蛋白受体；微血管密度；免疫组化
肿瘤000509 摘要：目的 探讨微血管密度(MVD)层粘连蛋白受体(LN-R)表达水平及其与甲状腺癌转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测33例原发性甲状腺癌中LN-R的表达及MVD计数。结果 33例原发性甲状腺癌中LN-R表达阳性者19例，表达率为57.6 %。在有转移的14例甲状腺癌中12例LN-R表达阳性，表达率为85.7 %。在无转移的19例中，LN-R表达阳性者7例，表达率为36.8 %。在有转移的甲状腺癌中LN-R阳性表达率明显高于无转移的甲状腺癌(P<0.001)。MVD计数在有淋巴结转移的甲状腺癌中为88.69±18.26，在无转移的甲状腺癌中为31.18±14.42，后者MVD计数明显低于前者(P<0.001)。在无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达阳性者的MVD计数为43.16±10.71，明显高于LN-R表达阴性者(P<0.05)。结论 LN-R表达及MVD计数与甲状腺癌的侵袭转移有关，可作为甲状腺癌患者的预后指标。
, http://www.100md.com
中图分类号：R736.1 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0334-03
THE SIGNIFICANCE OF MICROVESSEL DENSITY AND LAMININ RECEPTOR EXPRESSION IN THYROID CARCINOMA
ZHANG Wei-dong, GAO Xue-qin, SONG Shou-qin, et al.
(Institute of Basic Medical Sciences, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan, 250062 China)
Abstract：Objective To investigate the relationship between the laminin receptor expression and the microvessel density with metastasis of thyroid carcinoma. Methods The SP immunohistochemical method was employed to determine LN-R expression level and microvessel count in 33 cases of primary thyroid carcinoma. Results The overall positive rate of LN-L expression in thyroid carcinoma was 57.6 % (19/33), among which the node positive and negative groups were 85.7 % and 36.8 % respectively (P<0.01). On the other hand, microvessel density (MVD) of the node positive and negative groups were 88.69， 18.26 and 31.18， 14.42 respectively (P<0.001). In the node negative group, if the LN-R expression was positive MVD was higher than that of LN-R expression negative group. Conclusion Since the LN-R expression and MVD show a positive correlation with invasion and metastasis of thyroid carinoma. They were considered to be an important prognostic indicator of thyroid cancer.
, 百拇医药
Key words：Thyroid neoplansms; Lamimin receptor; Microvessel density; Immunohistochemistry
侵袭和转移是引起肿瘤治疗失败，导致患者死亡的主要原因。研究表明，层粘连蛋白受体(laminin receptor, LN-R)是连接肿瘤细胞与细胞外基质的重要分子，在肿瘤血管早期生成和肿瘤的侵袭和转移中起了重要作用[1，2]。在正常情况下LN-R位于细胞的基底部，与基底膜的层粘连蛋白(laminin LN)结合，定位于基底膜上，能够调节细胞的粘附、扩散、迁徙和增殖[1]。LN-R表达和微血管密度(microvessel density MVD)均可作为恶性肿瘤的预后指标已有报道[3]，但是MVD及LN-R在甲状腺癌中的表达国内尚少见报道。为了探讨MVD及LN-R表达在甲状腺癌中的意义，观察它们之间的相关性及其与甲状腺癌转移的关系。我们检测了甲状腺癌中的LN-R及MVD。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料 收集我院及济南市中心医院1997年内甲状腺癌存档标本33例。其中男性10例，女性23例，男女比为1∶2.3。在33例甲状腺癌标本中乳头状腺癌20例，滤泡腺癌11例，髓样癌2例。有淋巴结转移者14例，无转移者19例。
二、试剂 兔抗人F-ⅧRAg抗体，多克隆抗LN-R抗体(SA-0182,Sigma公司)，SP-9000试剂盒，DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
三、免疫组化染色 采用SP法。切片厚4 μm，常规脱蜡，梯度酒精脱水至蒸馏水后，染LN-R切片入枸橼酸缓冲液(10 mmol/L，pH 6.0)，92℃热修复30 min。蒸馏水洗3次。染F-ⅧRag的切片0.1 %胰酶消化，室温10 min，蒸馏水洗3次，用3 % H2O2阻断内源性过氧化物酶室温10 min，蒸馏水洗3次。滴加5 %山羊血清，室温10 min。倾去血清，滴加LN-R抗体1∶100，F-ⅧRAg抗体1∶100，湿盒内4℃冰箱过夜。PBS洗3次，每次5 min。加Bio/IgG标记的二抗1∶100，37℃ 30 min，PBS洗3次，每次5 min，加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素1∶100，37℃ 30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB显色室温10 min，自来水冲洗，苏木素复染胞核，脱水、透明、封固。用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照片用正常山羊血清代替一抗，PBS代替二抗和三抗。
, 百拇医药
四、阳性结果判定
LN-R判定 对免疫组化法进行评估，癌细胞膜及胞浆中出现棕黄色颗粒状物，切片中着色癌细胞数量>10 %判定为阳性。
MVD判定 选择切片中微血管密度高的区域在200倍的视野中计数。计数5个视野的微血管数，取其平均值。内皮细胞被染成棕黄色。无管腔者一个内皮细胞可计数为一条血管，有管腔者管腔内应少于8个红血球者方可计数。
统计学分析 各组MVD数据用
±s表示，均数用t检验。阳性率用t检验进行统计学处理。
结 果
一、LN-R在甲状腺癌中的表达 在33例原发性甲状腺癌中有19例LN-R表达阳性，表达率为57.6 %。阳性反应物成棕黄色颗粒状，主要定位于细胞膜及细胞质中。(见插页第Ⅰ页图4)阳性表达与淋巴结转移的关系见表1。
, 百拇医药
表1 甲状腺癌淋巴结与LN-R表达的关系 淋巴结
例数
LN-R(+)例数
阳性率(5)
转移
14
12
85.7
无转移
19
7
36.8
有淋巴结转移者LN-R表达阳性率为85.7 %(12/14)，明显高于无淋巴结转移者的阳性率36.8 %(7/19，P<0.001)。
, 百拇医药
二、甲状腺癌中MVD计数 内皮细胞胞质内有棕黄色颗粒状阳性反应物。MVD计数与甲状腺癌转移的关系见表2。有淋巴结转移的甲状腺癌中MVD数为88.69±18.26，无淋巴结转移者MVD为31.18±14.42，后者明显低于前者P<0.001，有非常显著意义(见插页第Ⅰ页图5)。
图4 甲状腺癌组织中LN-R表达阳性棕黄色颗粒状主要定位于胞膜和胞质中。(IHC×200)
图5 甲状腺癌组织中MVD阳性着色棕黄色颗粒位于血管内皮细胞胞质内。(1HC×200)(图4、5正文见第334页)
表2 甲状腺癌淋巴结与MVD的关系 淋巴结状态
, 百拇医药 甲状腺癌MVDx±s
转 移
88.69±18.26
无转移
31.18±14.42
三、LN-R表达与MVD计数在甲状腺癌中的关系 在有淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R阳性表达率为85.7 %(12/14)，MVD计数为88.69±18.26，均明显高于无转移者的36.8 %(7/19)和31.18±14.42。两者之间呈正相关。在无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达与MVD的关系见表3。在无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达阳性者的MVD计数为43.16±10.71，LN-R表达阳性无淋巴结转移者的MVD为20.34±11.57，明显低于前者(P<0.05)。
表3 无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达与MVD LN-R
, 百拇医药
例数
LN-R阳性率(%)
MVD
+
7
36.8
43.16±10.71
-
12
0
20.34±11.57
讨 论
研究证明LN-R是连接瘤细胞与细胞外基质的桥梁。LN-R的高表达，可使癌细胞与细胞外基质的粘附力增强，有利于肿瘤的侵袭和转移。本研究结果LN-R在有淋巴结转移的甲状腺癌的表达率为85.7 %，明显高于无转移者的36.8 %，两者表达率之间的差异有显著意义(P<0.001)，与文献报道一致[4，5]。进一步证实LN-R的表达与肿瘤的生物学行为有关，与甲状腺癌的侵袭与转移有关。
, http://www.100md.com
MVD与肿瘤的侵袭和转移的关系在乳腺、胃肠道和膀胱癌中得到证实[6]。动物实验结果显示微血管生成是肿瘤转移所必需的，微血管的形成增加了肿瘤细胞进入微循环的机会，因此肿瘤内MVD可能与肿瘤的侵袭性行为和转移有关[7，8]。Folkman认为MVD可作为判断乳腺癌预后的独立指标[9]。本项研究有淋巴结转移的甲状腺癌中MVD为88.69±18.26，明显高于无转移者的31.18±14.42，两组差别有显著性意义(P<0.001)。与Weidner等人在乳腺癌中的研究结果一致[6]。因此提示MVD增加在甲状腺癌转移诊断中有重要的临床意义。
一般情况下，有少数淋巴结阴性的甲状腺癌的病人早期即可发生转移，因此筛选这部分高危转移患者尤为重要，一直是许多临床工作者极为关注的问题。本项研究结果表明无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达阳性者的MVD明显高于LN-R表达阴性者(P<0.05)。提示LN-R表达阴性MVD增高的甲状腺癌患者具有潜在的转移的危险性。Gas等分析了171例淋巴结阴性的乳腺癌患者，其中LN-R无表达或低表达者中MVD也低者有68例，LN-R表达、MVD计数高者有28例，提示在淋巴结阴性的乳腺癌病人中，LN-R表达与MVD增加有一定的相关性，与我们的实验结果一致。因此认为LN-R表达和MVD计数对于选择淋巴结阴性的甲状腺癌患者中的高危病人具有重要意义，可作为预后指标，同时联合检测LN-R和MVD对术后选择治疗方案，如化疗方案或抗血管生成治疗具有指导性意义。
, 百拇医药
基金项目：山东省自然科学基金资助项目(Y94C0319)
作者简介：张维东，女，大学本科，研究员。
参考文献
[1]Pellgrinl R, Martinonc S, Tagliabue E, et al. Prognostic significance of laminin production in relation with its receptor expression in human breast carcinoma〔J〕. Br Cancer Res Treat, 1995, 35:195
[2]Marques LA. Franco LF. Torloni H, et al. Independent prognostic value of laminin receptor expression in breast cancer survival〔J〕. Cancer Res, 1990, 50:1479
, 百拇医药
[3]Maretignne S, Menard S, Bufalino R, et al. Prognostic significance of the 67-kilodalton receptor expression in human breast carcinomas〔J〕. JNCI, 1993, 85:398
[4]Gasparini G, Barbareschi M, Boracchi P, et al. 67-kD laminin receptor expression adds prognostic information to intra-tumoral microvessel density in node-negative breast cancer〔J〕. Int J Cancer, 1995, 60:604
[5]皋岚湘、丁华野、陈乐真，等. 层粘连蛋白及受体在乳腺癌的表达和预后的关系〔J〕. 中华病理学杂志，1998，27(1)：31
, http://www.100md.com
[6]Weidner N. Intratumoral microvessel density as a prognostic factor in cancer〔J〕. Am J Pathol, 1995, 147:9
[7]Bernstein LR, Liotta LA. Molecular mediators of interactions with extracellular matrix components in metastasis and angiogenesis〔J〕. Curr Opin Oncol, 1994, 6:106
[8]Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis——correlation in invasive breast carcinoma〔J〕. N Engl J Med, 1991, 324:1
[9]Folkman J. Angiogenesis and breast cancer〔J〕. J Clin Oncol, 1994, 12:441
(收稿日期：1999-09-17), http://www.100md.com
单位：张维东 高雪芹 宋守芹 武利存(山东省医学科学院基础医学研究所 济南 250062)；刘惠萍(济南市中心医院病理科)
关键词：甲状腺肿瘤；层粘连蛋白受体；微血管密度；免疫组化
肿瘤000509 摘要：目的 探讨微血管密度(MVD)层粘连蛋白受体(LN-R)表达水平及其与甲状腺癌转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测33例原发性甲状腺癌中LN-R的表达及MVD计数。结果 33例原发性甲状腺癌中LN-R表达阳性者19例，表达率为57.6 %。在有转移的14例甲状腺癌中12例LN-R表达阳性，表达率为85.7 %。在无转移的19例中，LN-R表达阳性者7例，表达率为36.8 %。在有转移的甲状腺癌中LN-R阳性表达率明显高于无转移的甲状腺癌(P<0.001)。MVD计数在有淋巴结转移的甲状腺癌中为88.69±18.26，在无转移的甲状腺癌中为31.18±14.42，后者MVD计数明显低于前者(P<0.001)。在无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达阳性者的MVD计数为43.16±10.71，明显高于LN-R表达阴性者(P<0.05)。结论 LN-R表达及MVD计数与甲状腺癌的侵袭转移有关，可作为甲状腺癌患者的预后指标。
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中图分类号：R736.1 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0334-03
THE SIGNIFICANCE OF MICROVESSEL DENSITY AND LAMININ RECEPTOR EXPRESSION IN THYROID CARCINOMA
ZHANG Wei-dong, GAO Xue-qin, SONG Shou-qin, et al.
(Institute of Basic Medical Sciences, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan, 250062 China)
Abstract：Objective To investigate the relationship between the laminin receptor expression and the microvessel density with metastasis of thyroid carcinoma. Methods The SP immunohistochemical method was employed to determine LN-R expression level and microvessel count in 33 cases of primary thyroid carcinoma. Results The overall positive rate of LN-L expression in thyroid carcinoma was 57.6 % (19/33), among which the node positive and negative groups were 85.7 % and 36.8 % respectively (P<0.01). On the other hand, microvessel density (MVD) of the node positive and negative groups were 88.69， 18.26 and 31.18， 14.42 respectively (P<0.001). In the node negative group, if the LN-R expression was positive MVD was higher than that of LN-R expression negative group. Conclusion Since the LN-R expression and MVD show a positive correlation with invasion and metastasis of thyroid carinoma. They were considered to be an important prognostic indicator of thyroid cancer.
, 百拇医药
Key words：Thyroid neoplansms; Lamimin receptor; Microvessel density; Immunohistochemistry
侵袭和转移是引起肿瘤治疗失败，导致患者死亡的主要原因。研究表明，层粘连蛋白受体(laminin receptor, LN-R)是连接肿瘤细胞与细胞外基质的重要分子，在肿瘤血管早期生成和肿瘤的侵袭和转移中起了重要作用[1，2]。在正常情况下LN-R位于细胞的基底部，与基底膜的层粘连蛋白(laminin LN)结合，定位于基底膜上，能够调节细胞的粘附、扩散、迁徙和增殖[1]。LN-R表达和微血管密度(microvessel density MVD)均可作为恶性肿瘤的预后指标已有报道[3]，但是MVD及LN-R在甲状腺癌中的表达国内尚少见报道。为了探讨MVD及LN-R表达在甲状腺癌中的意义，观察它们之间的相关性及其与甲状腺癌转移的关系。我们检测了甲状腺癌中的LN-R及MVD。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料 收集我院及济南市中心医院1997年内甲状腺癌存档标本33例。其中男性10例，女性23例，男女比为1∶2.3。在33例甲状腺癌标本中乳头状腺癌20例，滤泡腺癌11例，髓样癌2例。有淋巴结转移者14例，无转移者19例。
二、试剂 兔抗人F-ⅧRAg抗体，多克隆抗LN-R抗体(SA-0182,Sigma公司)，SP-9000试剂盒，DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
三、免疫组化染色 采用SP法。切片厚4 μm，常规脱蜡，梯度酒精脱水至蒸馏水后，染LN-R切片入枸橼酸缓冲液(10 mmol/L，pH 6.0)，92℃热修复30 min。蒸馏水洗3次。染F-ⅧRag的切片0.1 %胰酶消化，室温10 min，蒸馏水洗3次，用3 % H2O2阻断内源性过氧化物酶室温10 min，蒸馏水洗3次。滴加5 %山羊血清，室温10 min。倾去血清，滴加LN-R抗体1∶100，F-ⅧRAg抗体1∶100，湿盒内4℃冰箱过夜。PBS洗3次，每次5 min。加Bio/IgG标记的二抗1∶100，37℃ 30 min，PBS洗3次，每次5 min，加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素1∶100，37℃ 30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB显色室温10 min，自来水冲洗，苏木素复染胞核，脱水、透明、封固。用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照片用正常山羊血清代替一抗，PBS代替二抗和三抗。
, 百拇医药
四、阳性结果判定
LN-R判定 对免疫组化法进行评估，癌细胞膜及胞浆中出现棕黄色颗粒状物，切片中着色癌细胞数量>10 %判定为阳性。
MVD判定 选择切片中微血管密度高的区域在200倍的视野中计数。计数5个视野的微血管数，取其平均值。内皮细胞被染成棕黄色。无管腔者一个内皮细胞可计数为一条血管，有管腔者管腔内应少于8个红血球者方可计数。
统计学分析 各组MVD数据用
±s表示，均数用t检验。阳性率用t检验进行统计学处理。结 果
一、LN-R在甲状腺癌中的表达 在33例原发性甲状腺癌中有19例LN-R表达阳性，表达率为57.6 %。阳性反应物成棕黄色颗粒状，主要定位于细胞膜及细胞质中。(见插页第Ⅰ页图4)阳性表达与淋巴结转移的关系见表1。
, 百拇医药
表1 甲状腺癌淋巴结与LN-R表达的关系 淋巴结
例数
LN-R(+)例数
阳性率(5)
转移
14
12
85.7
无转移
19
7
36.8
有淋巴结转移者LN-R表达阳性率为85.7 %(12/14)，明显高于无淋巴结转移者的阳性率36.8 %(7/19，P<0.001)。
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二、甲状腺癌中MVD计数 内皮细胞胞质内有棕黄色颗粒状阳性反应物。MVD计数与甲状腺癌转移的关系见表2。有淋巴结转移的甲状腺癌中MVD数为88.69±18.26，无淋巴结转移者MVD为31.18±14.42，后者明显低于前者P<0.001，有非常显著意义(见插页第Ⅰ页图5)。
图4 甲状腺癌组织中LN-R表达阳性棕黄色颗粒状主要定位于胞膜和胞质中。(IHC×200)
图5 甲状腺癌组织中MVD阳性着色棕黄色颗粒位于血管内皮细胞胞质内。(1HC×200)(图4、5正文见第334页)
表2 甲状腺癌淋巴结与MVD的关系 淋巴结状态
, 百拇医药 甲状腺癌MVDx±s
转 移
88.69±18.26
无转移
31.18±14.42
三、LN-R表达与MVD计数在甲状腺癌中的关系 在有淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R阳性表达率为85.7 %(12/14)，MVD计数为88.69±18.26，均明显高于无转移者的36.8 %(7/19)和31.18±14.42。两者之间呈正相关。在无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达与MVD的关系见表3。在无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达阳性者的MVD计数为43.16±10.71，LN-R表达阳性无淋巴结转移者的MVD为20.34±11.57，明显低于前者(P<0.05)。
表3 无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达与MVD LN-R
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例数
LN-R阳性率(%)
MVD
+
7
36.8
43.16±10.71
-
12
0
20.34±11.57
讨 论
研究证明LN-R是连接瘤细胞与细胞外基质的桥梁。LN-R的高表达，可使癌细胞与细胞外基质的粘附力增强，有利于肿瘤的侵袭和转移。本研究结果LN-R在有淋巴结转移的甲状腺癌的表达率为85.7 %，明显高于无转移者的36.8 %，两者表达率之间的差异有显著意义(P<0.001)，与文献报道一致[4，5]。进一步证实LN-R的表达与肿瘤的生物学行为有关，与甲状腺癌的侵袭与转移有关。
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MVD与肿瘤的侵袭和转移的关系在乳腺、胃肠道和膀胱癌中得到证实[6]。动物实验结果显示微血管生成是肿瘤转移所必需的，微血管的形成增加了肿瘤细胞进入微循环的机会，因此肿瘤内MVD可能与肿瘤的侵袭性行为和转移有关[7，8]。Folkman认为MVD可作为判断乳腺癌预后的独立指标[9]。本项研究有淋巴结转移的甲状腺癌中MVD为88.69±18.26，明显高于无转移者的31.18±14.42，两组差别有显著性意义(P<0.001)。与Weidner等人在乳腺癌中的研究结果一致[6]。因此提示MVD增加在甲状腺癌转移诊断中有重要的临床意义。
一般情况下，有少数淋巴结阴性的甲状腺癌的病人早期即可发生转移，因此筛选这部分高危转移患者尤为重要，一直是许多临床工作者极为关注的问题。本项研究结果表明无淋巴结转移的甲状腺癌中LN-R表达阳性者的MVD明显高于LN-R表达阴性者(P<0.05)。提示LN-R表达阴性MVD增高的甲状腺癌患者具有潜在的转移的危险性。Gas等分析了171例淋巴结阴性的乳腺癌患者，其中LN-R无表达或低表达者中MVD也低者有68例，LN-R表达、MVD计数高者有28例，提示在淋巴结阴性的乳腺癌病人中，LN-R表达与MVD增加有一定的相关性，与我们的实验结果一致。因此认为LN-R表达和MVD计数对于选择淋巴结阴性的甲状腺癌患者中的高危病人具有重要意义，可作为预后指标，同时联合检测LN-R和MVD对术后选择治疗方案，如化疗方案或抗血管生成治疗具有指导性意义。
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基金项目：山东省自然科学基金资助项目(Y94C0319)
作者简介：张维东，女，大学本科，研究员。
参考文献
[1]Pellgrinl R, Martinonc S, Tagliabue E, et al. Prognostic significance of laminin production in relation with its receptor expression in human breast carcinoma〔J〕. Br Cancer Res Treat, 1995, 35:195
[2]Marques LA. Franco LF. Torloni H, et al. Independent prognostic value of laminin receptor expression in breast cancer survival〔J〕. Cancer Res, 1990, 50:1479
, 百拇医药
[3]Maretignne S, Menard S, Bufalino R, et al. Prognostic significance of the 67-kilodalton receptor expression in human breast carcinomas〔J〕. JNCI, 1993, 85:398
[4]Gasparini G, Barbareschi M, Boracchi P, et al. 67-kD laminin receptor expression adds prognostic information to intra-tumoral microvessel density in node-negative breast cancer〔J〕. Int J Cancer, 1995, 60:604
[5]皋岚湘、丁华野、陈乐真，等. 层粘连蛋白及受体在乳腺癌的表达和预后的关系〔J〕. 中华病理学杂志，1998，27(1)：31
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[6]Weidner N. Intratumoral microvessel density as a prognostic factor in cancer〔J〕. Am J Pathol, 1995, 147:9
[7]Bernstein LR, Liotta LA. Molecular mediators of interactions with extracellular matrix components in metastasis and angiogenesis〔J〕. Curr Opin Oncol, 1994, 6:106
[8]Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis——correlation in invasive breast carcinoma〔J〕. N Engl J Med, 1991, 324:1
[9]Folkman J. Angiogenesis and breast cancer〔J〕. J Clin Oncol, 1994, 12:441
(收稿日期：1999-09-17), http://www.100md.com