层粘连蛋白总糖肽抗癌细胞转移机制的研究
作者：路艳艳 周柔丽 张莎 蒋新农
单位：北京大学基础医学院细胞生物学教研室，北京 100083
关键词：层粘连蛋白；药理学；糖肽类；药理学；肿瘤转移；药物疗法
北京医科大学学报000318 [摘 要] 目的：从癌细胞增殖、凋亡和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) 的分泌等方面研究层粘连蛋白总糖肽(laminin-glycopeptides, LN-GPs) 抗癌细胞转移的机制。方法：将人肝癌细胞系Bel7402细胞于层粘连蛋白基质上孵育一定时间后，噻唑蓝比色法测活细胞群体总数。3H-TdR参入法测癌细胞DNA的合成；荧光素活化的细胞分拣术(fluorescent activated cell sorting, FACS)测定细胞周期；细胞经吉姆萨染色后计数有丝分裂指数；FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡。明胶酶谱分析法检测无血清培养上清中癌细胞分泌MMPs的水平。糖肽组加LN-GPs (50 mg.L-1)。结果：癌细胞孵育后，活细胞群体总数增加，3H-TdR的参入升高，G1期细胞减少而S期细胞增加。相反，加LN-GPs组活细胞群体总数明显降低，3H-TdR的参入下降，G1期细胞增加而S期细胞减少，与未包被组结果相近。但两种方法均未检测到明显的癌细胞凋亡。LN-GPs组人肝癌细胞系Bel7402细胞和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG细胞的MMPs分泌和活化明显降低。结论：LN可促进癌细胞的增殖，而LN-GPs能抑制这一作用，并可明显抑制癌细胞MMPs的分泌，这可能是其抑制癌细胞侵袭和转移的重要环节。
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[中图分类号]R979.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-00258-04
Further studies on the anti-metastasis mechanism of Laminin-glycopeptides
LU Yan-Yan, ZHOU Rou-Li, ZHANG Sha, JIANG Xin-Nong
(Department of Cell Biology, School of Basical Medical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To further study the mechanism of anti-metastasis effects of laminin-glycopeptides (LN-GPs) on carcinoma cell proliferation, apoptosis and secretion of matrix metalloproteinases (MMPs). Methods: Human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line Bel7402 cells in serum free medium were incubated on laminin (LN) coated substrate for indicated time with or without LN-GPs at the final concentration of 50 mg.L-1. The total number of survival cells after incubating for 24, 48, 72 and 96 hours was assayed by MTT method. DNA synthesis of the incubated cells was analyzed by 3H-TdR incorporation. Cell cycle was analyzed by FACS (fluorescent activated cell sorting, FACS). Mitotic index of Giemsa stained cells was counted. Carcinoma cell apoptosis was detected by both FACS and acridine orange (AO) staining methods. MMPs secretion of incubated cells was analyzed by gelatin zymography. Results: The total number of survival carcinoma cells incubated on LN was significantly larger than that on uncoated substrate. LN could promote HCC cell DNA synthesis as shown by 3H-TdR incorporation, decrease the percentage of carcinoma cells in G1 phase and increase the percentage of carcinoma cells in S phase as shown by FACS. In contrast, LN-GPs could inhibit the effect of LN by inhibiting carcinoma cell 3H-TdR incorporation, increasing the percentage of carcinoma cells in G1 phase and decreasing the percentage of carcinoma cells in S phase. MMPs secretion of carcinoma cells on LN in the presence of LN-GPs was much less compared with that of cells on LN alone. Conclusion: LN could stimulate carcinoma cell proliferation. LN-GPs could significantly inhibit the effect by inhibiting DNA synthesis and could inhibit the secretion of MMPs of carcinoma cells, which might contribute to their decreased invasive and metastatic phenotype.
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KEY WORDS Laminin/pharmacol; Glycopeptides/pharmacol; Neoplasm metastasis/drug ther▲
层粘连蛋白 (laminin, LN) 是一种高度糖基化的大分子非胶原糖蛋白，是特化的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)——基膜的特有成分。在细胞表面受体的介导下，LN可以影响癌细胞的多种生物学行为。一定的糖链结构是LN与LN受体之间识别和结合的分子基础[1]。本室以往的研究表明，从LN中分离的总糖肽(laminin-glycopeptides, LN-GPs)以及依据LN-GPs之有效结构设计并人工合成的两种寡糖可抑制小鼠黑色素瘤细胞的实验性肝转移和/或实验性肺转移[2，3]，LN-GPs可以抑制癌细胞在LN基质上的粘附、铺展、迁移和侵袭等转移相关行为[4]。本文进一步研究LN-GPs对癌细胞在LN基质上增殖、凋亡及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)分泌的影响，以进一步揭示其抗转移的分子机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
人肝癌细胞系Bel7402和人胃癌细胞系BGC-823由北京师范大学引进。高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG由本校病理学系提供。细胞均在含10%(体积分数)小牛血清的完全RPMI-1640培养基，5%(体积分数)的CO2中，于37℃培养。
LN由本室自小鼠Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 瘤制备，为LN-1；LN-GPs由本室自LN制品制备，根据中性糖含量定量。RPMI-1640培养基干粉为GibcoBRL公司产品；MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide]为Sigma公司产品；3H-TdR购自中科院上海核能研究所。其它试剂为国产分析纯或优级纯。
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1.2 方法
LN基质的包被：参见文献[1]。对照组除不加LN外其余处理同LN组。通过LN-GPs对细胞粘附的抑制作用确定本批LN-GPs的有效质量浓度为50 mg*L-1。
MTT法检测活细胞群体总数：将单细胞悬液台盼蓝排斥法测细胞活率>95%。细胞用无血清RPMI-1640洗3遍后，以每毫升105个细胞，每孔100 μl接种于96孔板中培养。MTT的检测方法参见文献[5]。每24 h测定1次，设4复孔取均值。
3H-TdR参入法检测细胞的DNA合成：将单层培养细胞消化后制成单细胞悬液，以每孔104个细胞接种至24孔板培养。24 h后每孔加3H-TdR 5 μBq继续培养24 h。将细胞用PBS充分漂洗后收集于玻璃滤纸上，液体闪烁仪上测其每分计数值。设4复孔取均值。
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荧光素活化的细胞分拣术(fluorescent activated cell sorting, FACS)分析细胞周期：细胞在LN基质上、加或不加LN-GPs的条件下培养48 h后制成单细胞悬液，经RNA酶消化，碘化丙啶染色后，流式细胞仪上检测单细胞DNA的含量，分析不同周期时相的细胞数。
细胞有丝分裂指数的测定：细胞在包被LN的盖玻片上，在加或不加LN-GPs的条件下培养48 h，细胞爬片经甲醇冰醋酸固定、吉姆萨染色后下计数每1 000个细胞中有丝分裂期细胞的百分数。
FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡：按细胞周期分析的方法处理细胞，于流式细胞仪上检测细胞的凋亡峰。丫啶橙染色法时按有丝分裂指数的方法做细胞爬片，经酒精固定及1 g*L-1的丫啶橙染色后，蓝光激发下荧光显微镜下计数凋亡细胞。
明胶酶谱分析、细胞MMPs分泌见文献[6]。
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2 结果
2.1 LN和LN-GPs对人肝癌细胞系Bel7402细胞活细胞群体总数的影响(图1)
MTT检测结果显示在无血清条件下，细胞在LN基质上培养24～96 h后的活细胞群体总数明显高于未包被LN基质的对照组，培养72 h活细胞群体总数达到峰值；而糖肽组者明显低于LN组，与对照组相近，以48 h的差别最为明显。表明LN基质对无血清培养的Bel7402细胞具有明显的促增殖作用；而LN-GPs可以明显抑制LN的这一作用。
2.2 3H-TdR参入实验的结果
Bel7402细胞孵育48 h后，未包被基质对照组、包被LN基质组和加LN-GPs组的平均每分计数值分别为2 645±134，3 661±231和2 856±202。LN基质组细胞的3H-TdR参入量高于未包被基质的对照组约38.4%(P<0.01)。而LN-GPs可以使参入率降低21.9%(P<0.05)。与MTT的结果一致。
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2.3 FACS对细胞周期的测定结果(表1)
与未包被的对照组相比，在LN基质上孵育48 h后，Bel7402细胞处于G1期的比率由(68.0±3.3)%降为(52.4±2.4)%，S期细胞的比率由(19.0±2.1)%增加到(34.2±3.8)%；同样BGC823细胞G1期比率由(74.0±8.2)%降为(63.3±7.9)%，S期细胞的比率由(17.7±3.0)%增加到(27.6±4.2)%。各组间相比差异均有极显著意义(P<0.01)，而加LN-GPs组Bel7402细胞和BGC823细胞G1期的比率均增加，分别为(66.7±9.4)%和(74.5±8.3)%；S期比率下降，分别为(21.2±3.0)%和(16.9±3.1)%，与未包被组各期分布相似。各组间相比差异均有显著意义(P<0.05)。虽然各组细胞G2+M期的比率略有变化，但差异无统计学意义。
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A, absorbance; t, time.
图1 MTT法检测LN和LN-GPs对
Bel7402细胞活细胞群体总数的影响
Figure 1 Effects of LN and LN-GPs on the total
number of survival Bel7402 cell detected by MTT
2.4 有丝分裂指数测定的结果
细胞在LN上无血清孵育48 h后，有丝分裂指数平均为(10.3±1.1)%，对照组为(9.3±1.1)%；而加LN-GPs组有丝分裂指数为(9.4±0.9)%。各组间相比差异均无显著意义(P>0.05)。与FACS测定G2+M期细胞比率的结果一致。
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2.5 细胞凋亡的检测
FACS检测在LN基质上、有和无LN-GPs的条件下培养的Bel7402细胞，重复两次均未检测到明显的细胞凋亡峰。进一步用丫啶橙染色法，荧光显微镜下计数1 000个细胞，偶见2～3个凋亡细胞。故可以认为LN-GPs并不诱导癌细胞发生凋亡。
2.6 明胶酶谱分析结果(图2)
PG细胞在LN作用下分泌相对分子质量为92×103的MMP-9，而在加LN-GPs组MMP-9的分泌明显降低。Bel7402细胞在LN作用下除了分泌MMP-9外，还分泌相对分子质量为72×103的酶原型MMP-2和相对分子质量为62×103的活化型MMP-2；而在加LN-GPs组，MMP-9的分泌几乎被完全抑制，两种形式的MMP-2的分泌也明显降低。说明LN-GPs可以抑制癌细胞MMPs的分泌。
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表1 流式细胞术分析LN和LN-GPs对细胞周期的影响(
±s)
Table 1 Effects of LN and LN-GPs on cell cycle detected by FACS (±s) Cell
cycle
Bel7402
BGC823
Control(%)
LN(%)
LN+LN-GPs(%)
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Control(%)
LN(%)
LN+LN-GPs(%)
G1
68.0±3.3
52.4±2.4
66.7±9.4
74.0±8.2
63.3±7.9
74.5±8.3
S
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19.0±2.1
34.2±3.8
21.2±3.0
17.7±3.0
27.6±4.2
16.9±3.1
G2+M
13.0±1.6
13.4±2.2
12.1±1.6
8.3±2.1
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9.1±2.3
8.6±1.5
P<0.01， compared with control group; P<0.05 compared with LN group.
Left, PG cells; right, Bel7402 cells; lane 1,2, on LN-coated substrate; lane 3,4, on LN coated-substrate plus LN-GPs.
图2 LN和LN-GPs对细胞分泌MMPs的影响
Figure 2 Effects of LN and LN-GPs on the cell secretion of MMPs
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3 讨论
新的观点认为，LN可以作为一种信息分子，通过细胞表面的受体刺激细胞内的信号系统，进而影响基因的表达和细胞表型的改变。LN分子中的糖链在LN与其受体的识别、结合和信号转导中起着十分重要的作用。LN-GPs是从LN中分离的总糖肽成分，可能通过竞争性结合LN受体而阻断LN的生物学功能。
本室以往的研究表明：在体内，LN-GPs可以抑制小鼠黑色素瘤细胞的实验性肝转移和实验性肺转移[2，3]；在体外，LN-GPs可以抑制癌细胞的粘附、铺展、迁移和侵袭等多种转移相关行为[4]。本文的研究结果显示，LN可以促进Bel7402细胞的增殖，而LN-GPs可以抑制LN的这一作用。Bel7402细胞在包被LN的基质上培养24～48 h后，活细胞群体总数明显高于未包被的对照组，而加LN-GPs组的结果明显低于单纯包被LN组。其差别在48 h最为明显，因此我们选择作用48 h这一时间点进行深入的研究。
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导致活细胞群体总数降低的原因可能有两个；一是LN-GPs对细胞的直接毒害作用导致细胞的死亡或是诱导细胞发生凋亡；二是抑制细胞的增殖。台盼蓝排斥实验表明LN-GPs对细胞没有毒性作用，并不能直接杀伤癌细胞[4]。同时也排除了细胞毒性杀伤对本文各项结果的影响。我们先后用DNA Ladder分析(未发表资料)、FACS以及AO染色等方法，都没有检测到明显的细胞凋亡。由此推论，LN-GPs所致活细胞群体总数的降低亦非诱导细胞的凋亡。而从3H-TdR参入、细胞周期时相分析及有丝分裂指数测定的结果可以看出：LN可以促进Bel7402和BGC-823细胞的DNA合成；使G1期细胞减少而S期细胞增多。相反LN-GPs可以抑制这一作用，细胞周期阻滞于由G1期到S期的演进，以致活细胞群体总数降低。
肿瘤转移是一多环节、多步骤的复杂过程。包括细胞突破自身的基膜而进入脉管，在脉管内形成癌栓，在适宜的脉管壁粘附，再次突破基膜并穿出脉管，以及转移细胞在异位组织增殖并形成转移灶等多个环节。本室以往的研究表明，LN-GPs一方面可以抑制癌患者血清中的内源性凝集素所引起的癌细胞的凝集，从而抑制癌栓的形成[7]；另一方面可以抑制癌细胞在基质上的迁移和对人工基膜的侵袭[4]，通过这两方面的作用来抑制癌细胞的转移。
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LN分子α1链的球区和β1链的短杆区均含有表皮生长因子样重复序列，可能具有生长因子的作用促进癌细胞的增殖，而LN-GPs可能通过阻断LN与受体的相互作用和继而启动的信号转导来抑制癌细胞的增殖。Wewer等[8]对小鼠实验性肺转移模型的研究发现：在未形成转移灶的肺组织的小血管中可以见到自尾静脉接种的癌细胞，由于细胞未能进行增殖而未形成转移灶。本研究的结果提示，LN-GPs对癌细胞增殖的抑制作用对于抑制癌细胞的异位增殖和转移灶的形成具有重要意义。
癌细胞的侵袭和转移依赖于细胞的迁移、基质和MMPs对基质的降解。MMPs是一类降解细胞外基质的Zn2+依赖性内肽酶[9]，酶谱分析、正义和反义基因转染等的研究均证实多种肿瘤细胞系的MMPs表达水平和活性与其侵袭和转移表型呈正相关[10]。本研究用酶谱分析的方法检测了人肝癌细胞系Bel7402和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG在LN和LN-GPs作用下MMPs的分泌。结果表明LN-GPs可以明显抑制两种细胞MMPs的分泌。因此LN-GPs对癌细胞分泌MMPs的抑制作用可能是其抑制癌细胞的侵袭和转移的分子机制。
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由此可见，LN-GPs的作用是多方位的，既可以通过抑制癌细胞在LN基质上的粘附、铺展、迁移、侵袭及MMPs的分泌而降低癌细胞的侵袭性，又可以抑制癌细胞的增殖，使其阻滞于G1期到S期的演进。通过多环节的作用来抑制癌细胞的转移。但它并不能诱导癌细胞的凋亡。
(本文中明胶酶谱分析实验承蒙中科院动物所徐平同志的大力协助，特此致谢。)■
基金项目：国家自然科学基金(39570801)资助项目。
参考文献
[1]周柔丽，高素英，王 苏，等.层粘连蛋白促进实体瘤细胞粘着、铺展及3H-TdR参入[J].生物化学杂志，1987，3：261-269
[2]赵 勇，周柔丽.层粘连蛋白总糖肽在B16-MBK黑色素瘤细胞对小鼠实验性肺转移中的作用[J].北京医科大学学报，1992，24：404
, 百拇医药
[3]刘艺萍，周柔丽，王永富,等.两种寡糖对小鼠黑色素瘤细胞的实验性肝转移的抑制作用[J].中华医学杂志，1997，77：205-207
[4]Jiang XN, Zhou RL, Zhang S. Effects of laminin-glycopeptides on metastasis-related behaviors of cancer cells[J]. Cell Res, 1998, 8：231-240
[5]陈哲生，孙明杰，刘振龙，等.噻唑蓝比色法用来研究人淋巴细胞和小鼠巨噬细胞的活性[J].上海免疫学杂志，1992，12：269
[6]Kleiner DE, Stetler-Stevenson WG. Quantitative zymography: detection picogram quantities of gelatinases[J]. Anal Biochem, 1994，218:325-329
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[7]周柔丽，刘广超，侯 林，等.癌患者血清中癌细胞凝集因子的初步研究[J].中华医学杂志，1994，74：433-434
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[9]Stetler-Stevenson WG, Hewitt R, Corcoran M， et al, Matrix metalloproteinases and tumor invasion: from correlation and causality to clinic[J]. Semin Cancer Biol, 1996, 7: 147-154
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收稿日期：1999-06-07, 百拇医药
单位：北京大学基础医学院细胞生物学教研室，北京 100083
关键词：层粘连蛋白；药理学；糖肽类；药理学；肿瘤转移；药物疗法
北京医科大学学报000318 [摘 要] 目的：从癌细胞增殖、凋亡和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) 的分泌等方面研究层粘连蛋白总糖肽(laminin-glycopeptides, LN-GPs) 抗癌细胞转移的机制。方法：将人肝癌细胞系Bel7402细胞于层粘连蛋白基质上孵育一定时间后，噻唑蓝比色法测活细胞群体总数。3H-TdR参入法测癌细胞DNA的合成；荧光素活化的细胞分拣术(fluorescent activated cell sorting, FACS)测定细胞周期；细胞经吉姆萨染色后计数有丝分裂指数；FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡。明胶酶谱分析法检测无血清培养上清中癌细胞分泌MMPs的水平。糖肽组加LN-GPs (50 mg.L-1)。结果：癌细胞孵育后，活细胞群体总数增加，3H-TdR的参入升高，G1期细胞减少而S期细胞增加。相反，加LN-GPs组活细胞群体总数明显降低，3H-TdR的参入下降，G1期细胞增加而S期细胞减少，与未包被组结果相近。但两种方法均未检测到明显的癌细胞凋亡。LN-GPs组人肝癌细胞系Bel7402细胞和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG细胞的MMPs分泌和活化明显降低。结论：LN可促进癌细胞的增殖，而LN-GPs能抑制这一作用，并可明显抑制癌细胞MMPs的分泌，这可能是其抑制癌细胞侵袭和转移的重要环节。
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[中图分类号]R979.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-00258-04
Further studies on the anti-metastasis mechanism of Laminin-glycopeptides
LU Yan-Yan, ZHOU Rou-Li, ZHANG Sha, JIANG Xin-Nong
(Department of Cell Biology, School of Basical Medical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To further study the mechanism of anti-metastasis effects of laminin-glycopeptides (LN-GPs) on carcinoma cell proliferation, apoptosis and secretion of matrix metalloproteinases (MMPs). Methods: Human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line Bel7402 cells in serum free medium were incubated on laminin (LN) coated substrate for indicated time with or without LN-GPs at the final concentration of 50 mg.L-1. The total number of survival cells after incubating for 24, 48, 72 and 96 hours was assayed by MTT method. DNA synthesis of the incubated cells was analyzed by 3H-TdR incorporation. Cell cycle was analyzed by FACS (fluorescent activated cell sorting, FACS). Mitotic index of Giemsa stained cells was counted. Carcinoma cell apoptosis was detected by both FACS and acridine orange (AO) staining methods. MMPs secretion of incubated cells was analyzed by gelatin zymography. Results: The total number of survival carcinoma cells incubated on LN was significantly larger than that on uncoated substrate. LN could promote HCC cell DNA synthesis as shown by 3H-TdR incorporation, decrease the percentage of carcinoma cells in G1 phase and increase the percentage of carcinoma cells in S phase as shown by FACS. In contrast, LN-GPs could inhibit the effect of LN by inhibiting carcinoma cell 3H-TdR incorporation, increasing the percentage of carcinoma cells in G1 phase and decreasing the percentage of carcinoma cells in S phase. MMPs secretion of carcinoma cells on LN in the presence of LN-GPs was much less compared with that of cells on LN alone. Conclusion: LN could stimulate carcinoma cell proliferation. LN-GPs could significantly inhibit the effect by inhibiting DNA synthesis and could inhibit the secretion of MMPs of carcinoma cells, which might contribute to their decreased invasive and metastatic phenotype.
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KEY WORDS Laminin/pharmacol; Glycopeptides/pharmacol; Neoplasm metastasis/drug ther▲
层粘连蛋白 (laminin, LN) 是一种高度糖基化的大分子非胶原糖蛋白，是特化的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)——基膜的特有成分。在细胞表面受体的介导下，LN可以影响癌细胞的多种生物学行为。一定的糖链结构是LN与LN受体之间识别和结合的分子基础[1]。本室以往的研究表明，从LN中分离的总糖肽(laminin-glycopeptides, LN-GPs)以及依据LN-GPs之有效结构设计并人工合成的两种寡糖可抑制小鼠黑色素瘤细胞的实验性肝转移和/或实验性肺转移[2，3]，LN-GPs可以抑制癌细胞在LN基质上的粘附、铺展、迁移和侵袭等转移相关行为[4]。本文进一步研究LN-GPs对癌细胞在LN基质上增殖、凋亡及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)分泌的影响，以进一步揭示其抗转移的分子机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
人肝癌细胞系Bel7402和人胃癌细胞系BGC-823由北京师范大学引进。高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG由本校病理学系提供。细胞均在含10%(体积分数)小牛血清的完全RPMI-1640培养基，5%(体积分数)的CO2中，于37℃培养。
LN由本室自小鼠Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 瘤制备，为LN-1；LN-GPs由本室自LN制品制备，根据中性糖含量定量。RPMI-1640培养基干粉为GibcoBRL公司产品；MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide]为Sigma公司产品；3H-TdR购自中科院上海核能研究所。其它试剂为国产分析纯或优级纯。
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1.2 方法
LN基质的包被：参见文献[1]。对照组除不加LN外其余处理同LN组。通过LN-GPs对细胞粘附的抑制作用确定本批LN-GPs的有效质量浓度为50 mg*L-1。
MTT法检测活细胞群体总数：将单细胞悬液台盼蓝排斥法测细胞活率>95%。细胞用无血清RPMI-1640洗3遍后，以每毫升105个细胞，每孔100 μl接种于96孔板中培养。MTT的检测方法参见文献[5]。每24 h测定1次，设4复孔取均值。
3H-TdR参入法检测细胞的DNA合成：将单层培养细胞消化后制成单细胞悬液，以每孔104个细胞接种至24孔板培养。24 h后每孔加3H-TdR 5 μBq继续培养24 h。将细胞用PBS充分漂洗后收集于玻璃滤纸上，液体闪烁仪上测其每分计数值。设4复孔取均值。
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荧光素活化的细胞分拣术(fluorescent activated cell sorting, FACS)分析细胞周期：细胞在LN基质上、加或不加LN-GPs的条件下培养48 h后制成单细胞悬液，经RNA酶消化，碘化丙啶染色后，流式细胞仪上检测单细胞DNA的含量，分析不同周期时相的细胞数。
细胞有丝分裂指数的测定：细胞在包被LN的盖玻片上，在加或不加LN-GPs的条件下培养48 h，细胞爬片经甲醇冰醋酸固定、吉姆萨染色后下计数每1 000个细胞中有丝分裂期细胞的百分数。
FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡：按细胞周期分析的方法处理细胞，于流式细胞仪上检测细胞的凋亡峰。丫啶橙染色法时按有丝分裂指数的方法做细胞爬片，经酒精固定及1 g*L-1的丫啶橙染色后，蓝光激发下荧光显微镜下计数凋亡细胞。
明胶酶谱分析、细胞MMPs分泌见文献[6]。
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2 结果
2.1 LN和LN-GPs对人肝癌细胞系Bel7402细胞活细胞群体总数的影响(图1)
MTT检测结果显示在无血清条件下，细胞在LN基质上培养24～96 h后的活细胞群体总数明显高于未包被LN基质的对照组，培养72 h活细胞群体总数达到峰值；而糖肽组者明显低于LN组，与对照组相近，以48 h的差别最为明显。表明LN基质对无血清培养的Bel7402细胞具有明显的促增殖作用；而LN-GPs可以明显抑制LN的这一作用。
2.2 3H-TdR参入实验的结果
Bel7402细胞孵育48 h后，未包被基质对照组、包被LN基质组和加LN-GPs组的平均每分计数值分别为2 645±134，3 661±231和2 856±202。LN基质组细胞的3H-TdR参入量高于未包被基质的对照组约38.4%(P<0.01)。而LN-GPs可以使参入率降低21.9%(P<0.05)。与MTT的结果一致。
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2.3 FACS对细胞周期的测定结果(表1)
与未包被的对照组相比，在LN基质上孵育48 h后，Bel7402细胞处于G1期的比率由(68.0±3.3)%降为(52.4±2.4)%，S期细胞的比率由(19.0±2.1)%增加到(34.2±3.8)%；同样BGC823细胞G1期比率由(74.0±8.2)%降为(63.3±7.9)%，S期细胞的比率由(17.7±3.0)%增加到(27.6±4.2)%。各组间相比差异均有极显著意义(P<0.01)，而加LN-GPs组Bel7402细胞和BGC823细胞G1期的比率均增加，分别为(66.7±9.4)%和(74.5±8.3)%；S期比率下降，分别为(21.2±3.0)%和(16.9±3.1)%，与未包被组各期分布相似。各组间相比差异均有显著意义(P<0.05)。虽然各组细胞G2+M期的比率略有变化，但差异无统计学意义。
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A, absorbance; t, time.
图1 MTT法检测LN和LN-GPs对
Bel7402细胞活细胞群体总数的影响
Figure 1 Effects of LN and LN-GPs on the total
number of survival Bel7402 cell detected by MTT
2.4 有丝分裂指数测定的结果
细胞在LN上无血清孵育48 h后，有丝分裂指数平均为(10.3±1.1)%，对照组为(9.3±1.1)%；而加LN-GPs组有丝分裂指数为(9.4±0.9)%。各组间相比差异均无显著意义(P>0.05)。与FACS测定G2+M期细胞比率的结果一致。
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2.5 细胞凋亡的检测
FACS检测在LN基质上、有和无LN-GPs的条件下培养的Bel7402细胞，重复两次均未检测到明显的细胞凋亡峰。进一步用丫啶橙染色法，荧光显微镜下计数1 000个细胞，偶见2～3个凋亡细胞。故可以认为LN-GPs并不诱导癌细胞发生凋亡。
2.6 明胶酶谱分析结果(图2)
PG细胞在LN作用下分泌相对分子质量为92×103的MMP-9，而在加LN-GPs组MMP-9的分泌明显降低。Bel7402细胞在LN作用下除了分泌MMP-9外，还分泌相对分子质量为72×103的酶原型MMP-2和相对分子质量为62×103的活化型MMP-2；而在加LN-GPs组，MMP-9的分泌几乎被完全抑制，两种形式的MMP-2的分泌也明显降低。说明LN-GPs可以抑制癌细胞MMPs的分泌。
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表1 流式细胞术分析LN和LN-GPs对细胞周期的影响(
±s)Table 1 Effects of LN and LN-GPs on cell cycle detected by FACS (
±s) Cellcycle
Bel7402
BGC823
Control(%)
LN(%)
LN+LN-GPs(%)
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Control(%)
LN(%)
LN+LN-GPs(%)
G1
68.0±3.3
52.4±2.4
66.7±9.4
74.0±8.2
63.3±7.9
74.5±8.3
S
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19.0±2.1
34.2±3.8
21.2±3.0
17.7±3.0
27.6±4.2
16.9±3.1
G2+M
13.0±1.6
13.4±2.2
12.1±1.6
8.3±2.1
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9.1±2.3
8.6±1.5
P<0.01， compared with control group; P<0.05 compared with LN group.
Left, PG cells; right, Bel7402 cells; lane 1,2, on LN-coated substrate; lane 3,4, on LN coated-substrate plus LN-GPs.
图2 LN和LN-GPs对细胞分泌MMPs的影响
Figure 2 Effects of LN and LN-GPs on the cell secretion of MMPs
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3 讨论
新的观点认为，LN可以作为一种信息分子，通过细胞表面的受体刺激细胞内的信号系统，进而影响基因的表达和细胞表型的改变。LN分子中的糖链在LN与其受体的识别、结合和信号转导中起着十分重要的作用。LN-GPs是从LN中分离的总糖肽成分，可能通过竞争性结合LN受体而阻断LN的生物学功能。
本室以往的研究表明：在体内，LN-GPs可以抑制小鼠黑色素瘤细胞的实验性肝转移和实验性肺转移[2，3]；在体外，LN-GPs可以抑制癌细胞的粘附、铺展、迁移和侵袭等多种转移相关行为[4]。本文的研究结果显示，LN可以促进Bel7402细胞的增殖，而LN-GPs可以抑制LN的这一作用。Bel7402细胞在包被LN的基质上培养24～48 h后，活细胞群体总数明显高于未包被的对照组，而加LN-GPs组的结果明显低于单纯包被LN组。其差别在48 h最为明显，因此我们选择作用48 h这一时间点进行深入的研究。
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导致活细胞群体总数降低的原因可能有两个；一是LN-GPs对细胞的直接毒害作用导致细胞的死亡或是诱导细胞发生凋亡；二是抑制细胞的增殖。台盼蓝排斥实验表明LN-GPs对细胞没有毒性作用，并不能直接杀伤癌细胞[4]。同时也排除了细胞毒性杀伤对本文各项结果的影响。我们先后用DNA Ladder分析(未发表资料)、FACS以及AO染色等方法，都没有检测到明显的细胞凋亡。由此推论，LN-GPs所致活细胞群体总数的降低亦非诱导细胞的凋亡。而从3H-TdR参入、细胞周期时相分析及有丝分裂指数测定的结果可以看出：LN可以促进Bel7402和BGC-823细胞的DNA合成；使G1期细胞减少而S期细胞增多。相反LN-GPs可以抑制这一作用，细胞周期阻滞于由G1期到S期的演进，以致活细胞群体总数降低。
肿瘤转移是一多环节、多步骤的复杂过程。包括细胞突破自身的基膜而进入脉管，在脉管内形成癌栓，在适宜的脉管壁粘附，再次突破基膜并穿出脉管，以及转移细胞在异位组织增殖并形成转移灶等多个环节。本室以往的研究表明，LN-GPs一方面可以抑制癌患者血清中的内源性凝集素所引起的癌细胞的凝集，从而抑制癌栓的形成[7]；另一方面可以抑制癌细胞在基质上的迁移和对人工基膜的侵袭[4]，通过这两方面的作用来抑制癌细胞的转移。
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LN分子α1链的球区和β1链的短杆区均含有表皮生长因子样重复序列，可能具有生长因子的作用促进癌细胞的增殖，而LN-GPs可能通过阻断LN与受体的相互作用和继而启动的信号转导来抑制癌细胞的增殖。Wewer等[8]对小鼠实验性肺转移模型的研究发现：在未形成转移灶的肺组织的小血管中可以见到自尾静脉接种的癌细胞，由于细胞未能进行增殖而未形成转移灶。本研究的结果提示，LN-GPs对癌细胞增殖的抑制作用对于抑制癌细胞的异位增殖和转移灶的形成具有重要意义。
癌细胞的侵袭和转移依赖于细胞的迁移、基质和MMPs对基质的降解。MMPs是一类降解细胞外基质的Zn2+依赖性内肽酶[9]，酶谱分析、正义和反义基因转染等的研究均证实多种肿瘤细胞系的MMPs表达水平和活性与其侵袭和转移表型呈正相关[10]。本研究用酶谱分析的方法检测了人肝癌细胞系Bel7402和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG在LN和LN-GPs作用下MMPs的分泌。结果表明LN-GPs可以明显抑制两种细胞MMPs的分泌。因此LN-GPs对癌细胞分泌MMPs的抑制作用可能是其抑制癌细胞的侵袭和转移的分子机制。
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由此可见，LN-GPs的作用是多方位的，既可以通过抑制癌细胞在LN基质上的粘附、铺展、迁移、侵袭及MMPs的分泌而降低癌细胞的侵袭性，又可以抑制癌细胞的增殖，使其阻滞于G1期到S期的演进。通过多环节的作用来抑制癌细胞的转移。但它并不能诱导癌细胞的凋亡。
(本文中明胶酶谱分析实验承蒙中科院动物所徐平同志的大力协助，特此致谢。)■
基金项目：国家自然科学基金(39570801)资助项目。
参考文献
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收稿日期：1999-06-07, 百拇医药